PROCEDIMIENTO NORMADO DE OPERACIONES DEL AREA DE CONTROL

DE CALIDAD DE MICROORGANISMOS

Dilución Seriada para Análisis Código: Ejemplar:

Microbiológicos (Trichoderma
harzianum)

Edición: 01 Fecha: 23-07-2015 Fecha de sustitución: Hoja 1 de 4

1. Objetivo:

Realizar los pasos metodológicos adecuados para disminuir progresivamente la

concentración de una solución inicial dada con células de microorganismos a
evaluar.

2. Frecuencia:

Previa a una evaluación microbiológica, como la determinación de la pureza,

viabilidad y concentración de un lote de producción.

3. Responsabilidades:

Los responsables de ejecutar el procedimiento son: el jefe de control de calidad,

jefes de línea y técnicos autorizados.

4. Equipos, Materiales y reactivos:

 Autoclave
 Rejilla autoclavable porta tubos de ensayos.
 Tubos de ensayo con tapa de 20 ml
 Beaker de 250 ml
 Cilindro graduado de 25 ml
 Pipetas graduadas de 10ml y de 1 ml
 Marcador para rotulado
 Tirro
  Micropipetas
 Balanza de pesado de 30 g
 Agua destilada
 Cestas para autoclave
 Campana de flujo laminar con luz U.V
 Papel kraft, aluminio o bond.
 Tween 80
 Cloruro de Sodio
 Alcohol al 70% para limpieza.
 Gerdex
 Atomizador
 Mechero
 Platillos de pesar
 Viales de 5 ml

5. Medidas de seguridad:

 Usar el equipo de protección adecuado. Bata, tapaboca, guantes, gorros.

 Trabajar con el mesón limpio y desinfectado con alcohol al 70%.
 Encender luz UV antes y después de trabajar por 5 minutos.

6. Procedimiento:

 Agregar a un Beaker de 250 ml, 100 ml de agua destilada, incorporarle

Tween al 0,04% y Cloruro de Sodio al 0, 9 %.
 Distribuir en diez tubos de ensayos de 20 ml, tomando en cuenta llenar dos
tubos con 10 ml, y ocho tubos con 9 ml. Rotular los tubos.
 Preparar pipetas envueltas en papel cada una por separado.
 Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 30 minutos.
 Encender la luz U.V de la campana por 5 minutos.
 Llevar el material autoclavado a la campana.
 Incorporar el microorganismo al tubo rotulado como solución madre de 10
ml, previamente pesado, en balanza en ambiente aséptico. NOTA: En caso
de Trichoderma en arroz, incorporar un gramo, en caso de polvo de
conidios incorporar 0,1 gramos.
 Colocar en agitación la solución madre durante 30 minutos.
 En campana, en condiciones de esterilidad, transferir partiendo de la
solución madre de esporas, un ml para el siguiente tubo, rotulado como
10-2, primera dilución, ó 10-3 según el caso (partiendo de 1 gramo de
producto en arroz o 0,1 gramo de polvo de conidios respectivamente).
 Luego transferir 1 ml al siguiente tubo, realizando de esta manera
diluciones sucesivas de 1 ml, completando 10 ml como volumen final en
cada tubo, para un tubo final rotulado como 10-6.
 Remover suavemente de forma circular cada tubo antes de transferir al otro
evitando agitación.
 Este procedimiento no debe interrumpirse en ninguno de sus pasos.
 Mantener la esterilidad en el proceso de transferencia de los tubos.
PRUEBA DE VIABILIDAD PRODUCTO Código: Ejemplar:
(Trichoderma harzianum)

Edición: 01 Fecha: 23-07-2015 Fecha de sustitución: Hoja 1 de 2

1. Objetivo:

Determinar el porcentaje de células vivas del producto, para obtener un valor ≥

80% de viables.

2. Frecuencia y momento del muestreo:

Se realizan dos momentos de muestreo por cada lote, uno al biopreparado y otro
previa a la formulación, una vez realizada la separación de esporas.

3. Responsabilidades:

Los responsables de ejecutar el procedimiento son: el jefe de control de calidad,

jefes de línea y técnicos autorizados.

4. Equipos, Materiales y reactivos:

 Autoclave
 Campana de flujo laminar con luz U.V
 Incubadora
 Microscopio Óptico
 Pipetas de un ml
 Cajas petri de vidrio de 90 mm
 Papel filtro, o bond.
 Portaobjetos de microscopio
 Agua destilada
 PDA
 Contador de colonias.

5. Medidas de seguridad:

 Usar el equipo de protección adecuado. Bata, tapaboca, guantes, gorros.

 Trabajar con el mesón limpio y desinfectado con alcohol al 70%.
 Encender luz UV antes y después de trabajar por 15 minutos.
6. Procedimiento:

 Encender la luz U.V de la campana.

 Realizar una dilución seriada.
 Colocar 1-2 ml de medio PDA sobre un portaobjeto estéril.
 Preparar una cámara húmeda con una placa petri de vidrio, papel filtro, y 2 -
3 ml de agua destilada, y dos portaobjetos, todo estéril.
 Colocar 500 µl de la solución con células del microorganismo a evaluar,
correspondiente a la dilución 10 -5 sobre el portaobjetos estéril cubiertos con
una capa de medio de cultivo PDA.
 Se realizaran 3 repeticiones por cada cepa o lote a evaluar.
 Rotular la placa indicando la hora y la fecha de siembra sobre el
portaobjetos.
 Se incubaran a 28° C.
 Se observará la germinación de los conidios en el microscopio a 40x, a las
18 horas.
 Se contará por cada portaobjeto 100 conidios germinados o no, expresando
el resultado en porcentaje de conidios germinados o viables.
 Este procedimiento no debe interrumpirse en ninguno de sus pasos.
 Mantener la esterilidad en el proceso de transferencia de los tubos.
 Llevar registro en los cuadernos de control de calidad.
DETERMINACION DE LA Código: Ejemplar:
CONCENTRACIÓN DEL PRODUCTO
(Trichoderma harzianum)

Edición: 01 Fecha: 23-07-2015 Fecha de sustitución: Hoja 1 de 2

1. Objetivo:

Determinar la cantidad de ingrediente activo, expresado en conidios por gramos

de producto formulado.

En el caso del producto formulado en arroz la concentración del producto final

debe ser mayor ó igual a 1 x 109

2. Frecuencia y momento del muestreo:

Se realizan dos momentos de muestreo por cada lote, uno al biopreparado y otro
previa a la formulación, una vez realizada la separación de esporas.

3. Responsabilidades:

Los responsables de ejecutar el procedimiento son: el jefe de control de calidad,

jefes de línea y técnicos autorizados.

4. Equipos, Materiales y reactivos:

 Microscopio Óptico
 Cámara de Neubauer
 Pipetas de 1 ml
 Toallin
 Rejilla portatubo

5. Medidas de seguridad:

 Usar el equipo de protección adecuado. Bata, tapaboca, guantes, gorros.

 Trabajar con el mesón limpio y desinfectado con alcohol al 70%.
 Encender luz UV antes y después de trabajar por 15 min.

6. Procedimiento:

 Encender la luz U.V de la campana por 15 minutos.

 Realizar una dilución seriada según procedimiento establecido.
 Se determinará la concentración por conteo directo de conidios en la
cámara de Neubauer.
 A partir de la dilución seriada se tomaran 10µl de la concentración 10-3 para
una cámara de Neubauer,
 Se observara en el microscopio y se realizará el conteo de conidios en los
cuadrantes I, II III, IV, V (extremos y central) se tomara el número de
conidios totales.
 El total debe estar entre 30 y 300 conidias contadas (Normalmente la
dilución 10-3), de no ser asi tomar en cuenta otra dilución dependiendo si el
resultado es por defecto o exceso , para lo cual se manejaría 10-2 o 10-4
respectivamente.
 Se aplicara la fórmula:

Nro de células/ g: Nro de células contadas × factor de corrección de la cámara× factor de dilución inversa

 Este procedimiento no debe interrumpirse en ninguno de sus pasos y

realizarlo al cumplir el final proceso productivo.
 Mantener la esterilidad en el proceso de transferencia de los tubos.
 Llevar registro en los cuadernos de control de calidad.
DETERMINACION DE LA PUREZA DEL Código: Ejemplar:
PRODUCTO (Trichoderma harzianum)

Edición: 01 Fecha: 23-07-2015 Fecha de sustitución: Hoja 1 de 2

1. Objetivo:

Reconocer y cuantificar contaminantes del proceso productivo presentes en el

producto.

El valor de pureza debe ser mayor ó igual al 95%.

2. Frecuencia y momento del muestreo:

Se realizan dos momentos de muestreo por cada lote, uno al biopreparado y otro
previa a la formulación, una vez realizada la separación de esporas.

3. Responsabilidades:

Los responsables de ejecutar el procedimiento son: el jefe de control de calidad,

jefes de línea y técnicos autorizados.

4. Equipos, Materiales y reactivos:

 Placas de Petri estériles de 90 mm

 Incubadora
 Micropipetas y puntas estériles.
 Contador de Colonia
 PDA
 Agar nutriente en caso de reconocimiento de bacterias persistentes.
 Marcador rotulador.
 Campana de flujo laminar.
 Mechero.

5. Medidas de seguridad:

 Por tratarse de la determinación de la pureza las condiciones deben ser

estrictas en cuanto a la asepsia.
 Usar el equipo de protección. Bata, tapaboca, guantes, gorros.
 Trabajar con el mesón limpio y desinfectado con alcohol al 70%.
 Encender luz UV antes y después de trabajar por 15 minutos.
6. Procedimiento:

 Encender la luz U.V de la campana por 15 minutos.

 Realizar una dilución seriada según procedimiento establecido.
 Determinar el nivel de contaminantes mediante el conteo en placa de unidades
formadoras de colonias (ufc), de hongos y bacterias.
 Sembrar en cajas de Petri con medio PDA por el método de servido en placa,
dejando caer 100 µl de la dilución, por cada dilución (10-5,10-6), tres repeticiones
cada una.
 Incubar a 28° C
 Evaluar y registrar el número de morfotipos a las 24, 48, 72 y 96 horas. Para cada
dilución.
 Se debe cuantificar el número de unidades formadoras de colonia (ufc)
pertenecientes al microorganismo Trichoderma y los morfotipos diferentes,
posteriormente se realiza la sumatoria de las ufc totales y se procede a aplicar la
siguiente fórmula:

% de pureza : ufc de morfotipos diferentes a Trichoderma x 100

ufc totales

 Este procedimiento no debe interrumpirse en ninguno de sus pasos y

realizarlo al cumplir el final proceso productivo.
 Mantener la esterilidad en el proceso de transferencia de los tubos.
 Llevar registro en los cuadernos de control de calidad.
REFERENCIAS

1. Elósegui, O., Fernández-Larrea, O., Carr, A. (2005).Influencia de la carga

microbiana contaminante inicial del sustrato en la calidad final de
biopreparados de TrichodermaharzianumRifai y Beauveriabassiana
(Balsamo) Vuillemin. Fitosanidad,9 (1) pp. 51-55. Cuba.
2. EPA, Environmental Protection Agency U.S.
(2011).Trichodermaasperellum strain T34. Pesticide Chemical (PC) Code:
119209. Office of Pesticide Programs Biopesticides and Pollution
Prevention Division.Ir a:
http://www.epa.gov/opp00001/chem_search/reg_actions/registration/decisio
n_PC-119209_14-Oct-11.pdf
3. EPA,Environmental Protection Agency. United States. (2012).
Pesticides: Registration Review. “Trichoderma species.Final Registration
Review Decision.Case 6050”. Doc number EPA-HQ-OPP-2006.0245. Final
Draft 2008. Ver:
http://www.epa.gov/oppsrrd1/registration_review/trichoderma/
4. Fernandez-Larrea, O. (2006). Temas interesantes acerca del control
microbiológico de plagas. Publicación INIA-INISAV, Cuba. Impreso en
Mérida, Venezuela.
5. García, R., Riera R., Zambrano C. y Gutiérrez L. (2006). Desarrollo de un
fungicida biológico a base de una cepa del hongo Trichodermaharzianum
proveniente de la región andina Venezolana. Taller Latinoamericano
“Biocontrol de Fitopatógenos con Trichoderma y otros antagonistas”.
FITOSANIDAD vol. 10, no. 2, junio 2006.
6. Instituto Colombiano Agropecuario ICA(2012). Coordinación Registro y
Control de Bioinsumos de Uso Agrícola. Bogotá D.C. Colombia. Ver:
http://www.ica.gov.co/Areas/laboratorios/Lab-Nacional-de-Insumos-
Agricolas.aspx
7. Jenkins, N., y Grzywacz, D. (2003). Towards The Standardization of
Quality Control of Fungal and Viral Biocontrol Agents.Chapter 18. In: Quality
Control and Production of Biological Control Agents: Theory and Testing
Procedures (ed. J.C. van Lenteren), CAB International.
8. Samuels, Lieckf & Nirenberg. (1999) Trichoderma asperellum. Sydowia
51(1): 81