ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL

FACULTAD DE INGENIERIA MECÁNICA Y CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN

INGENIERÍA EN ALIMENTOS

TEMA:
Microscopio Electrónico

INTEGRANTES:
 Silvia Dayana Moreano Guijarro
 Kristhian Luis Iniguez Gomez
 Daniel Alfredo Santos Palomino

PROFESORA: Msc. María Fernanda Morales Romo Leroux

FECHA DE ENTREGA: Lunes, 16 de Junio del 2014.

TÉRMINO I
2014-2015
INTRODUCCIÓN

Históricamente el microscopio fue el primero que permitió revelar los secretos de la estructura
celular y todavía hoy continúa siendo un instrumento muy valioso en biología celular.

La microscopia es la técnica de producir imágenes viables de estructuras o detalles demasiado

pequeños para ser percibidos a simple vista. En la microscopia se evidencian los grandes
aportes que la física ha hecho a la biología y como esta ha ido dando lugar a nuevos cambios
en el desarrollo de otras ciencias.

El estudio detallado de los componentes de células y tejidos animales o vegetales, por el

tamaño que poseen, requiere el uso de instrumentos que permitan ampliar muchas veces más
la imagen de las estructuras que los constituyen.

El instrumento que fue empleado por los primeros biólogos para estudiar la célula y los
tejidos, es el microscopio. El nombre deriva etimológicamente de dos raíces griegas: mikrós,
que significa pequeño y skopéoo, que significa observar. Es decir el microscopio es un
instrumento que sirve para observar objetos o estructuras pequeñas.

Existen dos tipos de microscopios, el de luz (óptico) y el electrónico, según el principio en que
se base la amplificación. Para el examen microscópico de los microorganismos se puede
utilizar el microscopio óptico o el microscopio electrónico.

El desarrollo del microscopio electrónico es uno de los mayores logros de física aplicada del
siglo XX, y ha venido a revolucionar el conocimiento en diversas ramas.

Sin este instrumento no sería posible estudiar la estructura interna de microorganismos como
las bacterias o la forma y tamaño de los virus. Con él se consiguen aumentos de hasta 500.000
diámetros, de manera que permite ver estructuras aun de tamaño molecular, el poder de
resolución es muchísimo mayor al del microscopio óptico.

El microscopio electrónico funciona mediante un principio similar al del microscopio óptico.

Utiliza un flujo de electrones en lugar de un haz de luz. El haz de electrones es enfocado por
lente electromagnéticos y el objeto en estudio se interpone de manera que interactúa con
dicho haz y se proyecta una imagen que se registra en una pantalla sensible a los electrones.
Es decir, la imagen de los objetos no se observa directamente, como en el microscopio de luz,
sino que la imagen se forma en una pantalla. De la imagen se obtienen electromicrografias las
cuales son muy útiles para llevar a cabo estudios especializados sobre los detalles estructurales
del objeto que se está analizando.

Existen varios tipos de microscopia electrónica: microscopía electrónica de transmisión,

microscopía electrónica de barrido, microscopia de fuerza atomica.

Por la naturaleza de este instrumento, solo en objetos extremadamente delgados se pueden

observar detalles estructurales internos. Por lo tanto se requiere de técnicas especializadas
para preparar muestras por observar.

A pesar de las grandes ventajas que ofrece la microscopia electrónica, también tiene sus
limitaciones. Por ejemplo, las células no se pueden estudiar vivas. Además, los procedimientos
de preparación de la muestra pueden alterar algunas de las características de las células.
Debido a esto los resultados de la microscopia electrónica deben ser interpretados solo por los
especialistas en este campo y con ciertas preocupaciones.

Estos tipos de microscopios se utilizan para propósitos especiales o en el desarrollo de trabajos

de investigación. Sin embargo, los estudiantes conocemos de sus aplicaciones porque cada uno
tiene propiedades convenientes para demostrar estructuras morfológicas específicas y porque
además es un instrumento que formará parte en el desarrollo práctico y experimental de
nuestra especialización.

A partir de nuestra investigación se pudo conocer sobre el funcionamiento del microscopio

electrónico, se estudiaron sus componentes mecánicos, sus sistemas ópticos y de iluminación,
su amplificación y poder de resolución y los tipos de microscopios tanto ópticos como
electrónicos que se utilizan en la actualidad. Se pudieron establecer diferencias entre ambos
microscopios y cuáles son sus funciones en el desarrollo de la investigación microbiológica.

Se concluyó que el microscopio es un instrumento utilizado no solo en las áreas de biología y

microbiología sino en todas las ciencias experimentales que han logrado un gran avance
tecnológico en nuestra vida diaria y que gracias a este se podrán seguir dando nuevos cambios
y descubrimientos en todas las áreas científicas.
CUERPO DE LA INVESTIGACIÓN

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

El microscopio electrónico tiene una capacidad máxima de mostrar detalles de la imagen de un

objeto (poder de resolución), cuando entre ellos existe una distancia aproximada de 0.2 de
micrómetro. Este tipo de microscopio es incapaz de ofrecer un poder de resolución mayor
porque existen dos factores limitantes: la longitud de onda de la energía luminosa utilizada y
la apertura numérica (A.N.) de la lente del objetivo.

La única manera de aumentar el poder de resolución de un microscopio era encontrar energía

radiante con longitudes de onda menores a las que posee el espectro radiante visible.

En 1930, el físico De Broglie, basándose en estudios teóricos predijo que los electrones,
emitidos bajo ciertas circunstancias, como en el vacío, por ejemplo, podían desplazarse y
comportarse como ondas de energía. Comprobada esta teoría, entre 1932 y 1934, Knoll y
Ruska, junto con otros científicos desarrollaron un microscopio electrónico, en el que
mediante la aplicación de energía eléctrica de alto voltaje a un electrodo metálico, se emitían
haces de electrones con longitudes de onda que en un principio no lograron sobrepasar el
poder de resolución del microscopio electrónico pero que, en el año de 1938, después de una
serie de innovaciones como el fabricar y adicionarle un condensador que orientaba,
concentraba y aceleraba la marcha del haz de electrones emitidos, les permitió alcanzar
imágenes con un poder de resolución cercano a los 10 nanómetros (100Å). La longitud de onda
de los electrones emitidos por el electrodo metálico (cátodo), depende del voltaje aplicado, es
decir, a mayor voltaje utilizado menor será la longitud de onda del haz de electrones.

Los haces de electrones emitidos por el cátodo se desplazan en todas las direcciones del
espacio, por lo tanto es necesario reorientarlos y acelerar su desplazamiento. Esto se consigue
con un ánodo colocado en las cercanías de la emisión que genera un alto potencial eléctrico
positivo.

Funcionamiento del microscopio electrónico

El funcionamiento del microscopio electrónico se basa en dos características de los electrones:

primera, los electrones presentan propiedades ondulatorias, asociándose la longitud de onda
en forma inversamente proporcional a la velocidad de desplazamiento de estos; segunda, el
rayo de electrones puede ser enfocado pasándolo a través de un campo magnético.
Cuando un haz de electrones en el vacío incide sobre un objeto, las partículas que lo tocan
pueden ser absorbidas, transmitidas o modificadas de distinta manera sus frecuencias.

Permite evidenciar la estructura biológica. La imagen se basa en la dispersión de electrones,

que depende del espesor y densidad molecular del objeto y, sobre todo, del número atómico.
También se producen electrones secundarios y fluorescencia de rayos X. La fuente de
iluminación es un haz de electrones procedentes de un cátodo luminiscente. Las lentes son
campos magnéticos.

Los átomos de las estructuras biológicas tienen bajo número atómico, por lo que dan poca
imagen y, por ello, se les añaden átomos pesados (técnica de bombardeo metálico con Osmio,
Uranio, Oro). También se usa la técnica de coloración negativa (embebiendo el espécimen con
un material denso como el fosfotungstato).

Tiene más poder de resolución que el microscopio óptico. La resolución aumenta con la
velocidad del electrón y con el voltaje, por tanto. Consigue alcanzar hasta los 200.000
aumentos, con un poder de resolución inferior a los 10nm. Hay que tener en cuenta que
cualquier partícula puede detener el paso de electrones, con lo que la observación ha de
realizarse colocando la muestra en un tubo vacío, lo que limita las muestras a analizar. Las
preparaciones deben ser ultrafinas y teñidas con sustancias especiales que dispersen bien los
electrones.

Los microscopios electrónicos se clasifican, de acuerdo con la forma en que son expuestos los
detalles del espécimen, en:

 Microscopia electrónica de transmisión (TEM)

 Microscopia electrónica de barrido, o de exploración electrónica (SEM)

En los dos primero tipos, los electrones libres son disparados a partir de una fuente y actúan
sobre los núcleos atómicos del espécimen, mientras que en los de emisión, el espécimen en si
es la fuente de radiación.

El microscopio electrónico de emisión no es de gran utilidad para estudios biológicos; los que
más se utilizan son el de transmisión y el de rastreo.

Un microscopio óptico ordinario consta de una fuente de luz, un condensador para concentrar
la luz sobre o cerca del objeto, un soporte para el objeto, una lente objetivo para concentrar la
imagen y un ocular para proyectar la imagen formada por el objetivo sobre el ojo, o una
película fotográfica. Todo es válido para el microscopio electrónico, con la diferencia de que la
luz esta reemplazada por un haz de electrones, el soporte del objeto es una tela metálica que
se conoce con el nombre de rejilla y las lentes son electroimanes y no lentes de vidrio.

El microscopio electrónico presenta tres características diferentes del microscopio óptico.

o En primer lugar, como los electrones no pueden recorrer grandes distancias a través
del aire, toda las columna del microscopio debe encontrarse en condiciones de alto
vacío; en consecuencia el objeto siempre debe estar deshidratado y, por lo tanto,
muerto.
o En segundo lugar debido a que la amplificación que resulta de una lente
electromagnética es proporcional al campo magnético, que a su vez es proporcional a
la corriente en las bobinas, la amplificación puede variarse de forma continua variando
la corriente que atraviesa las bobinas de las lentes. En el microscopio la amplificación
viene fijada por la forma de la lente de vidrio; por lo tanto se necesitan muchos
objetivos para cubrir la escala de aumentos.
o En tercer lugar, ninguna de las aberraciones primarias puede ser corregida en las
lentes en las lentes electromagnéticas estándar, porque las lentes magnéticas son
siempre convergentes.

Para reducir la aberración esférica y mejorar así la calidad de la imagen, las lentes se manejan
con aperturas numéricas muy pequeñas.

¿Cómo se logra las amplificaciones en un microscopio electrónico?

La imagen se forma por lo que se denomina con frecuencia como acción sustractiva de la
muestra. Esto es, los átomos del objeto dispersan algunos electrones. La pauta de esta pérdida
de electrones, produce el modelo de la imagen (de forma similar a cómo se reduce la
intensidad de la luz por la absorción del objeto en un microscopio óptico). La lente objetivo,
ajustada de forma que la muestra se encuentre en su punto focal, vuelve a enfocar el haz para
producir una imagen. Esta imagen sufre a continuación un proceso de amplificación, en varias
etapas, que se realiza por medio de tres lentes electromagnéticas, las lentes de difracción,
intermedia y de proyección. La lente de proyección final forma la imagen sobre una pantalla
fluorescente o una placa fotográfica.
 El límite de resolución del microscopio óptico es,
aproximadamente, de unos 200nm, el cual no es
suficiente para observar orgánulos celulares, virus
y macromoléculas de interés actual. Ello es posible
no obstante, mediante el empleo del microscopio
electrónico, cuyo límite de resolución, bajo
condiciones especiales, es menor que el diámetro
de un átomo de uranio (aproximadamente 0.5nm).

Pocos aparatos presentan tan desconcertante

cantidad de botones y contadores como el
microscopio electrónico; además pocas técnicas
requieren una mayor habilidad y atención a los
detalles. Sin embargo, el uso del instrumento es
sencillo en la mayor parte de sus aplicaciones y la
preparación de muestras no es complicada.

Fig. 1.- Relaciones entre los tamaños de diversas muestras y la

resolución del ojo humano, el microscopio óptico y el microscopio
electrónico.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN Y DE BARRIDO

Fig. 2.- Microscopio electrónico de trasmisión y de

barrido.
Microscopio Electrónico de Transmisión (MET)

El microscopio electrónico más sencillo es muy similar al microscopio óptico. Ambos tienen
lentes y condensadores para concentrar la iluminación sobre la muestra. Los rayos de
iluminación atraviesan la muestra y son enfocados por las lentes del objetivo y de proyección
para forma una imagen aumentada sobre una pantalla fluorescente. Sin embargo el
microscopio electrónico es mucho más complejo.

El desarrollo del MET nace de la necesidad de observar los más diminutos detalles de las
estructuras biológicas, lo que se logra por el altísimo poder de resolución que se obtiene con la
longitud de onda del flujo iluminado de electrones.

El microscopio electrónico de transmisión está constituido básicamente por cuatro sistemas

que son:

1. Sistema óptico electrónico

2. Sistema de haz de electrones
3. Sistema de detección y amplificación
4. Sistema de exhibición

Este aparato, al igual que los microscopios ópticos, proporciona una imagen en dos
dimensiones; la alta resolución y magnificación que se obtiene está en función de la utilización
de cortes ultrafinos (50-1000 A de espesor), debido a que la formación de la imagen depende
de los electrones transmitidos.

En fitopatología, el MET se utiliza básicamente para conocer las interacciones entre una planta
y sus patógenos, a nivel de ultraestructura. También, con técnicas especiales, permite el
estudio de partículas de virus, bacterias, etc.

En términos generales, la preparación de muestras para ser observadas en el MET consta de

las siguientes fases:

 Selección adecuada de muestras

 Fijación de las muestras
 Pretinción
 Infiltración
 Inclusión
 Seccionamiento
 Tinción
 Montaje
 Recubrimiento
  Observación

También en este caso los tiempos y concentraciones de todos los compuestos utilizados varían
de acuerdo con la naturaleza del material que se va a observar.

El sistema central del microscopio electrónico incluyendo la pantalla fluorescente y el equipo

fotográfico, lo constituye un tubo hueco. El equipo eléctrico que suministra la corriente
necesaria se halla generalmente situado a una cierta distancia para evitas la interferencia de
los campos magnéticos dispersados. La mayoría de los microscopios están equipados con
dispositivos de seguridad que no permiten conectar el filamento de alto voltaje hasta que no
se ha conseguido de vacío apropiado.

Las lentes magnéticas del microscopio electrónico están formadas por imanes en forma de
herradura. El imán puede ser permanente o de tipo electromagnético.

Componentes del microscopio electrónico de transmisión (TEM)

 Cañón electrónico: El tipo más [usado de cañón electrónico consiste de un filamento

de alambre de tungsteno doblado en forma de V. El electrodo de control se denomina
cilindro de Wehndt, y tiene una apertura circular de 1 a 3 mm de diámetro centrada en
el ápice del filamento. La superficie cóncava hace las funciones de ánodo, y utilizando
una superficie convexa la imagen de la fuente electrónica puede reducirse en tamaño
respecto al electrodo cóncavo. La intensidad total de haz de cátodo a ánodo puede ser
de 10 a 400 microamperios, pero solamente una pequeña fracción die éste llega hasta
la muestra.
 Condensadores: Los idos condensadores son capaces de dar una amplia gama de
intensidad ajustando el cañón electrónico. Esto reduce el área iluminada en la
muestra. Sin embargo, otras partes de la muestra también sufren los efectos del haz
electrónico. El primer condensador reduce la imagen de la fuente mientras que el
segundo condensador obtiene la adecuada intensidad de iluminación.
 Plataforma para la colocación de la muestra: La plataforma para colocar la muestra
está situada en frente del objetivo. Se introduce la muestra en la columna del
microscopio a través de una abertura.
 Objetivo: El objetivo es la lente más importante en el microscopio electrónico. La
distancia focal de esta lente está comprendida entre 1 y 5 milímetros, siendo 1,1 mm
la más frecuente. Cuanto menor es la distancia focal, mayor es la resolución. Debido a
 que el haz de imagen tiene la máxima apertura angular en el primer objetivo, esta
lente controla la calidad de la imagen producida. Se puede corregir la aberración
esférica usando un "stigmator", que es un dispositivo que permite, introducir metal
para compensar la homogeneidad inherente de la lente, y obtener elevada resolución.
Otro accesorio importante, permite regular la apertura del objetivo, la cual limita la
dispersión de los electrones, evitando así la degradación de la imagen. Esta apertura
mejora el contraste siendo 20 y 40 micrómetros (pm) los más frecuentes.
 Lente intermedia: La lente intermedia puede aumentar o disminuir la imagen. Se
puede conseguir esto, aumentando o disminuyendo la potencia de la corriente a esta
lente.
 Lente de proyección: La lente (de proyección corresponde al ocular del microscopio
óptico. Su función es la de proyectar la imagen real sobre la pantalla fluorescente, y
permite una amplia gama de aumentos. Se puede variar la ampliación de 100 X hasta
300.000 X usando lentes intermedias y de proyección.
 Cámara de observación: La cámara de observación y la pantalla fluorescente están
situadas en el fondo de la columna. La imagen se enfoca sobre un punto marcado y el
enfoque fino se consigue con unos binoculares de 6 y 20 X. El diámetro del punto de
enfoque es de 100 ,pm, por 10 tanto la imagen debe ser mayor que [este diámetro
para ser resuelta. La cámara de observación está protegida por un vidrio grueso de
plomo para evitar la emisión de rayos X.
 Cámara fotográfica: La cámara fotográfica está situada debajo de la pantalla
fluorescente. La pantalla fluorescente está sujetada por m lado, y al quitar el paso del
haz electrónico la imagen se centra sobre la película fotográfica. Se pueden usar varios
tipos de películas y placas de vidrio.

Microscopio Electrónico de Barrido (SEM)

La observación de un espécimen en un MER se logra porque el aparato emite una ¨cortina¨

delgada de electrones que lo ¨barren¨ haciendo resaltar con muchas nitidez los detalles de su
superficie. Debido a lo anterior, a este tipo de microscopio electrónico se le llama también
¨barrido¨.

El principio del microscopio electrónico de rastreo consiste, como en el caso de la televisión,

en hacer coincidir punto por punto la superficie del objeto que se está observando con la de la
pantalla fluorescente; las imágenes dadas por los electrones secundarios, los retrodifundidos y
los absorbidos, son recogidas por
captores especiales y proyectadas en la
pantalla fluorescente del aparato.

Se llaman electrones secundarios a los

que son sacados de sus orbitas por el
bombardeo incidente; permiten formar
una imagen completa y no selectiva de
tal o cual objeto, o bien dar una curva
Fig. 3.- Esquema de funcionamiento de un microscopio electrónico de
espectral de análisis. barrido.

La ¨metalización¨ de la superficie de la muestra permite mejorar la emisión de electrones,

porque equilibra las tensiones de polarización superficial y compensa los valores débiles de
masa atómica de algunos componentes del objeto que se está observando; por otra parte, los
componentes de la emisión secundaria hacen variar el contraste de la imagen.

Todo lo anterior da como resultado la formación de una imagen en relieve, análoga a la que se
observa en un microscopio óptico estereoscópico; es decir, el microscopio electrónico de
rastreo proporciona una imagen en tres dimensiones, debido a que los electrones no pasan a
través del objeto, lo que permite observar muestras más gruesas que en el microscopio
electrónico de transmisión (MET); además, la profundidad de campo es mayor que en el de
transmisión, donde es considerablemente afectada por el grosor de la muestra.

La preparación del material biológico para ser observado en el MER consiste básicamente de
los siguientes pasos:

 Fijación
 Postfijación con tetraóxido de osmio
 Deshidratación de una serie graduada de alcohol etílico a 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,
90, 95, y 100%.
 Secado por punto crítico en CO2 líquido
 Metalización con oro, oro-paladio u otros metales preciosos
 Observación al MER para seleccionar los detalles de la muestra
 Fotografiar los detalles que interesan

Los tiempos y concentraciones de las diferentes soluciones que se utilizan dependen de la

naturaleza del material que se desea observar.
Cuando una muestra solo pretende estudiar las estructuras externas de un organismo no son
necesarios los cortes ultrafinos, pudiéndose realizar la observación de las células intactas o de
los componentes celulares de modo directo por MET tras una técnica denominada tinción
negativa. Por otra parte, se puede utilizar el microscopio electrónico de barrido (MEB). La
muestra a estudiar mediante este instrumento primero se recubre con una fina capa de metal
pesado, como el oro. El haz de electrones desviados por la capa de metal son recogidos y
proyectados sobre una pantalla para producir una imagen. En el MEB se pueden observar
muestras de cierto tamaño y la profundidad de campo es excelente. Además, permite obtener
un amplio rango de aumentos, desde 15 hasta 100.000 veces, pero solo se puede ver la
superficie de los objetos. Todos los microscopios electrónicos incorporan cámaras que
permiten fotografiar las muestras. Este tipo de fotografías se denominan micrografías
electrónicas.

Los componentes principales del microscopio de barrido SEM son los siguientes:

 Puente de energía: La fuente de energía del microscopio electrónico de barrido

depende de varios factores, siendo los más importantes el voltaje de aceleración, la
intensidad de la corriente y al diámetro de haz. Para usos prácticos debe asegurarse
una alta estabilidad de la corriente.
 Porta muestras: La muestra montada sobre un soporte puede moverse en tres
direcciones, ser calentada, enfriada, estirada, etc. dentro del instrumento. Para de
estudio de ciertos tipos de muestras tales como, metales, minerales, semiconductores,
se requiere calefacción de la muestra. La calefacción puede conseguirse por medio de
un hilo incandescente o calentando la muestra en un crisol aplicando directamente a la
muestra una corriente eléctrica.

Características de SEM

Las características más importantes de SEM son: poder de resolución, profundidad del campo
y contraste.

Poder de resolución

El poder de resolución en el microscopio electrónico de barrido (SEM) depende de varios

factores, tales como la dimensión del haz de electrones, la difusión del mismo en la muestra
antes de la misión de los electrones secundarios, y la corriente estabilizada de la lente. La
dimensión del haz puede reducirse de muchas formas. Se pueden ampliar filamentos
apuntados o usando elevado potencial de Kv. Por ejemplo a potencia de 1 Kv, la resolución es
140 núm., mientras que a 30 Kv, la resolución les 20 nm (200 A).

Se puede prevenir la difusión del haz de electrones en la muestra, aumentando la potencia de

la corriente. Finalmente, la alimentación de corriente debe ser muy estable, del orden de 1
parte en 100.000, para conseguir alta resolución.

Sistema de amplificación del microscopio de barrido

El sistema de amplificación recoge señales y procesa la información procedente de la muestra,

al mismo tiempo que el haz de electrones barre la muestra.

El generador de barrido está conectado al tubo de rayos catódicos para que el haz de
electrones en este tubo sea barrido en la misma forma que el haz principal. Sin embargo la
potencia de la corriente suministrada a la columna principal para de barrido puede ser
atenuada mientras que el tubo de la pantalla es barrido sobre una área constante. Como
consecuencia de ello, cualquier reducción en el área de muestra barrida da lugar a un aumento
de la imagen. Este aumento viene determinado por la relación del área de la pantalla del tubo
respecto al área de la muestra barrida.

Aplicaciones Microscopia electrónica de barrido

Se utiliza en todas las ramas de la ciencia que tienen por estudio la morfología de la muestra,
siempre que sean resistentes a un alto vacío.

 Estudio de poblaciones celulares del sistema inmunitario y sanguíneo. Se tipifican

nuevos patrones morfológicos de superficie que definen distintos casos de leucemia.
 Aplicación a los procesos de biomineralización, tejidos duros, pues no es necesaria la
descalcificación.
 Aplicación para el estudio microvascular de diferentes órganos y sistemas.
 Puede incorporar sistemas de detección de energía dispersa de rayos X y electrones
retrodispersos que se combinan con técnicas complementarias para hacer posible la
determinación de diferentes elementos químicos y su distribución.
 Permite visualizar estructuras artificiales teñidas con elementos de elevado número
atómico, lo que permite localizar las actividades de las enzimas y el análisis de
 antígenos y receptores de superficie celular mediante técnicas inmunocitoquímicas y
de oro coloidal.

TIPOS DE MICROSCOPIOS OPTICOS

Fig.4.- Microscopio Óptico (MO) de campo claro, de campo oscuro y de contraste de fase.

Microscopio Simple

Es aquel que solo utiliza un lente de aumento al contrario del Microscopio óptico estándar,
que posee varias lentes de aumento. Es el microscopio más básico. El ejemplo más clásico es la
lupa.

El microscopio óptico estándar utiliza dos sistemas de lentes alineados. El objeto por observar
se coloca entre el foco y la superficie de la lente, lo que determina la formación de una imagen
virtual, derecha y mayor cuanto mayor sea el poder dióptrico del lente y cuanto más alejado
esté el punto próximo de la visión nítida del sujeto.

El microscopio simple aventaja al microscopio compuesto solo en la luminosidad, pues ésta es

más amplia y por ello se notan menos los inconvenientes de la esfericidad y cromaticidad de
que adolecen los microscopios compuestos cuando no están equipados con lentes de superior
calidad.
El holandés Anton van Leeuwenhoek construyó microscopios muy eficaces basados en una
sola lente. Esos microscopios no padecían las aberraciones que limitaban tanto la eficacia de
los primeros microscopios compuestos, como los empleados por Robert Hooke, y producían
una ampliación de hasta 300 veces; gracias a ellos Leeuwenhoek fue capaz incluso de describir
por primera vez las Bacterias.

Microscopio de campo oscuro

Se denomina así porque la imagen que se forma está constituida por una serie de estructuras
brillantes sobre un fondo oscuro.

El microscopio de campo oscuro se utiliza para examinar microorganimos vivos que no son
visibles con el microscopio óptico común, que no pueden teñirse con los métodos estándares o
que resultan tan distorsionados por la tinción que sus características no pueden identificarse.
En lugar del condensador normal el microscopio de campo oscuro tiene un condensador
especial que incluye un disco opaco. El disco bloquea la luz que llegaría directamente al
objetivo, en el que solo ingresa la luz reflejada por la muestra. Como no hay una luz de fondo
negro, es decir el campo oscuro.

El principio óptico de este microscopio es el de aprovechar un conjunto de rayos luminosos

oblicuos que inicialmente no entran a la lente frontal del objetivo, observándose el campo
microscopio totalmente oscuro. Para que esto ocurra se requiere en primer lugar que la
apertura numérica del condensador sea mayor que la apertura numérica del objetivo. Esta
condición facilita que los rayos luminosos directos provenientes de la fuente luminosa sean
impedidos de entrar a la porción central de la lente del condensador y solo penetren y emerjan
de él, los rayos periféricos que al refractarse se hacen oblicuos.

Cuando estos rayos oblicuos encuentran en su recorrido, alguna partícula, son desviados hacia
la lente frontal del objetivo y la imagen de la partícula se observa brillante en medio de un
fondo oscuro.

El microscopio de campo oscuro se emplea para ver células vivas (protozoarios, bacterias,
células descamadas, etc.) en las cuales no se han aplicado sustancias fijadoras ni colorantes.
También se observan partículas de un tamaño inferior a los 0.2 de micrómetro; esto se debe a
que los rayos de luz oblicuos que inciden en ellas forman un halo luminoso brillante alrededor
de las mismas. Mediante el empleo de este microscopio se distinguen con facilidad la forma y
el movimiento helicoidal que muestra la espiroqueta Treponema pallidum, una bacteria
causante de la sífilis.

Microscopia de Contraste de Fase

Los microorganismos también pueden observarse con un microscopio de contraste de fase,

que es especialmente útil porque permite la observación detallada de estructuras internas en
los microorganismos vivos. Además, no es necesario fijar ni teñir la muestra, procedimientos
que podrían distorsionar o destruir a los microorganismos.

El principio de la microscopia de contraste de fase se basa en la naturaleza ondulatoria de los

rayos de luz y en el hecho de esos rayos pueden estar en fase o fuera de fase. Si el pico de la
onda de los rayos de luz de una fuente coincide con el pico de la onda de los rayos de luz de
otra fuente, los rayos interactúan para producir un reforzamiento. En cambio, si el pico de la
onda de una fuente de luz coincide con la depresión de la onda de otra fuente de luz, los rayos
interactúan para producir interferencia. En un microscopio de contraste de fase un conjunto
de rayos luminosos proviene directamente de la fuente de luz. El otro conjunto proviene de la
luz que se refleja o difracta por una estructura particular de la muestra. Cuando los dos
conjuntos de rayos de luz- rayos directos y rayos reflejados o difractados- se unen forman una
imagen de la muestra en el ocular, que contiene áreas que van desde relativamente luminosas
a matices de gris hasta el negro. En la microscopia de contraste de fase las estructuras internas
de una célula se definen con mayor claridad.

Microscopio de Fluorescencia o de Radiación Ultravioleta

El microscopio de fluorescencia aprovecha las ventajas de la fluorescencia, es decir la

capacidad de ciertas sustancias de absorber luz de longitudes de onda corta (ultravioleta) y
emitir una luz de una longitud de onda mayor (visible). Algunos organismos fluorescen
naturalmente bajo la luz ultravioleta; si la muestra que se debe examinar no fluoresce de
modo natural, se la tiñe con alguno de los colorantes fluorescentes denominados
fluorocromos. Cuando los microorganismos teñidos con un fluorocromo se examinan
mediante un microscopio de fluorescencia con una fuente de luz ultravioleta o cercana a ella
aparecen como objetos luminiscentes y brillantes contra un fondo oscuro.

El uso principal de la microscopia de fluorescencia es una técnica diagnóstica denominada

inmunofluorescencia (IF) o técnica con anticuerpos fluorescentes. Los anticuerpos son
moléculas de defensa naturales que producen los seres humanos y varias especies de animales
en respuesta a una sustancia extraña o antígeno. Los anticuerpos fluorescentes contra un
antígeno particular se obtienen del siguiente modo: se le inyecta a un animal un antígeno
específico, como por ejemplo una bacteria, y el animal comienza a producir anticuerpos
específicos contra ese antígeno. Despues de un tiempo suficiente se extraen los anticuerpos
del suero del animal. A continuación se combinan químicamente el fluorocromo con los
anticuerpos. Estos anticuerpos fluorescentes se agregan luego a un portaobjetos que contiene
una bacteria desconocida. Si esa bacteria desconocida es la misma que se le inyecto al animal,
los anticuerpos fluorescentes se unen a los antígenos presentes en la superficie de la bacteria y
determina que esta parezca fluorescente.

Requerimientos para el microscopio de fluorescencia

 Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en el
espectro específico de cada fluorocromos. Hay que tomar en cuenta que la
fluorescencia es pasajera y la iluminación produce un efecto de fotoblanqueo en el
fluorocromo; además, las células vivas pueden ser dañadas por la intensa radiación. La
luz debe ser de una longitud de onda corta. Se emplean lámparas de mercurio a alta
presión que funcionan de un modo diferente a las lámparas de filamentos
incandescentes. También se utiliza luz ultravioleta y rayos laser. Muchos modelos
funcionan con epi-iluminación.
 Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda, la
del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no
deseadas. Una vez filtrada, la luz incide sobre el espécimen por reflexión de un espejo
dicroico (epi-iluminación) y es nuevamente filtrada para poder ser observada.
 Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen de
alta calidad. De igual manera deben poseer una gran apertura numérica.

La microscopía de fluorescencia ha permitido avanzar de manera sorprendente en la

investigación de procesos fisiológicos celulares que mediante otros procedimientos no hubiera
sido posible realizar. La fluorescencia permite demostrar, por la radiación luminosa que
emiten, partículas sumamente pequeñas que con otros tipos de microscopios fotónicos no son
fáciles de visualizar. En este tipo de procedimiento es indispensable obtener el registro
fotográfico de las imágenes obtenidas.
Esta técnica, que permite detectar bacterias u otros microorganismos patógenos, incluso
dentro de células, tejidos u otras muestras clínicas, posee una importancia extraordinaria
porque con ella se puede identificar un microbio en el término de minutos. La
inmunofluorescencia es especialmente útil en el diagnóstico de la sífilis y de la rabia.

Tabla 1.- Resumen de los diversos tipos de Microscopios

RESUMEN DE LOS DIVERSOS TIPOS DE MICROSCOPIOS

Tipo de Características Imagen típica Usos principales
microscopio distintivas

Óptico (MO)
Utiliza luz visible como Para observar
fuente de iluminación; diversas muestras
no puede resolver teñidas y contar
De campo estructuras con un microbios, no
claro tamaño menor de resuelve elementos
0,2um; la muestra pequeños como los
aparece contra un fondo virus.
claro. Su uso es
económico y sencillo.
Para examinar
Utiliza un condensador microorganismos
especial con un disco vivos que son
opaco que bloquea la invisibles en la
De campo luz que llega microscopia de
oscuro directamente al objetivo; campo claro, no se
solo ingresa en el tiñen con facilidad o
objetivo la luz reflejada se distorsionan con la
por la muestra y la tinción; se utiliza con
muestra aparece frecuencia para
iluminada contra un detectar Treponema
fondo negro. pallidum de la sífilis.
Utiliza un condensador
que contiene un
diafragma anular. El
diafragma permite que la
luz directa del Para facilitar la
De contraste condensador pase, se observación de las
de fase enfoque la luz sobre la estructuras internas
muestra y en una placa de muestra viables.
de difracción en la lente
objetivo. Los rayos de luz
directos y reflejados o
difractados se unen para
formar la imagen.
 Como el contraste de
fase, emplea las Para proporcionar
diferencias en los índices imágenes
De contraste de refracción para tridimensionales.
por producir la imagen.
interferencia Utiliza dos haces de luz
diferencial separados por prismas;
la muestra aparece
coloreada como
resultado del efecto
prisma.
Utiliza una fuente de luz En técnicas con
ultravioleta o cercana a anticuerpos
la ultravioleta que fluorescentes para
De determina que los detectar con rapidez
fluorescencia microbios que emiten luz e identificar
en una muestra microbios en
aparezcan como muestras de tejidos o
fluorescentes. clínicas.
Para obtener
imágenes
Utiliza luz por láser para bidimensionales y
Confocal iluminar un plano de la tridimensionales de
muestra por vez. células para
aplicaciones
biomédicas.

Para examinar células

Utiliza una onda sonora vivas adherida a otra
Acústico de de frecuencia específica superficie, como
barrido que atraviesa la muestra células cancerosas,
(MAB) con una porción que se placa arterial y
refleja cuando la golpea. películas biológicas
dentro del material.

Electrónico
Utiliza un haz de
electrones en lugar de
luz; los electrones Para examinar virus o
De atraviesan la muestra; la ultraestructura
transmisión dada la longitud de onda interna en cortes
(MET) más pequeña de los delgados de células.
electrones, pueden
resolverse estructuras
menores de 0,2 um.
 Utiliza un haz de
electrones en lugar de
luz, los electrones se Para estudiar las
De barrido reflejan desde la características de la
(MEB) muestra; dada la superficie de células
longitud de onda más y virus.
pequeña de los
electrones, pueden
resolverse estructuras
menores de 0,2 um.

De sonda de barrido
Utiliza una sonda
delgada de metal que
recorre una muestra y
produce una imagen que Proporciona
revela las protuberancias imágenes muy
Por efecto y las depresiones de los detalladas de
túnel (MBT) átomos sobre la moléculas dentro de
superficie de la muestra. las células.
El poder de resolución es
mucho mayor que el de
un microscopio
electrónico.
Utiliza una sonda de Proporciona
metal y diamante que se imágenes de
aplica con una fuerza procesos moleculares
De fuerza suave a lo largo de la y moléculas
atómica superficie de una biológicas en detalle
muestra. Proporciona casi atómico.
una imagen
tridimensional.

TÉCNICAS DE TINCIÓN

La investigación de procesos fisiológicos celulares que mediante otros procedimientos no

hubiera sido posible realizar. La fluorescencia permite demostrar, por la radiación luminosa
que emiten, partículas sumamente pequeñas que con otros tipos de microscopios fotónicos no
son fáciles de visualizar

La mayoría de las observaciones iniciales de los microorganismos se realizan con preparados

teñidos. El término tinción significa simplemente colorear los microorganismos con un
colorante que destaque ciertas estructuras. Sin embargo antes de teñir los microorganismos,
se los debe fijar (adherir) al portaobjetos. El proceso de fijación produce la muerte simultánea
de los microorganismos y su adherencia al portaobjetos. También preserva diversas partes de
los microbios en su estado natural con una distorsión mínima.
Cuando se debe fijar una muestra se extiende una película delgada del material que contiene
los microorganismos sobre la superficie del portaobjetos. Esta película, denominada
extendido, se deja secar al aire. A continuación en la mayor parte de los procedimientos de
tinción el portaobjetos se fija pasándolo varias veces a través de la llama de un mechero
Bunsen con el lado del extendido hacia arriba o cubriéndolo con alcohol metílico durante 1
minuto. Se aplica el colorante se lo lava con agua y se lo seca con papel absorbente. Si no se
realiza la fijación el colorante podría arrastrar los microorganismos al portaobjetos. Una vez
efectuado el procedimiento descrito, los microorganismos están listos para la observación
microscópica.

Los colorantes son sales compuestas por un ión positivo y un ión negativo, uno de los cuales
están coloreados y se conoce como cromóforo. El color de los denominados colorantes básico
está en el ión positivo; en los colorantes ácidos, está en el ión negativo. En un pH de 7
bacterias presentan una carga levemente negativa. Por lo tanto, el ión positivo coloreado en
un colorante básico es atraído hacia la célula bacteriana con carga negativa. Los colorantes
básicos, entre los que se encuentran el violeta de genciana, el azul de metileno, el verde de
malaquita y la safranina, se utilizan con más frecuencia que los colorantes ácidos. Estos últimos
no son atraídos por la mayor parte de los tipos de bacterias porque la superficie bacteriana
con carga negativa repele los iones negativos del colorante, de modo que este tiñe el fondo en
lugar de la estructura bacteriana. Los preparados bacterianos incoloros, contra un fondo
coloreado se denominan tinción negativa, una técnica valiosa para la observación de las
formas generales, los tamaños y las cápsulas celulares porque las células resultan muy visibles
contra un fondo oscuro que contrasta.

Las distorsiones del tamaño y la forma de las células se disminuyen al mínimo porque no se
requiere fijación y las células no captan el colorante. Son ejemplos de colorantes ácidos la
eosina, la fucsina ácida y la nigrosina.

Para aplicar los colorantes ácidos o básicos los microbiólogos emplean tres clases de técnicas
de tinción: simple, diferencial y especial.

TINCIONES SIMPLES

Una tinción simple es una solución acuosa o alcohólica de un colorante básico único. Aunque
los diferentes colorantes se unen de forma específica a las distintas partes de las células, el
propósito principal de una tinción simple es destacar el microorganismo completo para que se
vean las formas y las estructuras celulares básicas. El colorante se aplica al extendido fijado
durante un tiempo determinado y luego se lava; a continuación el portaobjetos se seca y se
examina. En ocasiones se agrega una sustancia química a la solución para intensificar la
coloración; este aditivo se denomina mordiente. Una de las funciones de un mordiente es
aumentar la afinidad de una muestra biológica por un colorante; otra es cubrir una estructura
(como un flagelo) para darle mayor espesor y facilitar las observaciones después del teñido.
Algunas de las tinciones simples utilizadas con frecuencia en el laboratorio son el azul de
metileno, la carbolfucsina, el violeta de genciana (cristal violeta) y la safranina.

TINCIONES DIFERENCIALES

A diferencia de las tinciones simples, las tinciones diferenciales reaccionan de modo diferente
con las distintas clases de bacterias y por lo tanto pueden ser empleadas para establecer una
distinción entre ellas. Las tinciones diferenciales utilizadas con más frecuencia para las
bacterias son la tinción de GRAM y la tinción de ácido-alcohol resistencia.

TINCIÓN DE GRAM

La tinción de GRAM fue desarrollada por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1884 y
es uno de los procedimientos de tinción más útiles porque permite clasificar las bacterias en
dos grandes grupos: grampositivas y gramnegativos.

Fig. 5.- Técnica de Tinción GRAM.

1. Un extendido fijado con color se cubre con un colorante violeta básico, por lo general
violeta de genciana. Como el colorante violeta imparte su color a todas las células, se
lo denomina colorante primario.
2. Después de un breve lapso, se escurre el colorante violeta, se lava el extendido y se lo
cubre con yodo, un mordiente. Cuando se lava el yodo, tanto las bacterias
grampositivas como las gramnegativas aparecen de color violeta oscuro o púrpura.
 3. A continuación se lava el portaobjetos con alcohol o con una solución de alcohol-
acetona. Esta solución es un agente descolorante que elimina el color violeta de las
células de algunas especies pero no de otras.
4. Se elimina el alcohol con agua y se tiñe el portaobjetos con safranina, un colorante
básico. Luego se vuelve a lavar el extendido, se lo seca con papel absorbente y se lo
examina con el microscopio.

El colorante violeta y el yodo se combinan en el citoplasma de cada bacteria y lo colorean de

violeta oscuro o púrpura. Las bacterias que conservan este color después de haberles agregado
el alcohol para descolorarlas se clasifican como grampositivas; las bacterias que pierden el
color violeta oscuro después de la decoloración se clasifican como gramnegativas.

Como las bacterias gramnegativas son incoloras después del lavado con alcohol, dejan de ser
visibles. Por ese motivo se les aplica el colorante básico safranina, que las convierte en
rosadas. Los colorantes como la safranina que tienen un color que contrasta con el colorante
primario se denominan colorantes de contraste. Dado que las bacterias grampositivas
conservan el colorante violeta original, no son afectadas por el colorante de contraste
safranina.

Las diferentes clases de bacterias reaccionan de

modo distinto frente a la tinción de Gram porque las
diferencias estructurales en sus paredes determinan
la retención o el escape de una combinación de
violeta de genciana y de yodo, denominada complejo
violeta-yodo (CV-I).

Fig. 6.- Imagen de bacteria grampositiva.

Entre otras diferencias las bacterias grampositivas tienen un peptidoglucano (disacáridos y

aminoácidos) en su pared celular más grueso que las bacterias gramnegativas. Además, las
bacterias gramnegativas contienen una capa de lipopolisacárido (lípidos y polisacáridos) como
parte de su pared celular. Cuando se los aplica tanto a células grampositivas como a células
gramnegativas el violeta de genciana y luego el yodo ingresa con facilidad en las células, en
cuyo interior se combinan para formar CV-I. Este complejo es más grande que la molécula de
violeta de genciana que ingresó en las células y por su tamaño, no puede ser eliminado por el
agregado de alcohol de la capa de peptidoglucano intacta de las células grampositivas. Estas
retienen el color del colorante violeta de genciana. En cambio en las células gramnegativas el
alcohol altera la capa externa del lipopolisacárido y el complejo CV-I se elimina de la capa
delgada de peptidoglucano. Como consecuencia, las células gramnegativas son incoloras hasta
que se agrega el colorante de contraste safranina, después de lo cual aparecen de color
rosado.

En síntesis, las células grampositivas retienen el colorante y permanecen de color violeta. Las
células gramnegativas no retienen el colorante; son incoloras hasta que se las tiñe con un
colorante de contraste rojo.

TINCIÓN DE ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENCIA

Otra tinción diferencial importante es la tinción de

ácido alcohol resistencia, que se fija de modo firme
solo a las bacterias que poseen ceras en las paredes de
sus células. Los microbiólogos utilizan esta tinción para
identificar todas las bacterias del género
Mycobacterium. Esta tinción se utiliza para identificar
las cepas del género Nocardia.
Fig. 7.- Bacterias ácido-alcohol
resistentes.
En este procedimiento de tinción se aplica el colorante rojo carbolfucsina a un extendido fijado
y se caliente suavemente el portaobjetos durante varios minutos. Luego se enfría el
portaobjetos y se lo lava con agua. A continuación el extendido se trata con ácido alcohol, un
decolorante que elimina el color rojo de las bacterias que no son ácido alcohol resistentes. Los
microorganismos ácido alcohol resistentes, retienen el color rojo porque la carbolfucsina es
más soluble en los lípidos de la pared celular que en los ácido alcohol resistentes, en las
bacterias que no son ácido alcohol resistentes las paredes carecen de componentes lipídicos y
la carbolfucsina se elimina con facilidad durante la decoloración, lo que deja a las cédulas
incoloras. Luego el extendido se colorea con azul de metileno, que actúa como colorante de
contraste. Las bacterias que no son ácido alcohol resistente aparecen azules después de la
aplicación del colorante de contraste.

TINCIONES ESPECIALES

Las tinciones especiales se utilizan para colorear y aislar partes específicas de microorganismos
como endosporas y flagelos, y para detectar la presencia de cápsulas.
 Fig.8.- Tinción Negativa.

TINCIÓN PARA ENDOSPORAS (ESPORAS)

Una endospora es una estructura especial, resistente

y latente que se forma dentro de una célula y que
protege a una bacteria de las condiciones
ambientales adversas. Aunque las endosporas son
relativamente inusuales en las células bacterianas,
pueden ser formadas por algunas bacterias.
Fig. 9.- Tinción de endosporas.

Las endosporas no se tiñen con los métodos comunes como la tinción simple y la tinción de
Gram, porque estos colorantes no atraviesan sus paredes. La más utilizada para este fin es la
tinción de Schaeffer-Fulton para endosporas. Se aplica el colorante primario verde de
malaquita a un extendido fijado con calor y se lo calienta hasta la emisión de vapores durante
alrededor de 5 minutos. El calor ayuda a que el colorante atraviese la pared de la endospora.
Luego se lava el preparado con agua durante cerca de 30 segundos para eliminar el verde de
malaquita de todas las parte de la célula excepto las endosporas. A continuación se aplica el
extendido safranina, un colorante de contraste, para teñir las porciones de las células distintas
de las endosporas. En un extendido preparado de modo adecuado aparecen verdes dentro de
células rojas o rosadas.

TINCIÓN PARA FLAGELOS

Los flagelos bacterianos son estructuras de locomoción

demasiadas pequeñas para ser vistas con un
microscopio óptico sin tinción. Hay un procedimiento
tedioso y delicado que se basa en el empleo de un
mordiente y el colorante carbolfucsina para aumentar
el diámetro de los flagelos hasta que se tornen visibles
Fig. 10.- Tinción de flagelos.
con el microscopio óptico.
Tabla 2.- Resumen de diversas tinciones y usos

RESUMEN DE DIVERSAS TINCIONES Y SUS USOS

Tinción Usos principales
Simple (azul de metileno, Utilizado para destacar microorganismos a fin de determinar
carbolfucsina, violeta de las formas y las disposiciones celulares. Las células se tiñen
genciana, safranina) con una solución acuosa o alcohólica de un colorante básico
solo.
Diferencial
Gram Utilizada para distinguir entre clases diferentes de bacterias.
Clasifica las bacterias en dos grandes grupos: grampositivas y
gramnegativas. Las bacterias grampositivas retienen el color
del colorante violeta de genciana aparecen violáceas. Las
bacterias gramnegativas no retienen el colorante violeta y
permanecen incoloras hasta que se aplica la safranina como
colorante de contraste y entonces se tornan rosáceas.
Coloración de ácido-alcohol Utilizada para distinguir especies de Mycobacterium y algunas
resistencia especies de Norcadia, las bacetrias acido-alcohol resistentes,
una vez teñidas con carbolfucsina y tratadas con ácido-
alcohol, retienen el colorante y aparecen de color rojo. Las
bacterias que no son acido-alcohol resistentes, cuando se las
tiñe y se las trata de la misma manera y después se las tiñe
con azul de metileno, aparecen de color azul porque pierden
el colorante carbolfucsina y entonces puede aceptar el
colorante azul de metileno.
Especial Utilizada para colorear y aislar varias estructuras, como
capsulas, endosporas y flagelos; a veces se la utiliza como
herramienta diagnostica.
Negativa Utilizada para demostrar la presencia de capsulas. Como estas
no aceptan la mayoría de los colorantes aparecen como halos
no teñidos alrededor de las células bacterianas y se destacan
contra un fondo que contrasta.
Endosporas Utilizada para detectar la presencia de endosporas en las
bacterias. Cuando se aplica verde de malaquita sobre un
extendido de células bacterianas fijadas con color, el
colorante penetra en el interior de las endosporas y las tiñe
de verde. Cuando a continuación se aplica safranina, tiñe el
resto de las células de rojo o rosado.
Flagelos Utilizada para demostrar la presencia de flagelos. Se usa un
mordiente para aumentar los diámetros de los flagelos hasta
que puedan visualizarse por microscopia cuando se tiñan con
carbolfucsina.
Conclusiones

 El microscopio fue el primer instrumento que permitió revelar los secretos de la

estructura celular y aun en nuestros días continúa siendo un instrumento muy valioso
en biología celular y en muchas ramas de estudio científico que han dado paso a un
exitoso avance en la tecnología y al descubrimiento de muchas experiencias nuevas
para el ser humano.
 El microscopio se ha convertido en una base fundamental para las ciencias
experimentales debido a que estas necesitan el uso de instrumentos que permitan
ampliar muchas veces más la imagen de las estructuras que los constituyen, por
ejemplo en biología se lo utiliza para el estudio detallado de los componentes de
células y tejidos animales o vegetales y por el tamaño que poseen, el microscopio es el
instrumento capaz de llevar a cabo esta tarea debido a su poder de amplificación y
resolución.
 Tiene más poder de resolución que el microscopio óptico. La resolución aumenta con
la velocidad del electrón y con el voltaje, por tanto. Consigue alcanzar hasta los
200.000 aumentos, con un poder de resolución inferior a los 10nm.
 El funcionamiento del microscopio electrónico se basa en dos características de los
electrones: primera, los electrones presentan propiedades ondulatorias, asociándose
la longitud de onda en forma inversamente proporcional a la velocidad de
desplazamiento de estos; segunda, el rayo de electrones puede ser enfocado
pasándolo a través de un campo magnético.
 La imagen en el microscopio electrónico se basa en la dispersión de electrones, que
depende del espesor y densidad molecular del objeto y, sobre todo, del número
atómico.
 Los microscopios electrónicos se clasifican, de acuerdo con la forma en que son
expuestos los detalles del espécimen, en: Microscopia electrónica de transmisión
(MET) y Microscopia electrónica de barrido, o de exploración electrónica (SEM).
 El microscopio electrónico presenta tres características diferentes del microscopio
óptico.
o En primer lugar, como los electrones no pueden recorrer grandes distancias a
través del aire, toda las columna del microscopio debe encontrarse en
condiciones de alto vacío; en consecuencia el objeto siempre debe estar
deshidratado y, por lo tanto, muerto.
 o En segundo lugar debido a que la amplificación que resulta de una lente
electromagnética es proporcional al campo magnético, que a su vez es
proporcional a la corriente en las bobinas, la amplificación puede variarse de
forma continua variando la corriente que atraviesa las bobinas de las lentes.
En el microscopio la amplificación viene fijada por la forma de la lente de
vidrio; por lo tanto se necesitan muchos objetivos para cubrir la escala de
aumentos.
o En tercer lugar, ninguna de las aberraciones primarias puede ser corregida en
las lentes en las lentes electromagnéticas estándar, porque las lentes
magnéticas son siempre convergentes.
 El microscopio electrónico de transmisión está constituido básicamente por cuatro
sistemas que son: sistema óptico electrónico, sistema de haz de electrones, sistema de
detección y amplificación y el sistema de exhibición.
 El microscopio electrónico de barrido (MEB) está compuesto por: un cañón
electrónico, condensadores, plataforma para la colocación de la muestra, objetivo,
lente intermedia, lente de proyección, cámara de observación y una cámara
fotográfica.
 El microscopio electrónico de barrido (MEB) consiste, como en el caso de la televisión,
en hacer coincidir punto por punto la superficie del objeto que se está observando con
la de la pantalla fluorescente; las imágenes dadas por los electrones secundarios, los
retrodifundidos y los absorbidos, son recogidas por captores especiales y proyectadas
en la pantalla fluorescente del aparato.
 En el MEB se pueden observar muestras de cierto tamaño y la profundidad de campo
es excelente. Además, permite obtener un amplio rango de aumentos, desde 15 hasta
100.000 veces, pero solo se puede ver la superficie de los objetos.
 El poder de resolución en el microscopio electrónico de barrido (SEM) depende de
varios factores, tales como la dimensión del haz de electrones, la difusión del mismo
en la muestra antes de la misión de los electrones secundarios, y la corriente
estabilizada de la lente.
 El sistema de amplificación recoge señales y procesa la información procedente de la
muestra, al mismo tiempo que el haz de electrones barre la muestra.
 El generador de barrido está conectado al tubo de rayos catódicos para que el haz de
electrones en este tubo sea barrido en la misma forma que el haz principal. Sin
embargo la potencia de la corriente suministrada a la columna principal de barrido
puede ser atenuada mientras que el tubo de la pantalla es barrido sobre una área
 constante. Como consecuencia de ello, cualquier reducción en el área de muestra
barrida da lugar a un aumento de la imagen. Este aumento viene determinado por la
relación del área de la pantalla del tubo respecto al área de la muestra barrida.
 El microscopio simple es aquel que solo utiliza un lente de aumento al contrario del
microscopio óptico estándar, que posee varias lentes de aumento, es el microscopio
más básico.
 El microscopio de campo oscuro se utiliza para examinar microorganimos vivos que no
son visibles con el microscopio óptico común, que no pueden teñirse con los métodos
estándares o que resultan tan distorsionados por la tinción que sus características no
pueden identificarse.
 En lugar del condensador normal el microscopio de campo oscuro tiene un
condensador especial que incluye un disco opaco. El disco bloquea la luz que llegaría
directamente al objetivo, en el que solo ingresa la luz reflejada por la muestra, la
imagen de la partícula se observa brillante en medio de un fondo oscuro.
 El principio de la microscopia de contraste de fase se basa en la naturaleza ondulatoria
de los rayos de luz y en el hecho de esos rayos pueden estar en fase o fuera de fase. En
este microscopio un conjunto de rayos luminosos proviene directamente de la fuente
de luz. El otro conjunto proviene de la luz que se refleja o difracta por una estructura
particular de la muestra.
 Los microorganismos también pueden observarse con un microscopio de contraste de
fase, que es especialmente útil porque permite la observación detallada de estructuras
internas en los microorganismos vivos. Además, no es necesario fijar ni teñir la
muestra, procedimientos que podrían distorsionar o destruir a los microorganismos.
 El microscopio de fluorescencia aprovecha las ventajas de la fluorescencia, es decir la
capacidad de ciertas sustancias de absorber luz de longitudes de onda corta
(ultravioleta) y emitir una luz de una longitud de onda mayor (visible).
 El microscopio de fluorescencia permite detectar bacterias u otros microorganismos
patógenos, incluso dentro de células, tejidos u otras muestras clínicas, posee una
importancia extraordinaria porque con ella se puede identificar un microbio en el
término de minutos.
 Para aplicar los colorantes ácidos o básicos los microbiólogos emplean tres clases de
técnicas de tinción: simple, diferencial y especial.
 La tinción simple es utilizada para destacar microorganismos a fin de determinar las
formas y las disposiciones celulares. Las células se tiñen con una solución acuosa o
alcohólica de un colorante básico solo.
 Las tinciones diferenciales utilizadas con más frecuencia para las bacterias son la
tinción de GRAM y la tinción de ácido-alcohol resistencia.
 La tinción GRAM es utilizada para distinguir entre clases diferentes de bacterias.
Clasifica las bacterias en dos grandes grupos: grampositivas y gramnegativas. Las
bacterias grampositivas retienen el color del colorante violeta de genciana aparecen
violáceas. Las bacterias gramnegativas no retienen el colorante violeta y permanecen
incoloras hasta que se aplica la safranina como colorante de contraste y entonces se
tornan rosáceas.
 La tinción de ácido-alcohol resistencia es utilizada para distinguir especies de
Mycobacterium y algunas especies de Norcadia, las bacetrias ácido-alcohol resistentes,
una vez teñidas con carbolfucsina y tratadas con ácido-alcohol, retienen el colorante y
aparecen de color rojo. Las bacterias que no son acido-alcohol resistentes, cuando se
las tiñe y se las trata de la misma manera y después se las tiñe con azul de metileno,
aparecen de color azul porque pierden el colorante carbolfucsina y entonces puede
aceptar el colorante azul de metileno.
 Las tinciones especiales se utilizan para colorear y aislar partes específicas de
microorganismos como endosporas y flagelos, y para detectar la presencia de
cápsulas.
 La tinción de endosporas es utilizada para detectar la presencia de endosporas en las
bacterias. Cuando se aplica verde de malaquita sobre un extendido de células
bacterianas fijadas con color, el colorante penetra en el interior de las endosporas y las
tiñe de verde. Cuando a continuación se aplica safranina, tiñe el resto de las células de
rojo o rosado.
 La tinción de flagelos es utilizada para demostrar la presencia de flagelos. Se usa un
mordiente para aumentar los diámetros de los flagelos hasta que puedan visualizarse
por microscopia cuando se tiñan con carbolfucsina.
Bibliografía

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