ANÁLISIS METAGENÓMICO DE POBLACIONES BACTERIANAS EN Fecha: 25/02/2011

SUELO DE BOSQUE NATIVO DEL CHACO ARGENTINO

Talia P.1, Campos E.1, Rorig M.2, Principi D.1, Grasso D.2 y Cataldi A. N° Doc BC-INF-02-11

1
Instituto de Biotecnología, CICVyA, CNIA, 2Instituto de Suelos, CIRN. INTA-Castelar INTA Castelar, Dr.
N. Repetto y Los Reseros s/n, (1686) Hurlingham, Provincia de BuenosAires, Argentina.
e-mail: ptalia@cnia.inta.gov.ar

INTRODUCCION
El etanol celulósico generado a partir de biomasa es uno de los principales candidatos a ser
utilizados como alternativa de los combustibles derivados del petróleo, debido a su gran potencial
ambiental, económico y social porque permite promover el uso de residuos forestales y de la
agricultura creando una fuente renovable de combustible. En este contexto, y con el propósito de
identificar nuevos genes involucrados en la degradación de celulosa fue evaluada la biodiversidad
de poblaciones bacterianas en una muestra metagenómica colectada en un bosque nativo del Chaco
Argentino y en la misma muestra ambiental fue enriquecida utilizando carboxi-metil celulosa
como medio de cultivo con el propósito de favorecer el crecimiento de organismos cultivables con
capacidad celulolítica El objetivo de este trabajo es la prospección de la biodiversidad de
poblaciones bacterianas en suelo de un ambiente celulolítico con el fin de determinar la presencia
de bacterias degradadoras de celulosa.

MATERIALES Y METODOS
La muestra fue colectada de un bosque nativo del Chaco Argentino (S 26° 52´ 0´´ W 60° 43´ 48´´).
El DNA metagenómico de ambas muestras fue extraído utilizando el kit comercial FastDNA®
SPIN Kit for Soil (MP Biomedical) y/o Wizard® Genomic DNA Purification Kit (promega)
utilizado para amplificar la secuencia del gen 16S ADNr utilizando oligonucleótidos específicos de
la división eubacterias que amplifican dicha región, descritos previamente por Weizburg et al.
(1990) (fD1 y rD1). Los productos de amplificación fueron clonados en el vector TA cloning
vector pCR2.1-TOPO y transformados utilizando células competentes DH5α. Los clones
recombinantes obtenidos fueron secuenciados utilizando el oligonucleótidos fD1 sentido. Las
secuencias flanqueantes provenientes del vector fueron editadas utilizando el programa VecScreen
(www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen). Las secuencias editadas fueron analizadas mediante la base
de datos específica de ADN ribosomal RDP (Ribosomal Database Projet II) y el GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando el programa BLAST (Altschul et al., 1990).
Las secuencias fueron alineadas utilizando el programa ClustalX (Thompson et al., 1997), en la
matriz se incluyeron secuencias de referencia para cada división (phylum).
Para la construcción del árbol filogenético, se utilizó el principio de máxima parsimonia
implementado en el programa TNT versión 1.1 (Goloboff et al., 2008). Los valores de bootstrap
fueron obtenidos basados en 100 réplicas.

RESULTADOS
Con el propósito de analizar la diversidad bacteriana de la muestra de suelo de bosque nativo de la
región chaqueña, se construyó una biblioteca de clones a partir de los productos de amplificación
obtenidos utilizando oligonucleótidos específicos que amplifican la región 16S del ADN ribosomal
(ADNr). Los clones obtenidos fueron secuenciados. Hasta el momento se obtuvieron 244
secuencias de buena lectura con un tamaño promedio de 850 pb.
El análisis realizado a nivel de phylum utilizando un grupo de 175 secuencias determinó una mayor
representación del phylum Actinobacteria, seguido por Proteobacteria. Asimismo, la clase más
representativa fue Actinobacteria seguido por Acidobacteria y α-proteobacteria (Figura 1). Este
estudio demostró la presencia de una gran diversidad microbiana en la muestra, incluyendo tanto
bacterias cultivables como no cultivables aeróbicos y anaeróbicos e identificándose la presencia de
géneros con miembros celulolíticos tales como Acidothermus, Paenibacillus, Pseudonocardia y las
especies Acidothermus cellulolyticus, Bacillus sp., etc. (Tabla 1).

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El análisis filogenético a partir de las secuencias obtenidas en este trabajo y de referencia para cada
phylum reveló, en la mayoría de los casos, un agrupamiento por phylum y en congruencia respecto
de secuencias de referencia identificadoras de cada phylum y depositadas en bases de datos
internacionales (Figura 2).
Hasta el momento fueron analizadas 22 secuencias de la biblioteca enriquecida, identificándose la
presencia de los phylum Actinobacteria y Proteobacteria y la especie celulolíticas Cellulomonas
sp..

Phylum
Firmicutes
2% Planctomycetes
2%
Verrucomicrobia Nitrospira
2% 1% Actinobacteria
Proteobacteria
Cyanobacteria Acidobacteria
3% Gemmatimonadetes
Actinobacteria
30% Chloroflexi
NULL NULL
4% Cyanobacteria
Verrucomicrobia
Chloroflexi Firmicutes
4% Proteobacteria
Planctomycetes
27%
Nitrospira
Gemmatimonadetes
Acidobacteria
5%
20%

Planctomycetacia Acidobacteria_Gp7
2% Clase-Género
1% Actinobacteria
Bacilli
Gammaproteobacteria
1% Nitrospira Alphaproteobacteria
2%
1%
Acidobacteria_Gp4
Caldilineae
Acidobacteria_Gp11 Betaproteobacteria
2%
1% Gemmatimonadetes
Thermomicrobia
Clostridia NULL
2%
1% Acidobacteria_Gp6
Spartobacteria Acidobacteria_Gp10
2% Cyanobacteria
Acidobacteria_Gp3
Deltaproteobacteria Actinobacteria
Deltaproteobacteria
3% 30%
Spartobacteria
Acidobacteria_Gp3 Thermomicrobia
3%
Alphaproteobacteria Caldilineae
Cyanobacteria 15% Gammaproteobacteria
3%
Planctomycetacia
Acidobacteria_Gp4
Acidobacteria_Gp7
Acidobacteria_Gp10 8%
Bacilli
3%
Betaproteobacteria Nitrospira
Acidobacteria_Gp6 Gemmatimonadetes 8% Acidobacteria_Gp11
Figura 1. Composición taxonómica
4%
NULL
5%
de las eubacterias presentes en la muestra
5% Clostridiade suelo a) phylum
b) clase-género

Tabla 1. Especies bacterianas celulolíticas encontradas en el análisis mediante 16S rDNA.

Division Género Especie

(Phylum)

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Actinobacteria Acidothermus Acidothermus cellulolyticus

Cellulomonas Cellulomonas sp.
Pseudonocardia Pseudonocardia sp.
Streptomyces Streptomyces sp.
Firmicutes Paenibacillus Bacillus sp.
Proteobacteria Pseudomonas Pseudomonas sp.

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Figura 2. Árbol filogenético del 16S ADNr de la muestra de suelo de Chaco. Círculos rojos:
secuencias de referencia para cada phylum identificado.

CONCLUSIONES
Este estudio demostró la presencia de una gran diversidad microbiana en la muestra, incluyendo
tanto bacterias cultivables como no cultivables e identificándose la presencia de géneros con
miembros celulolíticos tales como Acidothermus, Paenibacillus, Pseudonocardia y la especie
Acidothermus cellulolyticus, entre otros. Esto indicaría que el suelo estudiado podría ser de gran
utilidad en la prospección de nuevos genes que degraden celulosa.

REFERENCIAS

• Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990 ) Basic local alignment
search tool J Mol Bio 215: 208-218.
• Goloboff, P.A., Farris, J.S., and Nixon, K.C. 2008. TNT, a free program for phylogenetic
analysis. Cladistics 24:774-786.
• Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG (1997) The
CLUSTAL_X Windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided
by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 25: 4876-4882.
• Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ (1991) 16S Ribosomal DNA
Amplification for Phylogenetic Study. Journal of Bacteriology 173: 697-703.

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