INGENIERÍA DE BIOPROCESOS

LABORATORIO N° 4

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE
AGUA DE RIO

PRESENTADO A: Ing. Ms. ÁVILA CARHUALLANQUI, Gladys

POR: CALDERON ESQUIVEL, Allisson

ESCOBAR MATAMOROS, Giovanni

GARCÍA CHUPAN, Adaia Rosario

HUÁNUCO GARCÍA, Carmen Del Pilar

HURTADO CRISTOBAL, Antony

MANCHEGO CHAMORRO, Eduardo Antonio

MONTENEGRO ORTIZ, Geli

OMONTE MENDEZ, Jessica Graciela

VILLEGAS MAYHUA, Erick

Integrantes del V semestre sección “B”

HUANCAYO – PERÚ

2016
1. OBJETIVO

 Evaluar la calidad sanitaria de la muestra de agua de río mediante el

método de Número más probable (NMP) para la identificación de
coliformes totales y coliformes fecales (Escherichia coli).

2. INTRODUCCIÓN
Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos presentes en
muestras líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas más comunes se encuentra el recuento
directo por microscopia de fluorescencia, así como los procedimientos basados en
diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintéticos
sólidos o líquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC)
o la estimación por el método del Número Más Probable (NMP).

El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente
sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para
estimar el número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo,
se ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de
microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos
contaminados, por tanto este método es aplicable para estimar el número de
microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como
anaerobias.

Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar
la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales.

Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están formados
por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se
encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se
considera que reflejan mejor la presencia de contaminación fecal. Éstos últimos se
denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta
es la característica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los
Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos es
favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad.
Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminación fecal.
Su presencia se interpreta como una indicación de que los organismos patógenos pueden
estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos
de organismos productores de enfermedades.
3. FUNDAMENTO TEÓRICO
3.1. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA

Se puede definir el análisis microbiológico como el conjunto de operaciones

encaminadas a determinar los microorganismos presentes en una muestra
problema de AGUA.

3.2. COLIFORMES TOTALES

Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-
oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcionen como indicador de contaminación fecal. Estos
deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben
tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser
capaces de desarrollarse extraintestinalmente.

El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal,

sin embargo, las características de sobrevivencia y la capacidad para
multiplicarse fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo
que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua;
conforme mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la
probabilidad de estar frente a una contaminación reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado
distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un
tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), se utilizan como
indicadores de malas prácticas sanitarias.

Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat

primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra.

El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos

Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que
fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C
± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter,
Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.

El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas

capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación
a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la
más prominente es Escherichia coli.
 El verdadero índice de contaminación fecal es Escherichia coli tipo I ya que su
origen fecal es seguro. Desde el punto de vista metodológico Escherichia coli es
el Coliforme más positivo a la prueba del Indol.

La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse

mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características
selectivas y diferenciales.

ESQUEMA COLIFORMES TOTALES ISO 4831

3.3. ESCHERICHIA COLI

Es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la

familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el
intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de
E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas E. coli se
clasifican con base en las características que presentan sus factores de
virulencia únicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo
diferente. Las propiedades de adherencia a las células epiteliales de los
intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plásmidos.
De manera similar las toxinas son mediadas por plásmidos o fagos.

Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli
enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli
enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras
cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores,
las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de
agua y alimentos contaminados.

Escherichia coli enterotoxigénica ETEC

Es reconocida como el agente causal de la diarrea del viajero, la cual se

caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy
frecuente en países subdesarrollados y afecta principalmente a los niños.

Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una

toxina termolábil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y
función es similar a la toxina del cólera, la otra toxina que produce es
termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir
temperaturas de ebullición hasta por 30 minutos.

La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales

frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido
calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y
ancianos la dosis infectiva puede ser más baja.

Escherichia coli enteropatógena ECEP

Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los países en

vías de desarrollo. La ECEP se adhiere a las células de la mucosa del intestino
delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesión y en ocasiones
penetra a las células mucosas. La infección por ECEP provoca diarrea acuosa
generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crónica.

Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que es

codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un
plásmido, ambas proteínas permite su unión a los enterocitos y la destrucción de
las microvellosidades intestinales.
Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua
contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que
la dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha
vinculado con múltiples serotipos específicos de E. coli los cuales pueden ser
identificados mediante la tipificación del antígeno O (somático) y en ocasiones
del antígeno H (flagelar).

Escherichia coli enteroinvasiva EIEC

Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el género

Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se
presenta comúnmente en niños de países subdesarrollados y en personas que
viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentérica
invasiva) al invadir las células epiteliales de la mucosa intestinal.

A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos,

en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias.
Algunas características importantes de este microorganismo que permiten
diferenciarlo de la cepa típica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de
carbono, no descarboxilan la lisina, es inmóvil y anaerogenicos.

La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y

destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los
fagolisosomas.

Escherichia coli enterohemorrágica EHEC

Produce verotoxina, denominada así por su efecto citotóxico sobre las células
Vero, una línea de células renales de monoverde africano. Existen al menos dos
variantes antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis
hemorrágica, una variedad grave de diarrea; y con el síndrome urémico
hemolítico, enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia
hemolítica microangiopática y trombocitopenia. La verotoxina tiene muchas
propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella
dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el más
común y el único que puede identificarse en muestras clínicas es el O157:H7. La
E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG.

La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o

poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades.
Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden
prevenirse mediante la cocción completa de la carne.
En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y síntomas causados por
las cepas de Escherichia coli antes descritas.

Las bacterias coliformes de origen fecal son aquellas comprendidas en el grupo

de los géneros Escherichia, Citrobacter. Klebsiella y Enterobacter, perteneciente
a la familia Enterobacteriáceas, que además son capaces de fermentar la lactosa
con producción de ácido y de gas a 44 ºC, en un tiempo máximo de veinticuatro
horas.

ESQUEMA ESCHERICHIA COLI

3.4. MÉTODOS OFICIALES DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE AGUAS
POTABLES DE CONSUMO DIRECTO

3.4.1. TOMA DE MUESTRAS DE AGUAS PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

TÉCNICA DE MUESTREO

Las operaciones que comporta la toma de muestras varían según la naturaleza

del agua a analizar y el punto de muestreo elegido.

 Lagos, ríos
En ríos o cursos de agua será preciso considerar diversos factores, tales como:
profundidad, caudal, distancia a la orilla, etc. La muestra se tomará lo más lejos
posible de la orilla, procurando no remover el fondo y evitando los remansos o
zonas de estancamiento.
Para tomar una muestra del agua de un lago o de un río se sujetará el frasco por
el fondo en posición invertida, sumergiéndolo completamente y dándole la vuelta
en sentido contrario a la corriente (río) o desplazándolo horizontalmente en la
dirección de la boca del frasco (lago).

 Manantiales
En manantiales naturales o fuentes de caudal continuo, sin dispositivos de
intermitencia, se tomará la muestra directamente sin adoptar medidas especiales
de drenaje.

 Bocas de riego
Para el muestreo en bocas de riego se utilizarán acoplamientos especiales que
permitan operar como en el caso de un grifo.
En todos los casos la muestra de agua no deberá llenar totalmente el frasco,
siendo necesario dejar un espacio interior a fin de facilitar su homogenización en
el momento de iniciar los análisis.

 Pozos y depósitos
Si se dispone de bomba de captación se opera como se ha indicado en el caso
del grifo.
Si no existe sistema de bombeo, no es posible obtener una muestra
representativa.
Con esta salvedad se introducirá en la masa de agua el frasco de muestreo o un
cubo lo más limpio posible, sostenidos con una cuerda y tomando la muestra tras
haber agitado la superficie del agua con el mismo recipiente.
También podrán utilizarse aparatos especiales lastrados que permiten introducir
el frasco esterilizado y destaparlo a la profundidad deseada. En estos casos
deberán utilizarse frascos con tapón a presión.

 Grifos
Una vez retirados filtros u otros accesorios, se procederá a una cuidadosa
limpieza con agua o alcohol.
Con el grifo cerrado se flameará el extremo del mismo, mediante la llama
obtenida con un poco de algodón empapado de alcohol y sostenido con unas
pinzas o bien una lámpara de soldar.
Se abrirá el grifo para que el agua fluya abundantemente y se renueve la
contenida en la tubería que la alimenta. Se destapará el frasco esterilizado sin
tocar la boca del mismo ni el interior del tapón.
Todos los movimientos deberán realizarse sin interrupciones, al abrigo de
corrientes de aire y con las máximas precauciones de asepsia.

3.4.2. BACTERIAS AEROBIAS

Son todas las bacterias heterótrofas, aerobias y anaerobias facultativas,

mesófilas y psicotróticas capaces de crecer en un medio de agar nutritivo.

Método: Se basa en contar el número de colonias desarrolladas en una placa

de medio de cultivo sólido, al que se ha sembrado un volumen conocido de agua,
transcurrido un tiempo y una temperatura de incubación determinados.

3.4.3. BACTERIAS COLIFORMES

Método de los tubos múltiples (NMP número más probable)

Este método podrá utilizarse para cualquier tipo de agua y será el procedimiento
oficial obligatorio en casos de litigio.
EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia eficiente
de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una
evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa
en la determinación de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de
diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes
en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de
este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la
población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad
poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones
seriadas y el uso de una tabla probabilística. Algunas de las ventajas del NMP
son la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos
relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar la
densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una
muestra de suelo usando el método de infección de plantas, provee una
recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados,
determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y suele ser más
rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en
platos de cultivo, entre otros.

 Métodos generales de aislamiento:

Estos métodos utilizan medios de cultivos sólidos en placa Petri.

 Por diluciones sucesivas:

En general, para preparar diluciones seriadas, se parte de una solución

concentrada y se preparan series de diluciones al décimo (1:10) o al medio (1:2).
De esta manera se obtiene una serie de soluciones relacionadas por ejemplo por
un factor de dilución 10 es decir 1/10; 1/100; 1/1000 y así sucesivamente.
O la otra serie es 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32 etc.
Por ejemplo: si partimos de una solución de 50mg/ml de una sustancia (Solución
A):
- Dilución 1/10: 1ml de la solución A + 9 ml de agua= una solución de 5 mg/ml
(dilución 1:10).
- Dilución 1/2: 5 ml de la solución A + 5 ml deagua= una solución de 25 mg /ml
(dilución 1:2).

Se homogeneiza la muestra y se carga el asa por única vez.

 Luego se pasa el asa de un tubo a otro. Estos tubos contienen agar a 45 ºC. De
esta manera el primer tubo contendrá mayor concentración de microorganismos
que el último. Luego se pasa el contenido de los tubos a las placas Petri y de allí
a los tubos con agar en pico de flauta (slant o tubo inclinado).

4. PARTE EXPERIMENTAL
MATERIALES

 1 pipeta de 10mL
 2 pipetas de 1ml
 1 propipeta
 1 matraz de 250mL
 1 matraz de 100mL
 1 gradilla
 2 tubos de ensayo con tapa blanca
 9 tubos de ensayo con tapa negra
 1 probeta de 50mL

EQUIPOS

• Lampa de luz ultravioleta

• Autoclave: Esterilización con calor húmedo y presión 1201°C durante 15
min.
• Estufa: Esterilización por calor seco regulable a 170°C por 1 a 2 horas.
• Incubadora de aire caliente:37°C ± 0,2 °𝐶

REACTIVOS

 Peptona 0.1%
 Muestra (agua de río)
 Agua destilada

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

 Lavado de Materiales:

1° Chequear roturas en el material, en especial en los frascos de toma de

muestras, para evitar alguna contaminación .

2° Tratamiento preliminar de los materiales:

Dejar el material a utilizar reposar con lejía 1:2

3° Condiciones del lavado del material de vidrio:

Temperatura de lavado: 70°C

Enjuague abundante con agua potable, luego con agua destilada o des ionizada.

Importante: Chequeo del pH en el material de

 Envases para la toma de muestras

Esterilización del material de vidrio:

1° Por calor seco: 170°C por durante 01 a 02 horas

 El material debe colocarse en estuches metálicos (pipetas) o envuelto

en papel kraft o aluminio.

 El material esterilizado debe mantenerse envuelto y conservado en un

lugar limpio (estantes o cajas herméticas) hasta su uso.

2º Esterilización del material por vapor a presión , Autoclave:

 Para aquellos materiales de laboratorio como botellas de tapa plástica,

botellas de plástico resistentes a la esterilización (de policarbonato,
polipropileno).

 Esterilización del material por vapor a presión , Autoclave:

 No deben colocarse los materiales muy juntos dentro de la autoclave para

evitar rupturas.

 Las canastillas y/o gradillas con tubos con tapones de algodón deben
cubrirse con papel aluminio para evitar que se mojen y diluyan el medio
de cultivo.

 Se autoclava a 121 ºC durante 15 minutos

 Retirar el material cuando el manómetro indique 1 atm. de presión para

evitar cambios bruscos en los medios.

 Muestreo del agua

  La muestra se tomará en frasco estéril, de cristal (100ml), de boca
ancha con tapa de vidrio o rosca protegida por un papel estéril.

 Lavarse las manos y desinfectarlas con etanol al 70%

 . Para agua potable lo primero es desinfectar la llave

de salida con algodón y etanol, abrir y dejar correr el
agua por 3 minutos.

 Si el agua a analizar está clorada, se añade tiosulfato

de sodio en los frascos antes de esterilizarlos.

 Destapar el frasco, llenar hasta 2/3 del recipiente y

tapar inmediatamente.

 Para la recolección de agua a partir de depósitos

naturales y cuerpos receptores

 retirar la cubierta de papel y sostener el frasco por la base e introducirlo

en el agua 30cm.

 Destapar y llenar contra corriente o moviéndolo al frente, llenar hasta

2/3 del recipiente y tapar inmediatamente.

 En cada caso etiquetar el frasco con nombre del muestreador, fecha,

hora, identificación del punto de toma de muestra.

 El tiempo ideal desde la recolección de la muestra hasta el inicio del

análisis es de 8 horas y no debe exceder de 24 horas. Las muestras
deben mantenerse entre 4-10°C.

 ENVÍO DE MUESTRAS A LABORATORIO

Los frascos con muestras deben agitarse vigorosamente para asegurar la

homogenización.

Llevar las muestras al laboratorio lo más pronto posible, para analizarlas antes
de que transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo.

DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y E. COLI

Método de Número Más Probable o tubos múltiples

Técnica NMP en Agua Potable

Técnica NMP en Aguas Residuales

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
RESULTADOS

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

5. CONCLUSIONES
 En el presente laboratorio se logró realizar la evaluación de la calidad sanitaria
de muestras de agua proveniente de río mediante el método de Número más
probable (NMP) para la identificación de coliformes totales y coliformes fecales
(Escherichia coli)lo cual determino la calidad sanitaria de nuestra muestra.

6. SUGERENCIAS
7. BIBLIOGRAFÍA
 http://www.monografias.com/trabajos15/analisis-agua/analisis-
agua.shtml#OBJET#ixzz4BjOyyiYv
 http://www.monografias.com/trabajos89/determinacion-coliformes-
totales-fecales/determinacion-coliformes-totales-fecales.shtml
 http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Colif-tot-
fecales-Ecoli-NMP_6529.pdf
 8. ANEXOS

Fuente :Propia Fuente :Propia

 Fuente :Propia

Fuente :Propia

Fuente :Propia