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Guion - de Practicas - 2003
Guion - de Practicas - 2003
Objetivo
Separación de los fragmentos de distinto tamaño de ADN en un gel de agarosa,
en el que dichos fragmentos migraran a diferente velocidad según su peso
molecular al ser sometidos a una corriente eléctrica.
Material
Agarosa (Multipurpose de Roche)
Tampón Tris-Acetato(TAE) solución de trabajo:
Tris-Acetato 0.04M
EDTA 0.001M
Solución stock concentrada (por litro) 50x:
Tris base 242g
Ácido acético glacial 57.1ml
EDTA (pH 8.0) 0.5M 100ml
Tampón de carga 6x:
Azul de bromofenol 0.25%
Xylene cyanol 0.25%
Glicerol 30% en H2O
Bromuro de etidio (10 mg/ml)
Conservar a 4ºC
Método
La concentración del gel de agarosa depende del tamaño de los fragmentos de
ADN a separar, siendo la concentración mínima el 0.7% (fragmentos grandes
de varias Kpb) y la máxima el 4% (fragmentos de 50-150 pb). Se pesa 1gr de
agarosa por tanto por ciento y por 100 ml de volumen de gel.
Mezclar la muestra con el tampón de carga, el volumen de muestra depende
del tamaño de peine con el que se han hecho los pocillos en el gel de agarosa,
normalmente es de 10-30 l. De tampón de carga se añade 1/6 del volumen de
muestra.
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
Objetivo
Determinación de las condiciones óptimas de temperatura y concentración de
MgCl2 para la amplificación por PCR del gen CCR5 humano para
determinación posterior de polimorfismos genéticos por electroforesis.
Material
Tris-EDTA:
Tris-HCl 10 mM, pH 8
EDTA 1 mM
Taq Polimerasa (2,5 U/ l )
Desoxiribonucleótidos trifosfato 10 mM cada uno
MgCl2 50 mM
DMSO
Oligo CCR5+ (100 pmoles/l): 5´CCTCATTACACCTGCAGCTCT3´
Oligo CCR5- (100 pmoles/l): 5´CACAGCCCTGTGCCTCTTCTTC3´
Método
Disolver los oligonucleótidos liofilizados a la concentración de 100 pmoles/l
(10-4 M). Para ello calcular el peso molecular de cada oligonucleótido y el
número de moles totales disponibles en función de la cantidad de gramos
suministrada por el fabricante. Después dividir el número de moles por 10 -4 M
par obtener el volumen correcto de resuspensión en Tris-EDTA o agua
destilada. El resultado de la amplificación por PCR depende de la temperatura
de unión al oligonucleótido y de la concentración óptima de MgCl 2 (que varía
para cada pareja de oligonucleótidos). Por ello para determinar las mejores
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
Resultados e interpretación
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
Método
Se procederá a la extracción de DNA a partir de mucosa bucal utilizando para
ello palillos algodonosos que se frotarán en la parte interior de la boca.
Extracción
Cada persona del grupo se frotará la parte interior de la mucosa bucal con un
palillo algodonoso previamente esterilizado.
Cortar el palillo y colocarlo en un tubo eppendorf conteniendo 500 µl de
tampón de extracción. Incubar durante 10 minutos, a temperatura ambiente,
agitando de vez en cuando.
Colocar una columna GFX en un tubo eppendorf para la purificación.
Lavado
Añadir 500 µl de tampon de extracción a cada columna y centrifugar de Nuevo
e las mismas condiciones.
Repetir los dos últimos pasos pero en este caso centrigugar a 12000 rpm
durante 3 minutos (esto permite secar la columna antes de la elución)
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
Elución
Añadir 200 µl de agua calentada sobre la matriz de la columna. Incubar 1 min
a temperatura ambiente.
Centrifugar a 8000 rpm durante 1 min
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
Objetivo
Determinación la existencia de polimorfismos del gen CCR5 humano en la
población de individuos estudiada.
Material
Tris-EDTA:
Tris-HCl 10 mM, pH 8
EDTA 1 mM
Taq Polimerasa (2,5 U/ l )
Desoxiribonucleótidos trifosfato 10 mM cada uno
MgCl2 50 mM
DMSO
Oligo CCR5+ (100 pmoles/l): 5´CCTCATTACACCTGCAGCTCT3´
Oligo CCR5- (100 pmoles/l): 5´CACAGCCCTGTGCCTCTTCTTC3´
Método
Disolver los oligonucleótidos liofilizados a la concentración de 100 pmoles/l
(10-4 M). Para ello calcular el peso molecular de cada oligonucleótido y el
número de moles totales disponibles en función de la cantidad de gramos
suministrada por el fabricante. Después dividir el número de moles por 10 -4 M
par obtener el volumen correcto de resuspensión en Tris-EDTA o agua
destilada.
A partir de las condiciones óptimas de amplificación de este gen, seleccionadas
previamente en la práctica procederemos a la amplificación a partir del DNA de
mucosa bucal extraído.
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
Tubo 1
MgCl2 50 mM X
(l)
Agua (l) Hasta 25