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Celuloliticoi y Amiloliticos PDF
Celuloliticoi y Amiloliticos PDF
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito
Para optar al título de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
i
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
ii
AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS
CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y
EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE CRISANTEMO
(Dendranthema grandiflora)
APROBADO
iii
AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS
CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y
EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE CRISANTEMO
(Dendranthema grandiflora)
APROBADO
i
A Dios por ser mi guía, a mi familia, en especial a mi mamá, mis abuelitos,
Camila y Batty por su infinito amor y compañía.
A Gustavo por brindarme su amor y orientación como lo hace un padre.
A Liliana por su constante dedicación, pero sobre todo por su amistad.
A Paulis, Pili y Memo por su amistad incondicional.
A Mario A. por su continuo interés, apoyo y por hacerme reír siempre.
Diana Gaitán
ii
A Dios por permitirme finalizar este trabajo.
A mis padres y hermanitos por su amor, interés, guía y continuo apoyo.
A mi Tía Nubia y Camilo por su apoyo incondicional.
A Dianis por sus enseñanzas y confianza.
A la familia Bohórquez Galindo, por acogerme en su hogar.
Liliana Pérez
AGRADECIMIENTOS
A todas las personas que de una u otra manera formaron parte de esta
investigación.
vii
TABLA DE CONTENIDO
Pag.
1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEÓRICO 2
2.1 La Celulosa 2
2.2 Degradación de la celulosa 4
2.2.1 Enzimas implicadas en la degradación de la celulosa 4
2.2.2 Evaluación de la Actividad Enzimática 5
2.2.2.1 Endoglucanasas 5
2.2.2.2 Exoglucanasas 6
2.2.2.3 β-glucosidasas 6
2.2.2.4 Celulasas Totales 7
2.2.3 Microorganismos Celulolíticos 7
2.2.3.1 Degradación de la celulosa por microorganismos aerobios
y anaerobios 9
2.2.4 Factores ambientales que determinan la degradación
microbiológica de la celulosa 10
2.2.4.1 Concentración de Nitrógeno en el suelo 11
2.2.4.2 Temperatura 11
2.2.4.3 Aireación 11
2.2.4.4 pH 11
2.2.5 Factores que determinan la Actividad enzimática de las
Celulasas 12
2.2.5.1 Sinergismo 12
2.2.5.2 Adsorción 13
2.2.6 Alternativas en el bioprocesamiento de materiales
Lignocelulósicos 13
2.2.7 Productos de degradación de la celulosa y su utilidad industrial 13
2.2.8 Aplicación de la glucosa a nivel industrial 14
viii
2.2.9 Determinación de actividad celulolítica 15
2.2.9.1 Prueba cualitativa con Rojo Congo 15
2.2.9.2 Prueba cuantitativa por la técnica del Ácido
3,5- dinitrosalicílico (DNS) 16
2.2.10 Cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora) 17
2.2.10.1 Disponibilidad y valor comercial del Residuo Vegetal
generado en cultivos de flores (Cultivos del Norte) 18
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 19
4. OBJETIVOS 20
4.1 Objetivo general 20
4.2 Objetivos específicos 20
5. MATERIALES Y MÉTODOS 21
5.1 Localización y condiciones de muestreo 21
5.2 Aislamiento e identificación de microorganismos celulolíticos 21
5.2.1 Aislamiento primario 21
5.2.2 Aislamiento secundario 22
5.3 Pruebas de antagonismo 22
5.4 Conservación de cepas 23
5.5 Caracterización y procesamiento del residuo vegetal 23
5.6 Proceso de fermentación en cultivo discontinuo 24
5.6.1 Utilización del sustrato vegetal por parte de los microorganismos
celulolíticos seleccionados 24
5.6.1.1 Pruebas preliminares de actividad celulolítica de las cepas
seleccionadas (Individualmente) 24
5.6.1.2 Evaluación de la actividad celulolítica de las
cepas seleccionadas (Consorcio) 25
5.7 Determinación de azúcares reductores 25
5.8 Determinación de actividad celulolítica 26
ix
5.8.1 Solución de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M
pH 7.0 26
5.8.2 Solución de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer ácido cítrico
0.1M pH 5 27
5.9 Identificación Bioquímica 27
5.10 Evaluación de azúcares fermentables en el extracto crudo 28
5.11 Análisis Estadístico 28
6. RESULTADOS Y DISCUSION 29
6.1 Aislamiento de microorganismos celulolíticos 29
6.2 Pruebas de Antagonismo 35
6.3 Pretratamiento del residuo vegetal 39
6.4 Evaluación preliminar de la actividad celulolítica de las cepas
aisladas 40
6.4.1 Evaluación preliminar de la actividad celulolítica del consorcio 41
6.5 identificación Bioquímica 44
6.6 Utilización del sustrato vegetal por parte del consorcio celulolítico 47
6.6.1 Condiciones de pH y temperatura durante la fermentación 50
6.7 Actividad enzimática y liberación de azúcares reductores
a partir del residuo vegetal de crisantemo 51
7. CONCLUSIONES 56
8. RECOMENDACIONES 57
9. LITERATURA CITADA 58
x
INDICE DE TABLAS
Pag
xi
INDICE DE FIGURAS
Pag.
xii
Figura 20. Azúcares reductores en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8)
en SVS al 10% (p/v) 42
xiii
Figura 33. Actividad enzimática en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SVS al 10%(p/v)
bajo condiciones de pH7 37ºC 52
xiv
LISTA DE ANEXOS
Pag.
xv
RESUMEN
The present investigation was with the aim of isolate and evaluate cellulose
degradation by microorganisms. Eight mesophilic bacteria with cellulolytic
activity were isolation and purified from vegetable wastes of a composting
system of crisantemo. The cellulolytic activity of this microorganism was
evaluated qualitatively through hydrolysis halo using congo red and
carboximethylcellulose (CMC) 1%(w/v) as the substrate, afterwards with the
objective to create a cellulolytic bacterial association developed antagonism
test for determine if any type of inhibition existed between them. The
cellulolytic activity of the selected strain was evaluated with dinitrosalicyc acid
(DNS) method, only one microorganism was selected for the bacterial
association. With the aim of boost the bacteria activity, employed a cellulolytic
actinomycete previously isolated and evaluated in other investigation. This
microorganisms were identified as Bacillus sp. and Streptomyces sp. The
degradation capacity of bacterial association using vegetable wastes of
crisantemo was evaluated employing two broths: one of this with vegetable
waste at different concentrations (5%(w/v) and 10%(w/v)), and additional salts
(SVS), the other only with vegetable waste with the same concentrations,
yeast extract and peptone (SV) the concentration of reducing sugars was
evaluated with DNS method and the cellulose activity using CMC phosphate
buffer pH7 37ºC and CMC citric acid pH5 50ºC. The obtained results
indicated that the best degradation of vegetable wastes was using the
bacterial association, showing a synergetic cellulose degradation,
furthermore, the SV 10%(w/v) broth showed the best concentration of
reducing sugars (1.665 g/L) and cellulose activity of 0.1056 UC.
1. INTRODUCCION
2.1 La Celulosa
2
Fig.1 Estructura Química de la celulosa (Heldt, 1997)
3
hidrólisis química y biológica. Así mismo, las regiones amorfas de la
estructura cristalina de la celulosa tienen una composición heterogénea
caracterizada por una variedad de enlaces. Finalmente este arreglo
asimétrico que caracteriza las regiones amorfas es crucial para la
biodegradación de la celulosa (Malherbe y Cloete, 2002)
4
producir oligosacáridos de varias longitudes. La exo β-1,4 celobiohidrolasa
cliva los extremos no reductores del sustrato generando unidades de
celobiosa o glucosa y por último la β-1,4 glucosidasa, completa el proceso
hidrolítico convirtiendo los fragmentos de celobiosa a glucosa o removiendo
glucosa desde los extremos no reductores de pequeños celoligosacáridos.
(Lymar, et al, 1995; Zhang et al, 2006).
2.2.2.1 Endoglucanasas
5
La medición de la actividad de endoglucanasa puede ser basada en la
reducción de la viscosidad del sustrato y/o en el incremento de extremos
reductores que se determinan por técnicas que permitan medir azúcares
reductores. Sin embargo, la actividad de las exoglucanasas también
incrementa el número de extremos reductores por lo cual, es recomendable
que la actividad de las endoglucanasas sea medida por ambos métodos
(viscosidad y extremos reductores) (Lynd et al, 2005).
Por otro lado, dicha actividad puede ser fácilmente detectada en medios con
CMC o celulosa y adición de varios colorantes como el rojo congo, debido a
que estos son adsorbidos sólo por largas cadenas de polisacáridos. Este
método es semi-cuantitativo y muy adecuado cuando se requiere procesar un
gran número de muestras (Ten et al, 2004).
2.2.2.2 Exoglucanasas
2.2.2.3 β-glucosidasas
6
2.2.2.4 Celulasas Totales
7
destacan: Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces cellulolyticus (Semedo,
et al., 2004; Grigorevski, et al., 2005; Li, 1997), Themomonospora curvata,
Thermomonospora chromogena, Thermomonospora alba y Thermomobifida
fusca (Ramírez y Coha, 2003).
8
Tabla 2. Hongos con alta Actividad Específica de celulasas.
9
evitar la pérdida de los intermediarios durante la degradación por los cambios
en las condiciones ambientales (Malherbe y Cloete, 2002).
La tasa a la cual se metaboliza la celulosa está dada por varios factores del
medio ambiente, y los suelos que varían en sus características físicas y
químicas poseen marcadas diferencias en su capacidad celulolítica. Los
principales factores del medio ambiente que afectan la transformación son el
nivel de nitrógeno disponible, la temperatura, aireación, humedad, pH, la
presencia de otros carbohidratos y la proporción relativa de lignina en los
restos vegetales ( Alexander, 1980).
10
2.2.4.1 Concentración de Nitrógeno en el suelo
2.2.4.2 Temperatura
2.2.4.3 Aireación
2.2.4.4 pH
11
polisacárido; bajo condiciones ácidas la desaparición de la celulosa se debe
principalmente a los hogos filamentosos. Aunque el proceso es rápido a pH
menor de 5 y ocasionalmente por debajo de 4, los suelos con bajas
concentraciones del ion hidrógeno degradan la celulosa más fácilmente
(Alexander, 1980).
2.2.5.1 Sinergismo
12
2.2.5.2 Adsorción
13
alcanza un nivel apreciable. Por otro lado, en condiciones anaerobias las
bacterias son incapaces de metabolizar completamente dicho sustrato,
siendo los principales productos de acumulación, CO2, CH4, H2, etanol y
ácidos acético, fórmico, succínico, butírico y láctico (Alexander, 1980).
14
glucosa referida a la capacidad de su grupo carboxilo para reaccionar como
tal, esta directamente relacionado con la capacidad de formar colores, y
aromas de tostado por la reacción con las proteínas (Forero, 1986).
15
polisacáridos debido a que el colorante forma complejos con las moléculas
aún no hidrolizadas, facilitando así la diferenciación entre microorganismos
celulolíticos y no celulolíticos por la formación de zonas de aclaramiento
alrededor de las colonias (Hendricks, et al., 1995).
16
2.2.10 Cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora)
17
emplean productos naturales como cascarilla de arroz o escoria (Santana, et
al,2002).
18
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
19
4. OBJETIVOS
20
5. MATERIALES Y MÉTODOS
21
horas. Transcurrido el tiempo de incubación se adicionó rojo congo al
1%(p/v) (Anexo 1) como revelador a las colonias presentes en los medios,
luego de quince minutos se retiró el exceso y se adicionó NaCl 0.1M (Anexo
1), dejando reposar por quince minutos más, para luego hacer el recuento de
las colonias que presentaron halos de hidrólisis (Teather y Wood, 1982).
22
5.4 Conservación de cepas
23
5.6 Proceso de fermentación en cultivo discontinuo
Inicialmente estas cepas fueron reactivadas del banco en cajas de agar CMC
al 1%(p/v) e incubadas a 35ºC durante 48 horas. A partir de cada cepa se
hizo un raspado en caldo CMC 1%(p/v) llevando a una concentración de 3 x
108 cel/ml e incubando a 35ºC y 120rpm durante 24 horas. Las
fermentaciones se llevaron a cabo por triplicado en un VET de 250ml
adicionando el 10% de inóculo, con un tiempo de duración entre 18 y 24
horas, a 35ºC y 120rpm, muestreando cada dos horas hasta completar el
tiempo de fermentación. En cada una de las horas de muestreo. En cada una
de las horas de muestreo se realizó la determinación de azúcares reductores
24
por triplicado mediante la técnica de DNS (Numeral 5.7). Además se evaluó
Actividad enzimática en CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato pH7 37ºC y buffer
acido cítrico pH5 50ºC relación 1:1 (numeral 5.8) con tiempos de reacción
enzima-sustrato de 30’, 60’ y 120’, realizando cada una de estas
evaluaciones por triplicado.
25
leída en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm y sensibilidad
media, para registrar la absorbancia generada, la cual se reemplazó en la
ecuación de la línea recta arrojada por la curva patrón previamente realizada
(Anexo2), para la obtención de la concentración de glucosa residual en cada
hora de muestreo (Miller, 1959).
26
5.8.2 Solución de carboximetilcelulosa celulosa al 1%(p/v) en buffer
ácido cítrico 0.1M pH5
27
5.10 Evaluación de azúcares fermentables en el extracto crudo
28
6. RESULTADOS Y DISCUSION
29
Tabla 3. Caracterización macro y microscópica de las cepas aisladas con actividad
celulolítica en agar CMC 1%(p/v)
Fuente: Autores
Tabla 4. Actividad celulolítica cualitativa de las cepas aisladas en agar CMC 1%(p/v)
Fuente: Autores
30
Fig 3 Zonas de aclaramiento, cepa 1 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
31
Fig 5. Zonas de aclaramiento, cepa 3 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
32
Fig 7. Zonas de aclaramiento, cepa 5 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
33
Fig 9. Zonas de aclaramiento, cepa 7 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
34
6.2 Pruebas de Antagonismo
Fig 11 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1 Fig 12 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 2
Fuente: Autores Fuente: Autores
35
Fig 13 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 4 Fig 14 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 5
Fuente: Autores Fuente: Autores
Fig 15 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 6 Fig 16 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 7
Fuente: Autores Fuente: Autores
36
La mayor susceptibilidad se observó en las cepas 2, 5 y 6, cuyo crecimiento
se vió inhibido por las demás cepas, generándose halos con diámetros hasta
de 5.0mm (Tabla 5). Las pruebas de antagonismo también se realizaron en
concentraciones de CMC al 2%(p/v) y 3 %(p/v) con el fin de determinar si el
comportamiento antagónico y crecimiento de cada cepa se mantenía a pesar
del incremento en la concentración de la fuente de carbono y de alguna
manera evaluar la inhibición por sustrato de las cepas seleccionadas.
37
Tabla 5. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 1%(p/v)
38
Tabla 7. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 3%(p/v)
39
Fig 19. Residuo vegetal de Crisantemo molido
Fuente: Autores
40
fermentación (Anexo 3, Tablas 8-11), lo cual indicó la falta de concordancia
entre la evaluación cualitativa y cuantitativa de actividad, una posible
explicación de este hecho es que en la prueba cualitativa, el microorganismo
permaneció en contacto con el sustrato durante 48 horas de incubación,
aumentando así la probabilidad de liberar las enzimas necesarias para
degradar el polisacárido; mientras que en la técnica de actividad cuantitativa
por DNS, el extracto enzimático entró en contacto con la celulosa con un
tiempo de reacción de 60 minutos que probablemente no fue suficiente para
que se diera una reacción enzima-sustrato completa.
41
Con el objetivo de potencializar la actividad enzimática de la cepa 8, teniendo
en cuenta que fue un microorganismo “nativo” del sustrato vegetal a evaluar
y, que durante la realización de las pruebas de antagonismo se caracterizó
por inhibir a las demás cepas, probablemente por tener una alta tasa de
crecimiento que lo hacía competitivo por espacio y nutrientes y basados en
que el sinergismo de las enzimas celulolíticas hacen posible la hidrólisis de
celulosa a glucosa (Lu, et al., 2005; Malherbe y Cloete, 2002) se evaluó el
efecto sinérgico entre la cepa 8 y un actinomiceto con buena actividad
celulolítica cualitativa en CMC al 1%(p/v) (halos de hidrólisis de 2.14cm de
diámetro) aislado de suelo de un cultivo de Stevia durante el desarrollo del
trabajo de investigación: “Estandarización de la técnica de detección de β-
1,4 Glucanasas con el uso de sustratos fluorógenos en suelos provenientes
de cultivos de Stevia Rebaudiana bertoni” (Gutierrez, et al, 2006).
1,2
Azúcares reductores (g/L)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
42
0,07
UC pH 7 37ºC UC pH 5 50ºC
1,4
Azúcares reductores (g/L)
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
0,07
Actividad enzimática (UC)
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
UC pH 7 37ºC UC pH 5 50ºC
43
6.5 Identificación Bioquímica
44
La identificación del Actinomiceto se llevó a cabo mediante observación de
las características macro y microscópicas. En agar avena (Anexo 1) dicho
microorganismo desarrolló un micelio aéreo abundante inicialmente blanco y
con el transcurso del tiempo de color café, las colonias se observaron
pequeñas, de borde irregular y aspecto pulverulento (Fig 25), al reverso de la
caja se observó la producción de un pigmento difusible de color amarillo
oscuro, generó un olor característico a suelo húmedo. Microscópicamente el
microorganismo se tiñó como Gram positivo, en cuanto al número y
disposición de esporas –otra característica importante para distinguir los
géneros de Actinomicetes- se presentaron esporas ovoides en cadenas
espiraladas y rectas (Fig 26).
45
Tabla 25. Identificación Bioquímica Actinomiceto
Galactosa Positivo
Fructosa Positivo
Sucrosa Positivo
Arabinosa Positivo
Rafinosa Positivo
Xilosa Positivo
Urea Negativo
Celobiosa Positivo
Ramnosa Positivo
Melobiosa Negativo
Inositol Positivo
Manitol Negativo
Fenilalanina Negativo
Triptofano Negativo
Esculina Positivo
Reducción de nitratos a nitritos Positivo
Catalasa positivo
Gelatina Negativo
Fuente: Autores
Tanto Bacillus sp. como Streptomyces sp. han sido reportados como
microorganismos con alta actividad celulolítica. Muchas especies del género
Bacillus están normalmente presentes en el suelo y en la materia orgánica en
degradación, por lo que se considera que juegan un papel importante en la
biodegradación y bioconversión de componentes de alto peso molecular. Se
ha realizado el aislamiento de Bacillus licheniformis a partir de residuos
vegetales de flores en compostaje (Lu et al, 2005) y Bacillus subtilis en
muestras de suelo y agua en la región amazónica (Heck et al, 2002), en
residuos de banano (Krishna,1999), y en fibras de palma (Apun et al, 2000),
46
en los que dicho género bacteriano ha demostrado un alto potencial
celulolítico.
Por otro lado, Streptomyces sp. ha sido muy estudiado debido a que es parte
importante de la comunidad microbiana del suelo responsable de la
degradación y recirculación de biopolímeros como la celulosa, la
hemicelulosa y la lignina (Semedo et al, 2004). Los estudios realizados con
este microorganismo en cuanto a su capacidad hidrolítica en materiales
lignocelulósicos han reportado buenos resultados, como es el caso de
Streptomyces drozdowiczii y Streptomyces cellulolyticus asilados de
muestras de suelo (Semedo et al, 2004; Grigorevski et al, 2005; Li, 1997).
Ramírez y Coha (2003) aislaron 145 cepas de actinomicetos celulolítcos
entre los cuales Streptomyces sp. tuvo una prevalencia de 50.63% y además
mostró los más altos niveles de actividad enzimática en el estudio.
6.6 Utilización del sustrato vegetal por parte del consorcio celulolítico
47
de las fermentaciones en los medios al 10%(p/v) mostraron la presencia de
glucosa y fructosa como azúcares reductores. En el medio SV la glucosa se
encontró en una concentración de 0.475g/L, mientras que, en el medio SVS
además de la glucosa en una concentración de 0.391g/L se detecto fructosa
en una concentración de 1.417 g/L (Anexo 7) estos resultados permitieron
inferir en primer lugar que el sustrato celulósico a concentración de 10%(p/v)
estimuló la actividad hidrolítica del consorcio microbiano, generándose
diferencias significativas (p<0.05) (Anexo 8) con la actividad hidrolítica al
5%(p/v), en segundo lugar que la adición de sales al medio de producción no
generó diferencias significativas (p>0.05) (Anexo 8) en la liberación de
azúcares reductores respecto al medio sin suplemento, como habría de
esperarse, pues los elementos traza en un medio de cultivo, juegan un papel
importante en la síntesis de ácidos nucleicos, fosfolípidos, pared celular,
enzimas y otros constituyentes celulares, lo cual incrementa la biomasa
celular responsable de la hidrólisis del sustrato vegetal. Esto demuestra que
el residuo vegetal de crisantemo provee una fuente de carbono, nitrógeno y
minerales que suplen los requerimientos nutricionales necesarios para el
crecimiento y la actividad metabólica de los microorganismos evaluados; lo
que puede corroborarse con los análisis fisicoquímicos realizados al sustrato
(Anexo 6), la composición de este residuo se presenta como una ventaja
para su utilización, pues, no se hace necesario suplementarlo con la adición
de compuestos químicos que generarían un costo adicional.
48
Sin embargo, se esperaba una mayor concentración de azúcares reductores
teniendo en cuenta que el residuo vegetal de crisantemo contenía un alto
porcentaje de celulosa (65.3%) de acuerdo al análisis fisicoquímico realizado
(Anexo 6).
0,9
Azúcares reductores (g/L)
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 6 12 16 18 20 22
Tiempo (h)
1,8
Azúcares reductores (g/L)
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiem po (h)
49
4,Tablas 16 y 18) con los obtenidos con el consorcio (Bacillus sp.-
Streptomyces sp.) en el mismo sustrato y a la misma concentración (Anexo 4
y 5,Tablas 19 y 23), demuestran que se estableció un sinergismo en el que
probablemente se logró una complementariedad entre las enzimas
celulolíticas que favorecieron la degradación del sustrato con el consecuente
aumento en la liberación de azúcares reductores.
6,3
6,2
6,1
6
pH
5,9
5,8
5,7
5,6
5,5
0 6 12 16 18 20 22
Tiempo (h)
50
6,6
6,4
6,2
pH
6
5,8
5,6
5,4
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
0,12
Actividad enzimática (UC)
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
51
Por otro lado, la actividad enzimática a pH ácido y una temperatura de 50ºC
(Figuras 32 y 33) fue menor, demostrando que dicha actividad varía de
acuerdo a las condiciones de pH y la temperatura en la que es evaluada
(p<0.05). Una explicación a este hecho puede ser que en condiciones
naturales la actividad hidrolítica de la celulosa se ve afectada cuando el pH
del suelo es ácido, como es el caso de Cellulomonas sp. cuyo
comportamiento metabólico se ve influenciado bajo estas condiciones (Lynd
et al.,2002)
0,12
Actividad enzimática (UC)
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
0,09
Actividad enzimática (UC)
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
52
La actividad enzimática del consorcio evaluada en SV y SVS en
concentraciones de 5%(p/v) y 10%(p/v), no es comparable con los resultados
reportados por otros estudios en los que también se ha realizado la
evaluación de microorganismos celulolíticos en residuos celulósicos (Lu et al
2005), (Krishna, 1999), debido a que el material celulósico difiere en sus
características físico-químicas como son: el tamaño y la superficie de las
fibrillas, el espacio entre las microfibrillas y las moléculas de celulosa en las
regiones amorfas, el grado de cristalinidad de la celulosa, la conformación
estereoscópica y la rigidez de las unidades de celulosa, el grado de
polimerización de la celulosa, la naturaleza de los componentes con los que
la celulosa esta asociada, la naturaleza, concentración y distribución de
grupos sustituyentes (Malherbe y Cloete, 2002; Petre et al., 1999; Zhang et
al., 2006). Dichos parámetros condicionan drásticamente la habilidad de los
microorganismos celulolíticos para degradar este tipo de sustratos, lo cual
explica que el comportamiento metabólico sea específico y por ende, la
acumulación del producto de hidrólisis difiera de un ensayo a otro.
Por otro lado, las interacciones complejas entre las enzimas encargadas de
hidrolizar la celulosa (endoglucanasas, exoglucanasas y β-glucosidasas ) y
los cambios en las características del sustrato durante la hidrólisis han sido
simulados por modelos matemáticos aplicados a una variedad de materiales
lignocelulósicos teniendo en cuenta dos propiedades importantes: la fracción
de enlaces β-glucosidicos accesibles a las celulasas y el grado de
polimerización, dicho modelo sugiere que es casi imposible la predicción del
funcionamiento hidrolítico de una mezcla de celulasas de un sustrato a otro
debido a variaciones como la concentración de celulasas, la proporción
endo/exocelulasas, el tiempo de reacción y las características del sustrato
(Zhang et al., 2006). De esta manera, la actividad celulolítica de los
53
microorganismos va a ser específica para cada sustrato celulósico a evaluar,
como ha sido reportado en diferentes estudios, Lu et al (2005) obtuvo 7.9 y
28UC en una fermentación de residuos de tallos de flores con Bacillus
pasteuri y Bacillus cereus, dichos microorganismos crecieron en un medio
que contenía sulfato, fosfato y nitrato entre otros componentes, durante 7
días a 35ºC y un pH de 6.8-7.2; Krishna (1999) reportó 3.30UC a partir de
residuos de banano utilizando Bacillus subtilis durante 72 horas de
fermentación, pH7, 35ºC, y en este estudio la mayor actividad fue de 0.1056
UC a partir de residuos vegetales de crisantemo.
(En todos los casos la actividad celulolítica fue definida como la cantidad de
enzima necesaria para producir una micromol de glucosa por minuto).
54
et al., 2006), lo cual explica la obtención de halos de diámetro incuantificable
y su baja correlación con los niveles de azúcares reductores obtenidos y la
actividad enzimática evaluada tanto para las cepas inicialmente aisladas
como para el consorcio. Este mismo autor concluyó que los datos obtenidos
en la hidrólisis de sustratos solubles no pueden ser comparados con la
hidrólisis de sustratos insolubles. Un claro ejemplo de este concepto es el
reportado por Himmel et al.,(1999) quien en su estudio obtuvo una actividad
específica de endoglucanasas de Thermobifida fusca diez veces más alta
que la actividad de la endoglucanasa de Trichoderma reesei al ser evaluada
en CMC (sustrato soluble). Sin embargo, esta actividad no se mantuvo
cuando dicha enzima fue evaluada en celulosa insoluble.
Otro de los factores que pudo haber influido en la variación de los resultados
es el tiempo de fermentación y el de reacción enzima-sustrato durante las
pruebas de actividad enzimática. Teniendo en cuenta que la lignocelulosa
pretratada utilizada para evaluar la actividad enzimática de preparaciones
comerciales de celulasas, requiere un rango de tiempo que va de minutos a
horas para que inicie la hidrólisis y hasta varios días para obtener una
digestibilidad final (conversión de la celulosa) (Zhang et al, 2006), hace
pensar que probablemente las evaluaciones realizadas requerían un mayor
tiempo de reacción que diera lugar a la obtención de mejores resultados.
55
7. CONCLUSIONES
56
8. RECOMENDACIONES
57
9. LITERATURA CITADA
• Alcaldía de Tocancipá.<http:/www.alcaldiatocancipa.gov.co>
[Consulta 27 Nov. 2005]
58
• Granados, L; Valderrama, J. 2003. Evaluación de la Actividad Proteolítica
y Amilolítica de Actinomycetes termofílicos aislados a partir de pilas de
compost. Tesis de Pregrado. Microbiología Industrial. Facultad de Ciencias.
Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá
59
• Krishna, C. 1999. Production of bacterial cellulases by solid state
bioprocessing of banana wastes. Bioresource Technology. 69:231-239.
• Lynd, L., Weimer, P., Zyl, H., Pretorius, I. 2002. Microbial cellulose
utilization : Fundamentals and Biotechnology. Microbiology and Molecular
Biology Reviews. 16: 577-583.
• Moreno, B.; Diez, V.; García, M.; Menes,L.;Gutierrez, M.; Polledo,F. 2000.
Comisión Internacional de especificaciones microbiologicas alimentarias.
ICMFS. Editorial Acribia. Zaragoza (España). Pag. 125-126
60
• Páez, A. Castro,D. Martinez, M. M , Pedroza, A. 2001. El manejo de los
residuos sólidos para la nutrición de suelos. Agricultura de las Américas .
301: 2630.
• Pedroza, A.; Matiz, A.; Quevedo, B.; Gomez, D. 2003. Manual de
Laboratorio Introducción a la Biotecnología. Departamento de Microbiología.
Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Pag 63.
61
• Santana, M; Vasquez, C. 2002. Evaluación de cepas de Azotobacter sp. Y
de bacterias solubilizadoras de fosfato (BFS), como biofertilizante mixto en
un cultivo de crisantemo (Crysanthemum morifolium var. Regal suerte). Tesis
de pregrado. Pontificia Universidad Javeriana.Facultad de Ciencias. Bogotá.
62
• Zhang, Y. Himmel, M. Mielenz, J. 2006. Outlook for cellulase
improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances.
24: 452-481.
63
ANEXO 1
64
Preparación buffer fosfato pH 7
65
ANEXO 2
66
Curva patrón de glucosa Nº 1
Concentración Absorbancia
g/L 540nm Curva patrón de Glucosa (g/L) Nº1
0,8
0.5 0.247
0,6
67
ANEXO 3
Pruebas preliminares: Determinación Azúcares reductores y Actividad
enzimática cepas 1, 3,4 y 7
68
Tabla 10 Azúcares reductores (g/L) en el cultivo de la cepa 4 en diferentes concentraciones
de caldo CMC
69
Tabla 12. Azúcares reductores (g/L) en el cultivo del consorcio (cepas 1, 3, 4 y 7) en caldo
CMC al 1%(p/v) y SVS al 10%(p/v)
Fuente: Autores
70
ANEXO 4
Tabla 15. Azúcares reductores (g/L) y Actividad enzimática a pH7 37ºC con tiempo de
reacción enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Bacillus sp. en caldo CMC al
1%(p/v)
Tabla 16. Azúcares reductores (g/L) y Actividad enzimática a pH7 37ºC, pH5 50ºC con
tiempo de reacción enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Bacillus sp. en caldo SVS
al 10% (p/v)
71
Tabla 17. Azúcares reductores (g/L) y Actividad enzimática a pH7 37ºC, con tiempo de
reacción enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Streptomyces sp. en caldo CMC al
1% (p/v)
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa
por minuto a pH7 37ºC
Tabla 18. Azúcares reductores (g/L) y Actividad enzimática a pH7 37ºC, pH5 50ºC con
tiempo de reacción enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Streptomyces sp. en
caldo SVS al 10%(p/v)
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto
a pH7 37ºC y pH5 50ºC
72
Tabla 19. Azúcares reductores (g/L) y Actividad enzimática a pH7 37ºC, pH5 50ºC con
tiempo de reacción enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo del consorcio (Bacillus sp.y
Streptomyces sp.) en caldo SVS al 10%(p/v)
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto a
pH7 37ºC y pH5 50ºC
73
ANEXO 5
74
Tabla 22. Azúcares reductores y Actividad celulolítica en el cultivo del consorcio
celulolítico con SV al 10%(p/v)
Azúcares
reductores* Actividad celulolítica* Actividad celulolítica* (UC)
Tiempo(h) pH (g/L) (UC) pH7 37ºC pH5 50ºC
0 6,26 1,289
6 5,79 1,474 0,08555 0,0328
12 5,98 1,074 0,0502 0,02231
16 6,01 0,884 0,04426 0,01916
18 6,08 0,82 0,0465 0,01842
20 6,3 0,777 0,04574 0,0177
22 6,29 1,225 0,0575 0,03092
25 6,41 0,767 _ _
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto a
pH7 37ºC y pH5 50ºC
*Valores hallados a partir de la curva patrón de glucosa Nº 2
75
ANEXO 6
MÉTODO
ELEMENTO RESULTADO UNIDADES
ANALÍTICO
FRACCIÓN ORGÁNICA (89.2%)
GRAVIMÉTRICO
Grasa 0,31 %
(MET. INTERNO)
GRAVIMÉTRICO
Fibra Cruda 46,4 %
(MET. INTERNO)
Extracto no
37,5 % SUMATORIA
Nitrogenado
76
ANEXO 7
Perfil cromatográfico
Sobrenadante de la hora seis de fermentación en SV al 10%(p/v)
77
Perfil cromatográfico
Sobrenadante de la hora seis de fermentación en SVS al 10%(p/v)
78
ANEXO 8
Análisis estadístico (SPSS, versión 14.)
Distribución de datos
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
AzR
,135 28 ,200(*) ,919 28 ,033
et
* This is a lower bound of the true significance.
a Lilliefors Significance Correction
Resultados arrojados (F28=0,919, p=0,033)
Datos normalizados
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Log ,136 28 ,196 ,956 28 ,278
a Lilliefors Significance Correction
79
Comparación de la liberación de azúcares reductores entre sustrato vegetal
concentraciones 5%(p/v) y 10%(p/v)
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
10% 5%
Concentracion
Oneway Anova
Summary of Fit
Rsquare 0,7622
Adj Rsquare 0,742383
Root Mean Square Error 0,120137
Mean of Response -0,14997
Observations (or Sum 14
Wgts)
t-Test
Difference t-Test DF Prob > |t|
Estimate 0,398255 6,202 12 <.0001
Std Error 0,064216
Lower 95% 0,258341
Upper 95% 0,538170
Assuming equal variances
80
Comparación de la liberación de azúcares reductores entre los medios SV y
SVS a concentración de 5%(p/v) y 10%(p/v)
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
SV SVS
Medio
Oneway Anova
Summary of Fit
Rsquare 0,000039
Adj Rsquare -0,03842
Root Mean Square Error 0,230817
Mean of Response -0,14859
Observations (or Sum 28
Wgts)
t-Test
Difference t-Test DF Prob > |t|
Estimate -0,00277 -0,032 26 0,9750
Std Error 0,08724
Lower 95% -0,18209
Upper 95% 0,17656
Assuming equal variantes
81
Diana Gaitán, Liliana Pérez
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivo aislar y evaluar microorganismos degradadores de celulosa a
partir de residuos vegetales frescos y en compost de crisantemo. Ocho cepas bacterianas mesofílicas
con actividad celulolítica fueron aisladas y purificadas a partir de residuos vegetales de crisantemo en
compostaje. La actividad celulolítica de estas cepas fue evaluada cualitativamente mediante el revelado
de halos de hidrólisis con rojo congo en medio Carboximetilcelulosa (CMC) al 1% (p/v),
posteriormente, con el objetivo de establecer un consorcio bacteriano celulolítico se realizaron
pruebas de antagonismo para determinar si existía algún tipo de inhibición entre éstas. La actividad
celulolítica de las cepas escogidas fue evaluada mediante la técnica del ácido 3,5-dinitrosalicílico
(DNS) a partir de la cual sólo una cepa fue seleccionada para hacer parte del consorcio. Con el fin de
potencializar la actividad de dicha cepa se usó un actinomiceto aislado y evaluado en otro estudio.
Estos microorganismos fueron identificados como Bacillus sp. y Streptomyces sp.. La capacidad
degradadora del consorcio sobre el residuo vegetal de crisantemo fue evaluada en dos medios: uno con
sustrato vegetal a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), suplementado con sales (SVS) y otro,
compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de levadura y peptona (SV),
determinando la concentración de azúcares reductores liberados mediante la técnica de DNS y la
actividad enzimática en CMC en buffer fosfato pH7 37ºC y CMC en buffer ácido cítrico pH5 50ºC.
Los resultados obtenidos mostraron que la degradación del sustrato vegetal de crisantemo fue mejor
cuando las microorganismos actuaron en consorcio demostrando una acción sinérgica entre sus
enzimas, por otro lado, en el medio SV en una concentración del 10%(p/v) se dió la mayor liberación
de azucares reductores con un valor de 1.665g/L y una actividad enzimática de 0.1056 UC.
ABSTRACT
The present investigation was with the aim of isolate and evaluate cellulose degradation by
microorganisms. Eight mesophilic bacteria with cellulolytic activity were isolation and purified from
vegetable wastes of a composting system of crisantemo. The cellulolytic activity of this microorganism
was evaluated qualitatively through hydrolysis halo using congo red and carboximethylcellulose
(CMC) 1%(w/v) as the substrate, afterwards with the objective to create a cellulolytic bacterial
association developed antagonism test for determine if any type of inhibition existed between them.
The cellulolytic activity of the selected strain was evaluated with dinitrosalicyc acid (DNS) method,
only one microorganism was selected for the bacterial association. With the aim of boost the bacteria
activity, employed a cellulolytic actinomycete previously isolated and evaluated in other investigation.
This microorganisms were identified as Bacillus sp. and Streptomyces sp. The degradation capacity of
bacterial association using vegetable wastes of crisantemo was evaluated employing two broths: one of
this with vegetable waste at different concentrations (5%(w/v) and 10%(w/v)), and additional salts
(SVS), the other only with vegetable waste with the same concentrations, yeast extract and peptone
(SV) the concentration of reducing sugars was evaluated with DNS method and the cellulose activity
using CMC phosphate buffer pH7 37ºC and CMC citric acid pH5 50ºC. The obtained results indicated
that the best degradation of vegetable wastes was using the bacterial association, showing a synergetic
cellulose degradation, furthermore, the SV 10%(w/v) broth showed the best concentration of reducing
sugars (1.665 g/L) and cellulose activity of 0.1056 UC.
1
Diana Gaitán, Liliana Pérez
INTRODUCCION
METODOLOGIA
2
Diana Gaitán, Liliana Pérez
por quince minutos más, para luego hacer el recuento de las colonias que presentaron
halos de hidrólisis (Teather y Wood, 1982).
Pruebas de antagonismo
Para llevar a cabo las pruebas de antagonismo se siguió el método de Gauze, para lo
cual, se preparó una suspensión de cada uno de los microorganismos seleccionados a
igual concentración celular, que presentaron mayor actividad enzimática, en 10ml de
solución salina 0.85%(p/v), llevando a incubación a 100 rpm, 35ºC durante 14h.
(Moreno et al., 2000). Por triplicado se dispusieron sobre agar CMC al 1%(p/v),
2%(p/v) y 3%(p/v) (con siembra masiva del microorganismo a enfrentar), anillos
plásticos estériles de un centímetro de diámetro. Dentro de los anillos se inoculó una
suspensión de 50μl del microorganismo antagonista y agua destilada estéril como
control negativo. Teniendo como criterio de selección halos mayores a 5mm (Gauze,
1967).
Conservación de cepas
Para la realización de este proceso se emplearon dos medios: uno con sustrato vegetal
a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v) suplementado con sulfato de amonio
3
Diana Gaitán, Liliana Pérez
Inicialmente, estas cepas fueron reactivadas del banco. A partir de cada cepa se
preparó un inoculo en caldo CMC 1%(p/v) llevando a una concentración de 3 x 108
cel/ml e incubando a 35ºC y 120 rpm. Transcurrido el tiempo de incubación, 25ml de
inóculo fueron adicionados a cada uno de los caldos de fermentación, con un VET de
250ml y condiciones de operación de 35ºC y 120rpm. En cada una de las horas de
muestreo se determinaron azúcares reductores mediante la técnica de DNS y
actividad enzimática utilizando CMC en buffer fosfato pH7 37ºC y CMC en buffer
ácido cítrico pH5 50ºc, evaluando tiempos de reacción enzima-sustrato de 30’, 60’ y
120’.
Pruebas Consorcio
4
Diana Gaitán, Liliana Pérez
Identificación Bioquímica
Análisis Estadístico
5
Diana Gaitán, Liliana Pérez
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cepa 1 Cepa 2
Cepa 6 Cepa 8
Fig 1. Zonas de aclaramiento en agar CMC 1%(p/v)
Fuente: Autores
6
Diana Gaitán, Liliana Pérez
Pruebas de Antagonismo
7
Diana Gaitán, Liliana Pérez
8
Diana Gaitán, Liliana Pérez
1,4
Azúcares reductores
1,2
1
0,8
(g/L)
0,6
0,4
0,2
0
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
Identificación Bioquímica
Los resultados del perfil bioquímico y la observación de las características macro y
microscópicas realizadas a la cepa 8 y el actimomicete permitieron identificarlos
como Bacillus sp. y Streptomyces sp.
Tanto Bacillus sp. como Streptomyces sp. han sido reportados como microorganismos
con alta actividad celulolítica. Muchas especies del género Bacillus están
normalmente presentes en el suelo y en la materia orgánica en degradación, por lo
que se considera que juegan un papel importante en la biodegradación y
bioconversión de componentes de alto peso molecular. Se ha realizado el aislamiento
de Bacillus licheniformis a partir de residuos vegetales de flores en compostaje (Lu et
al., 2005) y Bacillus subtilis en muestras de suelo y agua en la región amazónica
(Heck et al., 2002), en residuos de banano (Krishna, 1999), y en fibras de palma
(Apun et al., 2000), en los que dicho género bacteriano ha demostrado un alto
potencial celulolítico.
Por otro lado, Streptomyces sp. ha sido muy estudiado debido a que es parte
importante de la comunidad microbiana del suelo responsable de la degradación y
recirculación de biopolímeros como la celulosa, la hemicelulosa y la lignina (Semedo
et al., 2004). Los estudios realizados con este microorganismo en cuanto a su
capacidad hidrolítica en materiales lignocelulósicos han reportado buenos resultados,
como es el caso de Streptomyces drozdowiczii y Streptomyces cellulolyticus asilados
de muestras de suelo (Semedo et al., 2004; Grigorevski et al., 2005; Li, 1997).
Ramírez y Coha (2003) aislaron 145 cepas de actinomicetos celulolítcos entre los
cuales Streptomyces sp. tuvo una prevalencia de 50.63% y además mostró los más
altos niveles de actividad enzimática en el estudio.
9
Diana Gaitán, Liliana Pérez
0,9
Azúcares reductores (g/L)
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 6 12 16 18 20 22
Tiempo (h)
Fig. 4 Azúcares reductores en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomcyes sp. en SV
y SVS al 5% (p/v)
10
Diana Gaitán, Liliana Pérez
1,8
Fig. 5 Azúcares reductores en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomcyes sp.) en
SV y SVS al 10% (p/v)
1,6
Azúcares reductores (g/L)
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 6 12 14 16 18 20 22 24 25
Tiempo (h)
11
Diana Gaitán, Liliana Pérez
Por otro lado, la actividad enzimática a pH ácido y una temperatura de 50ºC fue
menor, demostrando que dicha actividad varía de acuerdo a las condiciones de pH y
la temperatura en la que es evaluada (p<0.05). Una explicación a este hecho puede ser
que en condiciones naturales la actividad hidrolítica de la celulosa se ve afectada
cuando el pH del suelo es ácido, como es el caso de Cellulomonas sp., cuyo
comportamiento metabólico se ve influenciado bajo estas condiciones (Lynd et
al.,2002)
0,12
Actividad enzimática (UC)
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
Fig.7 Actividad enzimática en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en
SV al 10% (p/v), bajo condiciones de pH7 37ºC y pH 5 50ºC
Por otro lado, las interacciones complejas entre las enzimas encargadas de hidrolizar
la celulosa (endoglucanasas, exoglucanasas y β-glucosidasas ) y los cambios en las
12
Diana Gaitán, Liliana Pérez
características del sustrato durante la hidrólisis han sido simulados por modelos
matemáticos aplicados a una variedad de materiales lignocelulósicos, dicho modelo
sugiere que es casi imposible la predicción del funcionamiento hidrolítico de una
mezcla de celulasas de un sustrato a otro debido a variaciones como la concentración
de celulasas, la proporción endo/exocelulasas, el tiempo de reacción y las
características del sustrato (Zhang et al, 2006). De esta manera, la actividad
celulolítica de los microorganismos va a ser específica para cada sustrato celulósico a
evaluar.
Otro de los factores que pudo haber influido en la variación de los resultados es el
tiempo de fermentación y el de reacción enzima-sustrato durante las pruebas de
actividad enzimática, si se tiene en cuenta que la lignocelulosa pretratada utilizada
para evaluar la actividad enzimática de preparaciones comerciales de celulasas,
requiere un rango de tiempo que va de minutos a horas para que inicie la hidrólisis y
hasta varios días para obtener una digestibilidad final (conversión de la celulosa)
(Zhang et al., 2006), las evaluaciones realizadas requerían un mayor tiempo de
reacción que diera lugar a la obtención de mejores resultados.
13
Diana Gaitán, Liliana Pérez
CONCLUSIONES
LITERATURA CITADA
Adrado, B; Chpeborska, P; Galbe, M; Zacchi, G. 2005. Ethanol production
from non-starch carbohydrate of wheat bran. Bioresource Technology.
96:843-850.
14
Diana Gaitán, Liliana Pérez
Lynd, L., Weimer, P., Zyl, H., Pretorius, I. 2002. Microbial cellulose
utilization: Fundamentals and Biotechnology. Microbiology and Molecular
Biology Reviews. 16: 577-583.
15
Diana Gaitán, Liliana Pérez
Moreno, B.; Diez, V.; García, M.; Menes,L.;Gutierrez, M.; Polledo,F. 2000.
Comisión Internacional de especificaciones microbiológicas alimentarías.
ICMFS. Editorial Acribia. Zaragoza (España). Pág. 125-126
16