PRACTICA N°6 DE MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

DETECCION DE LA SALMONELLA

I. OBJETIVOS:
 Aplicar adecuadamente la técnica descrita para la detección del
género Salmonella.
 Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección
de Salmonella en alimentos.
II. FUNDAMENTO TEORICO:

Al inicio del siglo XIX, patólogos clínicos en Francia documentaron la

asociación de la ulceración intestinal humana con un agente contagioso; la
enfermedad fue denominada como fiebre tifoidea y posteriormente
investigadores Europeos aislaron y caracterizaron al bacilo tifoideo
responsable de ésta, mientras que en los Estados Unidos, Salmon y Smith
en 1885, aislaron de carne de puerco a Bacillus cholerae-suis, ahora
conocido como Salmonella enterica serovar Cholaraesius. Salmonella spp.
es un bacilo Gram-negativo anaerobio facultativo perteneciente a la
familia Enterobacteriaceae. Aunque los miembros de este género son
capaces de moverse por medio de flagelos perítricos, existen variantes no
móviles, S. enterica serovar Pullorum y S. enterica serovar Gallinarum, así
como cepas no móviles debido a la presencia de flagelos disfuncionales.
Las especies de Salmonella son quimioorganótrofas, con habilidad para
metabolizar nutrientes por las vías fermentativa y respiratoria. Las
bacterias crecen óptimamente a 37°C y pueden catabolizar la Dglucosa y
otros carbohidratos con producción de ácido y gas. Estos microorganismos
son oxidasa negativos y catalasa negativos, crecen en citrato como única
fuente de carbono, generalmente producen ácido sulfhídrico,
descarboxilan la lisina y ornitina, y no hidrolizan la urea. La mayoría de
estas características se utilizan para la identificación bioquímica de cepas
aisladas de Salmonella.La identificación bioquímica de Salmonella se
realiza generalmente junto con una confirmación serológica. Esta técnica
laboriosa implica la aglutinación de los antígenos superficiales bacterianos
con anticuerpos específicos para el género. Estos incluyen los
lipopolisacáridos (LPS) somáticos (O) en la superficie externa de la
membrana externa, los antígenos asociados con los flagelos perítricos (H)
y el antígeno capsular (Vi), este último presente solamente en Salmonella
serovar Typhi, Paratyphi C y Dublín.Las frutas y verduras han ganado
notoriedad en años recientes como fuentes de salmonelosis humana. Esto
 se presenta como una consecuencia de diversos factores como: la
fertilización de sembradíos con lodos sin tratamiento o efluentes de
drenajes potencialmente contaminados con Salmonella spp. resistente a
antibióticos, la irrigación de los campos y el lavado de frutas y verduras
con aguas contaminadas, la manipulación excesiva por los trabajadores, la
exposición a la contaminación ambiental de especies y condimentos
durante el secado y la resistencia del microorganismo a valores de pH
bajos.La composición química del alimento es otro factor determinante en
la salmonelosis además de la heterogeneidad inmunológica en la población
humana y la virulencia de las cepas infectivas. Un denominador común de
los alimentos involucrados, es la presencia de un alto contenido de grasa
en alimentos como el chocolate, el queso y la carne. Se ha sugerido que las
células de Salmonella englobadas en las micelas lipídicas pueden resistir
el efecto lítico de los ácidos gástricos. Las infecciones por Salmonella en
humanos pueden originar varias condiciones clínicas, incluyendo fiebre
entérica (tifoidea), enterocolitis e infecciones sistémicas por
microorganismos no tifoides. La fiebre entérica es una infección grave
asociada con las cepas tifoidea y paratifoidea, las cuales están
particularmente bien adaptadas para invadir y sobrevivir en los tejidos del
huésped. Las manifestaciones clínicas de la fiebre entérica aparecen
después de un periodo de incubación de 7 a 28 días y pueden incluir
diarrea, fiebre prolongada con variaciones en la misma, dolor abdominal,
dolor de cabeza, y debilitamiento. El diagnóstico de la enfermedad radica
en la detección del agente infectivo en etapas tempranas en la sangre o
en heces al inicio de la sintomatología clínica. El tratamiento incluye el uso
de cloramfenicol, ampicilina, o trimetroprim con sulfametoxasol para
eliminar la infección sistémica. En países subdesarrollados como el
nuestro, el uso indiscriminado de estos antibióticos ha originado la
existencia de cepas resistentes que causan altas tasas de mortalidad
cuando se presenta un brote de este tipo.

TECNICAS:

La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos,

describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos:

 Pre enriquecimiento: Es el paso en donde la muestra es enriquecida en

un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de
Salmonella dañada, logrando de esta manera una condición fisiológica
estable.
  Enriquecimiento selectivo: Se logra a partir de un medio de cultivo
que conjunte dos condiciones, por un lado debe incrementar las
poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos
presentes en la muestra.
 Selección en medios sólidos: Este punto se deriva directamente del
anterior y se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento
de otros géneros diferentes a Salmonella y que permitan el
reconocimiento visual característico de colonias sospechosas.
 Identificación bioquímica: Este paso permite la identificación
genérica de los cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos
sospechosos falsos.
 Serotipificación: Es una técnica inmunológica (antígeno-anticuerpo)
que permite la identificación específica de un microorganismo.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES:

 1 matraz Erlenmeyer de 500 mL de capacidad, conteniendo 225.0 mL

de caldo lactosado a .
 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo
selenito-cistina
 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo
tetrationato
 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo
VassiliadisRappaport
 1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar xilosa lisina desoxicolato
(XLD)
 1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar bilis verde brillante (VB)
 1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar entérico de Hektöen (HE)
 1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar sulfito de bismuto (SB)
 1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar para Salmonella y Shigella
(SS)
 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm conteniendo 3.0 mL de agar
hierro-triple azúcar (TSI) o agar hierro Kligler (KIA) solidificado e
inclinado
 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agar hierro-lisina
(LIA) inclinado
 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo urea o caldo
Surraco
  2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo urea rápido
(puede utilizarse en sustitución del caldo urea o Surraco)
 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de medio sulfuro-
indol-manitol (SIM) .
 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agar citrato de
Simmons inclinado
 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo manitol
 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo malonato
 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo rojo de
metilo-Voges Proskauer (RM-VP)
 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 5.0 mL de caldo soya
tripticaseína
 2 cajas de Petri con 20.0 mL de agar infusión cerebro corazón
III. MATERIALES:
 Balanza granataria
 1 caja de Petri de vidrio estéril
 1 bolsa de stomacher o un vaso de licuadora estéril
 Utensilios necesarios para la manipulación de muestras: cucharas,
cuchillos, tenedores, estériles
 Stomacher o motor para licuadora
 Pipetas de vidrio de 1 mL, estériles con filtro de algodón
 Pipetas Pasteur estériles
 Asa microbiológica
 Mecheros de Bunsen
 Portaobjetos Pipetas Pasteur estériles con filtro de algodón
 Microscopio óptico
 Incubadora a 35°C con termostato calibrado que evite variaciones
mayores a 0.1°C
 Incubadora a 42°C con termostato calibrado que evite variaciones
mayores a 0.1°C

NOTAS

 Material necesario al inicio de la práctica.

 Material necesario a las 24 h. de iniciada la práctica.
 Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica.
 Material necesario a las 72 h. de iniciada la práctica.
 Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.
 Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica.
IV. PROCEDIMIENTO:
 Pesar en una bolsa de Stomacher estéril, en área aséptica 25.0 g de
muestra a analizar.
 VertIr 225.0 mL de caldo lactosado estéril en la bolsa. 3.
 Homogeneizar la muestra con el diluyente durante 30.0 seg a
velocidad media en el Stomacher. 4.
 Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente
estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60.0
min. a temperatura ambiente con la tapa perfectamente cerrada. 5.
 Mezclar bien y determinar el pH de la muestra con papel pH. 6.
 Ajustar si es necesario, a un pH de 6.8 0.2 con NaOH 1N o HCl 1N
estériles. 7.
 Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz 8
 Incubar la muestra homogénea a 35 2 C durante 24 h.

Enriquecimiento selectivo.

1. Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos

de preenriquecimiento y agitar suavemente.

2. Transferir 1.0 mL del cultivo de pre enriquecimiento (con una pipeta

de vidrio de 1 mL, estéril) a un tubo con 10.0 mL de cada uno de los
siguientes medios de enriquecimiento:

 Caldo tetrationato (antes de su uso, deberá activarse añadiendo

al medio base 0.2 mL de solución yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL
de solución de verde brillante al 0.1 %)
 Caldo selenito cistina
 Caldo Vassiliadis-Rappaport (en sustitución del caldo
tetrationato)

3. Incubar los tubos inoculados en caldo selenito-cistina, caldo

tetrationato y/o caldo Vassiliadis-Rappaport a 35 1 C durante 24 h. Para
alimentos altamente contaminados deberán incubarse los medios de
enriquecimiento a 42°C por el mismo periodo

AGAR TRIPLE AZÚCAR HIERRO O AGAR KLIGLER HIERRO

1. Registrar las características del medio TSI o KIA antes de la

inoculación (color del medio).

2. Por duplicado tomar suavemente una porción del centro de la colonia

con asa bacteriológica recta y estéril e inocular por picadura y estría en
un tubo con agar triple azúcar hierro (TSI) o agar de Kligler (KIA)
inclinado.

3. Incubar el medio TSI o KIA a 35 2 C durante 24 h.

4. Consultar el Cuadro 2 para la interpretación de los resultados.

AGAR LISINA HIERRO.

1. Hacer la misma operación que se hizo para KIA o TSI (inciso 4.1.),
tomando la asada de la misma colonia con la que se sembró en estos
medios, pero sembrando ahora en el agar lisina hierro (LIA).

2. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones

características de Salmonella en los medios TSI (o KIA) y LIA para
realizar las pruebas bioquímicas complementarias.

4. Los cultivos desarrollados en TSI o KIA que no parecen de

Salmonella pero que presentan reacciones en LIA típicos deben
trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el
medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella
que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que
muestre reacciones atípicas en ambos medios.

PRUEBAS BIOQUIMICAS:

 CALDO UREA (CONVENCIONAL)

1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar del crecimiento del tubo
TSI/KIA o LIA e inocular en el tubo con caldo urea o caldo Surraco.
2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h.
3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).
4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los
cultivos que den la prueba negativa.
 CALDO UREA (RÁPIDA)
1. Con asa bacteriológica estéril, tomar dos asadas de crecimiento del
cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI/KIA o
LIA e inocular tubos de caldo urea (rápida).
2. Incubar a 37 0.5 C durante 2 h en baño de agua.
3. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los
cultivos que den la prueba negativa.
 PRUEBA DE ROJO DE METILO
1. Para la prueba de rojo de metilo (RM) incubar a 35 2 C el resto del
medio RMVP durante 48 h más (96 h. de incubación en total a partir
de la inoculación del medio RMVP).
2. Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solución indicadora
de rojo de metilo. 3. Agitar e interpretar los resultados en forma
inmediata
 IDENTIFICACIÓN SEROLÓGICA.
Investigación de los antígenos somáticos de Salmonella (suero anti
Salmonella “O” polivalente).
1. Colocar con una asa bacteriológica, dos gotas separadas de solución
salina estéril (NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones
de una placa para aglutinación.
2. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo
desarrollado en TSI/KIA o LIA.
3. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Salmonella “O”
polivalente y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de
madera.
4. Agitar inclinando la lámina, hacer girar las gotas durante
aproximadamente un minuto.
5. Observar bajo una buena iluminación y sobre un fondo oscuro la
reacción.
6. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.
 PREENRIQUECIMIENTOS ESPECÍFICOS EN DIVERSOS
GRUPOS DE ALIMENTOS PARA LA DETECCIÓN DE
SALMONELLA

PRODUCTOS EN POLVO

1. Pesar 25.0 g de muestra y transferirla a una porción del caldo

lactosado (aproximadamente 15.0 mL), para permitir la humectación
lenta del alimento.
2. Homogeneizar poco a poco con una varilla de vidrio estéril y agregar
más caldo lactosado hasta completar 225.0 mL

LEVADURA SECA ACTIVA

1. Mezclar la muestra incubada

2. Transferir 1.0 mL a cada tubo de 10.0 mL de caldo tetrationato (con
0.2 mL de solución yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL de solución de
verde brillante al 0.1%) y 10.0 mL de caldo lauril-triptosa.
3. Incubar los medios de enriquecimiento a 35°C por 24 h 2 h

DULCES Y DULCES CUBIERTOS (INCLUYENDO CHOCOLATE)

1. Pesar asépticamente 25.0 g de muestra en un vaso de licuadora o

bolsa de Stomacher, y agregar 225.0 mL de leche descremada
reconstituida estéril.
2. Licuar por dos min.
3. Continuar igual que en el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta
después de ajustar el pH.
4. Adicionar 0.45 mL de la solución de verde brillante al 0.1% y mezclar
bien.
5. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)
V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFFICAS:
 Bacteriological Analytical Methods On line, Diciembre 2007.
 A.P.H.A. Asociación Americana de Salud Pública.-1992. Formules
antigeniques des serovars de Salmonella. WHO colaborating centre
for reference and research on Salmonella.-Michel y. Popoff and Leon
le Minor, Institute Pasteur.28 rue du Dr.Roux 75724. Paris cedex 15,
France.1992.
 Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical
Manual”. 9 th ed. Arlington, VA: AOAC.
 Andrews W.H., Flowers R.S., Silliker J., & Bailey S. (2001)
“Salmonella”. In: Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington:
357-380.
UNIVERDIDAD NACIONAL JORGE
BASADRE GROHMANN
ESCUELA INGENIERIA EN INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS

TEMA : DETECCION DE SALMONELLA

CURSO : MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS II

DOCENTE : AMELIA CASTRO

ESTUDIANTE : EVELIN ESTAÑA SILVA

CODIGO : 2012-36872

TACNA- PERU
2016