Microbioligia PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA
MICROBIOLOGÍA DE
SUELOS
Técnicas, métodos y
medios de cultivo
M. en C. María de Jesús Sánchez
2004
MICROBIOLOGIA DE SUELOS
Técnicas, métodos y medios de cultivo
M. en C. MARÍA DE JESÚS SÁNCHEZ COLÍN

MICROBIOLOGIA DE SUELOS
Técnicas, métodos y medios de cultivo
ISBN: 970-32-1907-1
D.R. © 2004 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Prohibida su reproducción total o parcial con fines de lucro.
PAPIME: EN216403
CONTENIDO
Página
I INTRODUCCION 1
II MATERIAL DE USO COMÚN EN MICROBIOLOGÍA DE 3

SUELOS
2.1 EL MICROSCOPIO 3
2.2 PROBETAS DE CULTIVO 5
2.3 CAJA PETRI 5
2.4 PIPETAS BACTERIOLÓGICAS 5
2.5 EL ASA Y LA AGUJA PARA INOCULAR 5
2.6 PORTAOBJETOS 5
III ESTERILIZACION DEL MATERIAL 7
3.1 ESTERILIZACION CON CALOR SECO 7

3.1.1.- La Incineración 7
3.1.2. La Tindalización 7
3.2 ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN 7
3.2.1- Flujo Laminar 8
3.3 ESTERILIZACION CON CALOR HÚMEDO 8
3.4 ESTERILIZACION POR RADIACIONES 9
3.5 SOLUCIONES PARA ESTERILIZAR 10
IV CONSIDERACIONES PARA AISLAR A LOS ORGANISMOS 11
4.1 ESTERILIZACION 11
4.2 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO 11
V MEDIOS DE CULTIVO SINTÉTICOS 13
5.1 CULTIVOS PUROS EN PLACA 14

5.2 PLACA ESTRIADA 14
5.3 METODO DE DILUCIÓN DE SUELO SERIAL 14
5.4 CULTIVOS EN TUBO CON AGAR INCLINADO 16
VI TECNICAS DE INOCULACIÓN 17
6.1 INOCULACION PRIMARIA 17

6.2 INOCULACION EN CALDO 18
6.3 INOCULACIÓN EN AGAR INCLINADO PARA 18
CONSERVACION
DE CEPAS
VII TECNICAS MICROSCÓPICAS 19
7.1 MONTAJE EN SOLUCIÓN SALINA 19

7.2 MONTAJE EN HIDROXIDO DE POTASIO 19
7.3 TECNICA DE LA GOTA PENDIENTE 19
7.4 TECNICA DE LA TINTA CHINA 19
7.5 METODO DEL HEMATOCITOMETRO CALIBRADO 20
7.6 METODO DE ROSSI Y CHOLODNY 20
7.7 MEDICIÓN DE MICROORGANISMOS 21
VIII TINCIONES DIRECTAS 23
8.1 TINCION DE GRAM 23

8.2 TINCIONES ACIDORRESISTENTES O DE ZIEHL-NEELSEN 24
8.3 TINCIONES SELECTIVAS 25
IX AISLAMIENTO DE BACTERIAS 27
X AISLAMIENTO DE ACTINOMICETOS 33
XI AISLAMIENTO DE HONGOS 37
XII AISLAMIENTO DE ALGAS 43
XIII AISLAMIENTO DE PROTOZOARIOS 45
XIV AISLAMIENTO DE NEMATODOS 49
XV BIBLIOGRAFÍA 53
I .- INTRODUCCIÓN
Entre todas las ciencias que estudian seres vivos, la Microbiología es, probablemente, la única
que se ocupa de todos los aspectos relativos a los organismos que constituyen su objeto de
estudio. Se trata, por tanto, de una biología general de los microorganismos, entendiendo por
tales aquellos organismos que son invisibles al ojo humano, sin ayuda de un instrumento óptico
que amplíe su imagen, y que son o bien unicelulares o bien pluricelulares pero con una
organización biológica muy simple. Por consiguiente, la Microbiología se ocupa tanto del estudio
de las características inherentes a los microorganismos (tales como su estructura celular, su
bioquímica, su fisiología y su genética, entre otras), como de sus actividades y sus
interacciones con otros seres vivos y con el medio en el que habitan. Entre estas últimas se
encuentran aquéllas características que tienen que ver con el papel de los microorganismos
como transformadores de la materia orgánica e inorgánica (y, por tanto, con la participación de
los microbios en los ciclos de los elementos en la naturaleza), así como aquéllas que hacen que
muchos de ellos se comporten como agentes patógenos de animales y vegetales, aspectos
todos ellos de indudable interés en agronomía.
La Microbiología del suelo no es una disciplina pura ya que sus orígenes pueden buscarse en la
Bacteriología, la Micología y la Edafología además de la Bioquímica y la Fitopatología. Estas
disciplinas se entrelazan para formar la Microbiología del suelo y se debe estar familiarizado en
cierta medida con sus principios para poder entender e interpretar todos los fenómenos que
suceden dentro del suelo y el impacto que tienen en el medio ambiente y en particular en la
agricultura.
En el suelo existe una gran variedad de organismos que realizan muy diversas funciones que
ejercen influencias benéficas y perjudiciales sobre la capacidad de alimentación del hombre y la
calidad del medio ambiente entre los cuales podemos citar a los hongos, bacterias,
actinomicetos, algas, protozoarios, nematodos y virus. Para realizar un análisis de los
organismos edáficos es necesario llevar a cabo una serie de técnicas básicas y experimentales
que nos permitan conocer su morfología, hábitos, fisiología, en general su biología así como la
forma de extracción. Para el estudio de estos microorganismos se necesita conocer aprender y
familiarizarse con los métodos básicos de extracción de los mismos; por ello este manual se
divide en dos partes, la primera trata los aspectos generales donde se hace mención del
material, reactivos, técnicas básicas y experimentales de uso común para iniciarse en estudios
de Microbiología de suelos. En la segunda parte se menciona las características generales de la
microbiota del suelo , los medios específicos y la manera de aislarlos. Este manual va dirigido a
los alumnos de la carrera de Biología, para que se inicien en la información básicas necesaria
para poder realizar estudios microbiológicos. Es un recopilación de métodos y técnicas que se
utilizan en estudios de microbiología básica y microbiología de suelos.
M. en C. María de Jesús Sánchez Colín FES - Zaragoza UNAM 2
II.- MATERIAL DE USO COMÚN EN MICROBIOLOGÍA DE SUELOS
2.1.- EL MICROSCOPIO
Una de las herramientas del microbiólogo más útil es el microscopio óptico, ya que todas las
formas vivientes con las que se experimentan son invisibles a simple vista y es indispensable
que se este familiarizado con el microscopio al iniciar un estudio en el laboratorio de
microbiología.
En la actualidad existen dos tipos de microscopía: 1).- Microscopía óptica y 2).- Microscopía
electrónica. En la microscopía óptica la imagen se amplifica por una serie de lentes desde 100 a
1000 diámetros y en algunos casos hasta 2000 según el tipo de luz y la forma de iluminar el
objeto en estudio. Puede ser de campo claro, de campo oscuro, de contraste de fases, de
fluorescencia y de ultravioleta. Sin embargo, el más utilizado en estudios microbiológicos es el
de campo claro.
La microscopía electrónica amplifica la imagen mediante un haz de electrones en lugar de luz y

un campo magnético (que hace la veces de los lentes), produciendo imágenes con aumentos
de doscientos mil a cuatrocientos mil diámetros.
Los microscopios pueden ser simples o compuestos según el número de lentes con que
cuenten; los microscopios simples utilizan un solo lente y el microscopio compuesto tiene dos o
más lentes. Los compuestos son los que se utilizan en este tipo de estudio y ellos cuentan con
dos sistemas de lentes que son el ocular y el objetivo donde el ocular amplifica la imagen
producida por el objetivo. La mayor parte de los microscopios compuestos tienen varios
objetivos los cuales pueden ser tres y cada uno de ellos proporciona una resolución diferente
(Burges, 1990).
El objetivo de menor poder aumenta el objeto 10 veces, el objetivo de mayor poder

amplificando la imagen 40 veces aproximadamente y el objetivo de aceite de inmersión
amplifica el objeto 90 veces como el ocular aumenta 10 veces la resolución total combinada es
de 100, 400 y 900 respectivamente (Locquin, 1985).
Se debe considerar los detalles del microscopio para obtener mejores resultados al utilizarlo,
como conocer el sistema de control, tipo de platina (fija o con movimiento), localización del
diafragma, tipo de luz, etc., (ver figura 1).
La forma correcta para enfocar el microscopio es muy importante y por ello es necesario que se
sigan estas indicaciones para poder lograrlo:
__ Usar el tornillo macrométrico para que descienda el objetivo hasta que este tan cerca del
portaobjetos o preparación como sea posible observando en forma lateral el descenso para que
el lente no toque el portaobjetos. En su descenso el objetivo de bajo poder no toca la
preparación pero él de alto poder y él de inmersión si pueden tocarlo.
__ Observar a través‚ del ocular y empezar a enfocar subiendo el objetivo hasta lograr el mejor
foco posible.
Microbiología de Suelos 3
__ Se debe utilizar primero el objetivo de bajo poder para lograr el foco óptimo y luego cambiar
al objetivo de alto poder y mover el tornillo micrométrico‚ para obtener el nuevo foco óptimo de
inmediato.
__ Es necesario mantener limpios los lentes para que la imagen no este borrosa.
__ No usar el lente de inmersión en seco o bien el objetivo de alto poder con aceite pues
mancha el lente y provocaría su desprendimiento.
OCULARES
BRAZO REVOLVER
OBJETIVO
PLATINA
TORNILLOS
Macrométrico
y DIAFRAGMA
Micrométrico
CONDENSADOR
BASE
Figura 1 .- Partes básicas de un microscopio compuesto de campo claro

2.2.- PROBETAS DE CULTIVO
La probeta de cultivo o el tubo de ensayo común tiene una gran variedad de usos en el
laboratorio de Microbiología pero principalmente se utiliza para cultivar microorganismos en
medios artificiales; generalmente se cubren con un tapón de algodón pero también‚ los hay con
tapas de acero inoxidable tapón de hule o plástico y tapón de rosca (baquelita). Al estar
utilizándolas se debe flamear la boca del tubo con un mechero Bunsen para destruir los
microorganismos que se puedan acumular en el tubo o probeta antes de inocular con los
organismos que se desea estudiar.
2.3.- CAJA PETRI
Las cajas Petri pueden ser de vidrio o plástico y proporcionan un espacio cerrado en el cual
crecen los organismos en cultivos artificiales; pueden contener alrededor de 15 mL de medio
sólido y se deben incubar en posición invertida. La técnica correcta de sembrar una caja Petri
con agar nutritivo para colonias aisladas se debe colocar en la mano izquierda abriéndola con el
dedo pulgar formando un ángulo de apertura pequeño y si esté se realiza por cuadrantes se
debe girar la caja 90 sacando el asa y cerrar la caja Petri para sembrar la siguiente zona.
2.4.- PIPETAS BACTERIOLÓGICAS
Las pipetas se utilizan para transferir de un recipiente a otro cantidades exactas de liquido en
condiciones de asepsia pueden ser de 1 mL y 10 mL.
2.5.- EL ASA Y LA AGUJA PARA INOCULAR
Se utilizan para transferir microbios para cultivo de un recipiente a otro en condiciones asépticas
y con ello evitar la introducción de organismos no deseados, estos dispositivos consisten en un
mango al cual se le une un alambre de platino o nicromo, el alambre puede ser recto (aguja) o
puede terminar en asa, al utilizarlos se deben esterilizar colocándolos a la flama de un mechero
Bunsen hasta que se torne rojo, luego se deja enfriar de 10 a 15 segundos y se toman los
organismos para transferirlos en forma aséptica a otro recipiente.
2.6.- PORTAOBJETOS
El tipo más común es el portaobjetos simple de vidrio, pero los hay cóncavos (con una
depresión circular en el centro), para observar bacterias vivas o bien de pozo profundo para
microcultivos de mohos y hongos microscópicos (Granados, 1998).
III.- ESTERILIZACION DEL MATERIAL
En las técnicas usadas en Microbiología, el material con que se trabaja necesita de una asepsia
que se logra con el proceso de esterilización. Mediante este método se logra matar
microorganismos o esporas que pueden interferir en nuestro estudio provocando contaminación
en los cultivos o infecciones en los organismos, los principales métodos de esterilización son: el
calor seco en hornos, el calor húmedo en autoclave, las radiaciones con luz ultravioleta o rayos
X y agentes químicos.
3.1.- ESTERILIZACION CON CALOR SECO
El calor seco o aire caliente se recomienda siempre que el vapor de agua a presión no sea
deseable o que no sea posible que entre en contacto directo con el material que se va a
esterilizar. Con esté método se coagulan las proteínas que forman parte del citoplasma celular
al elevarse la temperatura ambiental. Se recomienda su uso con el material de vidrio y todo
aquello que no se queme con altas temperaturas que van de 160 º C a 180 º C como máxima.
Para realizar este tipo de esterilización se hace uso de estufas u hornos con termostato que
regulen la temperatura durante 1 o 2 horas. Para el manejo adecuado de un horno, se debe
considerar lo siguiente:
La transferencia del calor a los materiales debe ser homogénea.

Se debe precalentar el horno.
El tiempo se cuenta a partir de que el horno llega a la temperatura de 180 º C.
No abrir el horno hasta que se complete la esterilización.
Abrir por debajo de los 70 º C, debido a que un enfriamiento brusco podría romper los objetos
de vidrio.
3.1.1.- La Incineración.- es un método de esterilización eficaz, pero su aplicación es muy

limitada. En este se emplea la llama roja de un mechero para esterilizar el asa de siembra, que
sirve para transferir microorganismos de un lugar a otro, además se pueden esterilizar
espátulas y objetos contaminados como los desechos de hospitales y cadáveres de animales
de laboratorio.
3.1.2. La Tindalización.- Este método se utiliza para sustancias que se desnaturalizan a

temperaturas de 100 º C, para ello se usa la autoclave con la válvula abierta o un vaporizador
de Arnold. Se esteriliza de manera continua por tres días y se deja incubar después de cada
esterilización, de tal manera que en la primera esterilización se destruyen las estructuras que
están en latencia y al dejarse incubar algunas estructuras como las esporas germinan. Con el
segundo y tercer periodo de calentamiento se eliminan estas formas vegetativas.
3.2.- ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN
Esta técnica se emplea para esterilizar sustancias termolábiles, como sueros, vitaminas,
antibióticos, azucares, entre otros. El material filtrante puede ser de asbesto, tierra de
diatomeas, porcelana y actualmente se usa las membranas de éster de celulosa. La eliminación
de los contaminantes bióticos, esta en función de la carga eléctrica y del tamaño de los poros
del material filtrante. Para su aplicación se debe usar material estéril y se coloca el material
filtrante sobre el soporte de la unidad de filtración, se fija y se pasa el líquido a través de la
membrana o material filtrante, recolectándose el filtrado en un matraz esterilizado. Además
estos filtros se utilizan para esterilizar el aire ambiental de sitios que lo requieran (Fig. 2).
3.2.1- Flujo Laminar.- Es una técnica que permite controlar la contaminación que proviene del
aire, mediante dos procesos simultáneos: 1).- El paso del aire a través de filtros absolutos (
HEPAVECOFLOW que retiene partículas de 0.3 micras) y 2).- Regulación de la velocidad del
aire filtrado y dirección del mismo.
Los dispositivos que aplican esta técnica son las campanas de flujo laminar horizontal y vertical,
que se utilizan en actividades que requieren esterilidad.
Entrada del líquido

Tierra de
Material de
diatomeas
Porcelana
Filtro de Porcelana Filtro Berkefield
Figura 2.- Equipos de esterilización por filtración
3.3.- ESTERILIZACION CON CALOR HÚMEDO
Este método se dice que mata o destruye todos los microorganismos ya que al penetrar más
rápidamente el calor transportado por la humedad, el punto de coagulación desciende y este
calor se distribuye más uniformemente que el calor seco, con una aplicación de 5 a 10 minutos
a 100 º C, mueren todas las formas celulares y de 15 a 20 minutos a 120 º C mueren las
esporas. Los aparatos para lograr esta esterilización son el esterilizador de Arnold y el
autoclave.
El esterilizador de Arnold se recomienda solo para medios de cultivo de gelatina, leche o

medios carbohidratados, pero no es muy efectivo para la destrucción de esporas, ya que no
garantiza que todas las esporas germinen en el momento de la esterilización para que mueran
a una temperatura de 100 º C.
El uso de la autoclave es el método más recomendado para la esterilización del material de

vidrio y medios de cultivo que se usarán o medios de cultivo que se van a desechar. Para
cantidades pequeñas puede utilizarse con cierta seguridad las ollas de presión de uso
doméstico.
A continuación se muestra la relación entre la presión de vapor y la temperatura, pero esto

depende de la expulsión previa del aire del recipiente durante el periodo de purgación.
Presión de vapor en Temperatura

libras ºC
(mayor que la presión
atmosférica)
0 100.0
5 108.3
10 115.5
20 126.6
Tabla 1 .- Presión de vapor y temperatura del autoclave
No es posible dar instrucciones detalladas para los distintos tipos de autoclaves pero a
continuación se menciona algunas indicaciones para utilizar una unidad controlada
manualmente.
1.- Asegurarse de que la tapa del autoclave este perfectamente cerrada antes de generar o
introducir calor
2.- Permitir que el vapor salga en forma libre y continua durante varios minutos a fin de expulsar
todo el aire del autoclave antes de cerrar la espiga.
3.- Cuando la presión haya actuado durante el tiempo requerido, ciérrese la fuente de calor a
vapor y déjese enfriar el autoclave hasta que la presión indicada por el manómetro sea de 0
atmósferas.
4.- En este momento y no antes abrase la espiga lentamente y quítese luego la tapa.
3.4.- ESTERILIZACION POR RADIACIONES
Las radiaciones como la luz ultravioleta y los rayos X provocan la muerte en los organismos
celulares, debido a la destrucción de los ácidos nucleicos de los microorganismos además de
formar peróxido en el medio celular, los cuales actúan como agentes oxidantes, retarda su
desarrollo y modifica sus características hereditarias provocando mutaciones. Este tipo de
radiaciones provoca la muerte de virus, bacteriófagos, esporas, hongos y bacterias.
Todo el material fuera del envase esterilizador es portador de microorganismos y se debe

impedir su entrada, para lo cual los envases se tapan antes de la esterilización a fin de impedir
la posterior entrada de gérmenes, para tal efecto se utilizan tapones de algodón, tapas
metálicas o de vidrio. Cuando se procede a la apertura de los envases, debe realizarse
rápidamente de manera de reducir el tiempo de exposición y de protegerlos en todo lo posible
contra la entrada de partículas provenientes del aire (García, 1991)
3.5.- SOLUCIONES PARA ESTERILIZAR
Se deben preparar soluciones esterilizantes que se utilizan para limpiar las mesas de trabajo
antes de efectuar el aislamiento del microorganismo o bien también pueden ser utilizadas para
tratar la superficie del tejido vegetal del cual se va aislar el organismo en estudio, estos pueden
ser raíz, semilla, hojas y tallo. Estas soluciones actúan como limpiadores superficiales para
eliminar o reducir contaminantes.
Los compuestos esterilizantes que se utilizan con mayor frecuencia son:
Solución de hipoclorito de sodio al 5 %.
Alcohol etílico al 95%.
Solución de cloro al 10%.
Cloruro de mercurio en la proporción de 1:1000 en solución acuosa (Tóxico).
Solución Rada. (Cloruro de mercurio 1:1000 en alcohol etílico al 50%) (tóxico).
En estas soluciones se debe enjuagar el material en estudio y posteriormente enjuagarse con

agua estéril (Agrios, 1991; Koneman, 1997).
IV.- CONSIDERACIONES PARA AISLAR A LOS ORGANISMOS
Para realizar un diagnóstico de los microorganismos presentes en el suelo o en tejidos

vegetales, es necesario observarlos al microscopio, para ello hay que aislarlos, pero como se
encuentran mezclados con una gran variedad de organismos o contaminantes es necesario
aplicar diferentes métodos para aislar al o los organismos deseados a fin de llevar a cabo un
estudio de sus características, hábitos, reproducción, etc.
Para ello se deben llevar a cabo los siguientes procedimientos preliminares:
4.1.- ESTERILIZACION
La esterilización del material de cristalería, agua y medios de cultivo, se realiza mediante la

utilización de la autoclave.
4.2.- PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
Los organismos vivos requieren de sustancias nutritivas o nutrientes para sintetizar su material
celular, generar energía y llevar a cabo su fisiología. En el laboratorio de Microbiología se han
diseñado medios de cultivo, que son mezclas de agua, sustancias orgánicas e inorgánicas en
cantidades variables, que tratan se simular la composición química de las células y los
nutrientes que requiere para su desarrollo. De tal manera que los principales nutrientes son el
hidrógeno, oxígeno, carbono, nitrógeno, fósforo y azufre en orden decreciente, además de
algunos cationes de sales inorgánicas como el potasio, calcio, magnesio y hierro y en
requerimientos pequeños el manganeso, cobalto, cobre, molibdeno y zinc (Ramírez-Gama, et
al., 2003).
Algunos microorganismos requieren de compuestos orgánicos específicos como vitaminas,

aminoácidos, purinas o pirimidinas, que funcionan como precursores de otros nutrientes
(factores de crecimiento), por ello al preparar o elegir un medio de cultivo se debe considerar lo
siguiente:
Tener una mezcla equilibrada de todos los nutrientes.

Controlar el pH.
Evitar la precipitación de sales minerales.
La preparación de medios de cultivo, los cuales pueden ser muy variados según los tipos de
organismo que se quieran aislar. Algunos son sintéticos con cantidades conocidas de
compuestos químicos y por lo común son medios específicos. La mayoría contiene un extracto
de una fuente de carbohidratos y otros nutrientes como papa, harina de maíz, habas o extracto
de malta y se les agrega agar para que solidifique el medio donde se van a desarrollar los
microorganismos.
Los medios de cultivo que se utilizan con mayor frecuencia son:
PAPA-DEXTROSA (PDA).- El cual es un medio general para aislar a la mayoría de hongos.
AGAR-AGUA o AGAR-GLUCOSA.- Se mezcla de 1 a 3 gr. de glucosa en agar - agua, este

medio se utiliza para separar hongos como Pythium y Fusarium de bacterias.
AGAR NUTRITIVO.- Este medio debe contener peptona y extracto de carne, es útil para aislar
bacterias.
Los hongos pueden aislarse en medios de cultivo de bacterias al añadir 1 o 2 gotas de una
solución de ácido láctico al 25%, el cual inhibe el crecimiento de bacterias, está solución
también se puede agregar a todo el medio antes de vertirse en las cajas Petri en una cantidad
de 10 mL/L
Los medios de cultivo se preparan en matraces, se tapan y se esterilizan en autoclave a 120 º C

y a 15 libras de presión durante 20 minutos, al enfriarse se vacían en las cajas Petri o tubos de
ensayo en forma aséptica en un lugar limpio y libre de corrientes de aire y polvo.
V.- MEDIOS DE CULTIVO SINTÉTICOS
La utilización de un medio de cultivo se realiza para estudios donde se quiera determinar el tipo
y abundancia del microorganismo en su ambiente y el aislamiento de una cepa particular de su
ambiente natural aumentando el número de individuos de una especie . Esta técnica se utiliza
para seres microscópicos y nos permite conservar los organismos en condiciones de estudio,
por tiempo prolongado.
El medio de cultivo se considera como el soporte favorable de crecimiento de los

microorganismos, ya que reúne las características necesarias indispensables para el tipo de
organismos como son: nutrientes, pH, temperatura, aireación, y otros factores especiales según
el organismo de que se trate. Si se realizan estudios metabólicos es necesario conocer con
precisión los componentes del cultivo, pero muchos microorganismos de vida libre crecen bien
en estos medios que tienen las características básicas antes mencionadas, pero si son
parásitos que se desarrollan en cultivos específicos, se tiene que tener cuidado en elegir el
medio de cultivo para su óptimo desarrollo.
Se pueden preparar medios de cultivo sólidos, semisólidos y líquidos; los sólidos proporcionan
la facilidad de que los organismos se desarrollen por separado y los líquidos se emplean con
frecuencia para permitir la competencia y en consecuencia la selección máxima, aun cuando el
organismo que se obtiene al final del proceso haya estado en cantidades ínfimas junto con otros
organismos. Es más común el uso de medios de nutrientes sólidos que contienen agar y un
agente gelificante en la preparación de éste tipo.
El agar solidifica formando un gel transparente el cual no puede ser metabolizado por la
mayoría de microorganismos y se mantiene firme hasta muy cerca de los 100 º C; una vez
derretido se mantiene liquido hasta cerca de los 40 º C (Granados, 1998).
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a su aplicación en:
Selectivos.- son los que favorecen el desarrollo de un microorganismo específico y suprime el

crecimiento de otro, por ejemplo la adición de cloruro de sodio en altas concentraciones, lo hace
selectivo para los estafilococos y algunas bacterias Gram positivos y suplrime a otras sensibles
a esta sal.
Enriquecidos.- son los que permiten el desarrollo de microorganismos heterótrofos exigentes
en nutrientes, como los que se preparan con caldo enriquecidos con sangre, suero o extractos
de animales o vegetales.
Diferenciales.- estos contienen sustancias indicadoras que ponen de manifiesto alguna
actividad metabólica del microorganismo que es diferente a los demás. En el medio Agar sangre
se puede hemolizar (destruir) los glóbulos rojos, con la acción de las bacterias hemolíticas , ya
que forman una zona clara alrededor de la colonia bacteriana.
Cuantificación.- para determinar la cantidad de microorganismos y la calidad microbiológica
del agua y leche, entre otros, usando formulaciones y medios específicos.
Caracterización.- Son variables y se usan para determinar tipo de crecimiento, características
metabólicas del microorganismo.
Mantenimiento.- se utilizan para preservar la viabilidad de las células en un cultivo y se
caracterizan por tener concentraciones muy limitadas de nutrientes.
5.1.- CULTIVOS PUROS EN PLACA
Los métodos para obtener los mejores cultivos puros son los de placa. El cultivo en placa
consiste en mezclar una suspensión de células (diluidas en agua estéril) en agar fundido a 45 º
C y vaciarlo en cajas Petri, cuando el agar se solidifica las células se inmovilizan en este y
crecen formando colonias, donde cada una se pudo haber formado a partir de una célula única.
Posteriormente se toma la colonia en estudio y se prepara una suspensión con ella y se
resiembra en otra placa repitiendo esto varias veces se puede obtener un cultivo puro. Esta
técnica presenta problemas ya que no todos los organismos se desarrollan en forma
independiente y se complica el poder separar las colonias para llevarlas a medios subsecuentes
por ello se hace uso de otra técnica como el de la placa estriada.
5.2.- PLACA ESTRIADA
Para preparar una placa estriada se usa la impregnación de una sola asada de material en
estudio como podría ser suelo, agua , etc. sobre la superficie de un medio de agar ya
solidificado y el tipo de estría sobre el agar es muy variado como se observa en la figura 3.
Después de realizar la inoculación por el método deseado, las cajas Petri se incuban a la
temperatura que se requiera para su desarrollo en posición invertida para evitar que el agua de
condensación que se forma en la caja Petri se deposite sobre la superficie del medio,
provocando que las colonias de bacterias se junten y sea imposible decir donde empieza y
termina una de ellas.
Inoculación primaria Estría en ángulo recto Estría en dos cuadrantes
Figura 3. Diferentes métodos de estriado
5.3.- METODO DE DILUCIÓN DE SUELO SERIAL
El método de dilución o del número más probable permite calcular la densidad microbiana sin
una enumeración directa, el crecimiento de los organismos empieza después de la inoculación
de volúmenes conocidos en series de diluciones decimales de suelo en medio nutritivo,

siempre que el inoculó contenga una o más células.
Por lo tanto, si el crecimiento ocurre en la dilución 10-5 y no en la dilución de 10-6 , la población

de este tipo de microbiano se considera entre 10-5 y 10-6 . La cuantificación se logra repitiendo
la inoculación 5 o más veces con cada dilución en los medios nutritivos, luego se registra en
que dilución hubo crecimiento y se hace el cálculo de acuerdo a la cantidad de suelo utilizada
inicialmente para conocer el número más probable de microorganismos considerando que cada
colonia fue originada por una célula (Echegaray, 1993) . Esta técnica consiste en preparar una
solución patrón de suelo, la cual se va diluyendo de la siguiente manera:
1.- Todo el proceso se realiza en condiciones asépticas y con material estéril.
2.- En 90 mL de agua estéril se colocan 10 gr. de suelo y se agita por 10 minutos (solución
patrón 1:10).
3.- Se toma 1 mL de esta solución patrón y se mezcla con 9 mL de agua estéril en un matraz de
50 mL y se resuspende la solución 1:100.
4.- Se repite el paso anterior con la solución 1:100 y así sucesivamente hasta obtener la dilución
deseada.
5.- Por último se inocula 1 mL de la dilución deseada sobre una caja Petri con agar antes de
que solidifique, se incuba y se espera el desarrollo de colonias y se calcula el número de ellas
de acuerdo a la dilución utilizada, para conocer el número más probable (Fig.4).
Figura 4.- Método de dilución de suelo serial

5.4.- CULTIVOS EN TUBO CON AGAR INCLINADO
Los microorganismos pueden cultivarse en tubos con solución nutritiva disuelta en agua,
siempre y cuando la superficie del medio este en contacto con el aire en forma adecuada. Esto
se logra derritiendo el agar en la probeta o tubo y dejando que solidifique en forma inclinada, a
esto se le conoce como agar inclinado, pero en otras ocasiones se prefiere tener la probeta con
agar, sin inclinar y se le conoce como agar vertical.
VI.- TECNICAS DE INOCULACIÓN
El material para la inoculación es relativamente simple, se recomienda un alambre de nicromo o

platino recto o en forma de asa, el cual se inserta en un mango y sobre la superficie del agar
solidificado se puede inocular la muestra mediante varios métodos de estriado ya mencionados
anteriormente (Johnson, 1992).
6.1.- INOCULACION PRIMARIA
El inoculó primario se puede efectuar con una asa, un hisopo o con otro dispositivo una vez
realizado el inoculó primario, se puede emplear un alambre recto o con asa a fin de diseminar el
material en los cuatro cuadrantes de la placa y el inoculó se disemina sucesivamente en estrías
con un movimiento de arriba hacia abajo en cada cuadrante dando vuelta la placa y
esterilizando el asa en la flama para cada estriado diferente (Fig. 5).
El propósito de esta técnica es diluir el inoculo suficientemente sobre la superficie del agar
como para obtener colonias bien aisladas a partir de unidades formadoras de colonias. Estas ya
aisladas se pueden subcultivar individualmente en otros medios a fin de obtener cultivos puros.
La técnica de estrías empleada para inocular medios de agar es útil en el recuento
semicuantitativo de colonias (Granados, 1998).
Figura 5.- Técnica de inoculación primaria.

6.2.- INOCULACION EN CALDO
Los medios de cultivo se pueden distribuir en tubos, ya sea como caldo o en agar sólido;
también se puede utilizar agar semisólido en pruebas de movilidad, pero los tubos con caldo se
pueden inocular inclinando el tubo a un ángulo de aproximadamente 30 grados y acercar un asa
con el material a inocular a la superficie interior del vidrio, justo sobre el punto en el que la
superficie del medio forma un ángulo agudo. Cuando el tubo de cultivo se vuelve a la posición
vertical, el área de inoculación queda sumergida debajo de la superficie (Fig.6).
Figura 6 .- Inoculación de un tubo con caldo.
6.3.- INOCULACIÓN EN AGAR INCLINADO PARA CONSERVACION DE CEPAS
Los tubos que contienen agar inclinado se inoculan primero atravesando el agar en profundidad
y se continua sembrando por estrías la parte inclinada desde abajo hacia arriba, con un
movimiento en "S", luego de retirar el alambre de la parte profunda(Fig. 7).
Figura 7.- Inoculación en tubos de agar inclinado

VII.- TECNICAS MICROSCÓPICAS
Se conocen varias técnicas que pueden ser utilizadas en el examen directo de muestras o
colonias de organismos que se desarrollan en medios de cultivo, ya sea para demostrar la
presencia de microorganismos u observar ciertas características bioquímicas, fisiológicas o
serológicas (Koneman, 1997). Las técnicas más comunes empleadas en el laboratorio de
Microbiología son:
7.1.- MONTAJE EN SOLUCIÓN SALINA
Se utiliza una solución de cloruro de sodio acuoso al 0.85% y nos sirve para determinar la
actividad biológica de microorganismos, como la movilidad. Sobre un portaobjetos se coloca
una gota de solución salina y sobre de ella se suspende una pequeña cantidad de la muestra,
colocar el cubreobjetos y examinar al microscopio, observándola a inmersión. Para evitar la
desecación, rodear el cubreobjetos con una mezcla de parafina-vaselina antes de colocar la
gota de muestra sobre el portaobjetos.
7.2.- MONTAJE EN HIDROXIDO DE POTASIO
Se utiliza KOH al 10 % en solución acuosa, el cual ayuda a observar con mayor claridad los
hongos, para ello se suspende en una gota de KOH la muestra, luego se coloca encima el
cubreobjetos y se deja asentar a temperatura ambiente durante media hora o bien la
preparación se puede calentar suavemente en la flama de un mechero para acelerar el proceso
de aclaramiento y posteriormente se examina al microscopio.
7.3.- TECNICA DE LA GOTA PENDIENTE
Esta técnica tiene el mismo propósito que el montaje en solución salina, que es observar la
movilidad en bacterias, para ello se coloca una pequeña cantidad de la mezcla de parafina -
vaselina alrededor del borde de la concavidad de la superficie superior de un portaobjetos de
gota pendiente. En el centro del cubreobjetos suspender la muestra en una gota de agua o
solución salina, invertir el portaobjetos y presionarlo sobre el cubreobjetos guiando la gota de
suspensión hacia el centro de la cavidad, luego volver con cuidado el portaobjetos a la posición
normal para el examen microscópico directo.
7.4.- TECNICA DE LA TINTA CHINA
Para esta técnica se utiliza tinta china (marca Pelikán) y los gránulos finos de la tinta
constituyen un fondo semiopaco contra el cual se puede observar claramente las cápsulas o
quistes de muchos microorganismos.
Si la muestra es líquida se debe centrifugar ligeramente para concentrar a los microorganismos,

se emulsiona sobre un portaobjetos una pequeña cantidad de muestra en una gota de tinta
china y luego se coloca el cubreobjetos. Dicha emulsión no debe ser muy espesa, pues puede
bloquear la luz al observar al microscopio.
7.5.- METODO DEL HEMATOCITOMETRO CALIBRADO
Para realizar un examen microscópico directo de las colonias en el suelo se utiliza este método,
que consiste en la incorporación de una cantidad de suelo en agar líquido colocando unas gotas
de esta infusión en un hematocitómetro calibrado, la suspensión se tiñe y luego es observada al
microscopio. Si se conoce la cantidad de suelo, el volumen de agar y el área sobre la cual este
distribuido, puede determinarse el número de bacterias en la muestra.
7.6.- METODO DE ROSSI Y CHOLODNY
Se conoce como el método del portaobjetos enterrado o portaobjetos de contacto de Rossi y

Cholodny, fue el primero en utilizarse en estudios de las características de la población
microbiana del suelo en relación con su medio ambiente, esté método no es cuantitativo sino
cualitativo; se utiliza para estudios de laboratorio y campo.
Las limitaciones del método es la incapacidad para aislar y cultivar las células microbianas
observadas a través del microscopio, para realizar esta técnica se hace lo siguiente:
* Estudio en campo.- Se coloca de 4 a 6 portaobjetos en el campo, introduciéndolos en la

región más cercana a las raíces, durante un periodo de 15 a 30 días, pasado este tiempo se
remueven con cuidado de no destruir el frotis formado sobre el portaobjetos y se sigue este
procedimiento.
1.- Lave ligeramente el frotis con agua para eliminar las partículas gruesas del suelo y déjelo
secar al aire libre.
2.- Se tiñe con el siguiente colorante, cuya composición es:
Rosa de bengala...................... .....1.0 g

Cloruro de calcio dihidratado..............0.1 g
Fenol al 5% acuoso.................... .100.0 mL
3.- Se deja con el colorante 10 minutos sin dejarlo secarse.

4.- Se lava y seca al aire libre.
5.- Se observa al microscopio la forma y tamaño de las células bacterianas y forma de las
colonias, presencia de filamentos de Actinomicetos, hongos, esporas, algas o algún otro
organismo.
* Estudio en laboratorio.- Se pesan tres porciones de 200 gramos de muestra de suelo

tamizado y se colocan en vasos de precipitados de 500 mL, se agrega agua hasta 40 a 50% de
la capacidad de campo, luego se insertan 2 portaobjetos en cada vaso, se cubren con papel no
poroso o con cajas Petri para evitar la evaporación rápida del agua, se deja incubar a
temperatura ambiente durante 15 días y se remueve un portaobjetos y el otro se retira a los 30
días, con el fin de compararlos, siguiendo el proceso antes mencionado para su observación
microscópica ( Echegaray, 1993).
7.7.- MEDICIÓN DE MICROORGANISMOS
En muchos estudios microbiológicos se requiere conocer el tamaño del microorganismo con el

que se realiza la investigación, ya que las bacterias tienen dimensiones entre 0.2 a 10 µm, los
eucariotes miden de 2 a 40 µm; esporas de hongos de 10 a 200 µm, entre otros, por ello se
requiere de una medición de los mismos, de manera indirecta al observarlos, para lo cual se
utilizan:
Un ocular micrométrico que sustituye al ocular del microscopio y que tiene una escala arbitraria,
pero con divisiones lo suficientemente pequeñas como para medir microorganismos.
Un objetivo micrométrico que es un portaobjetos en el cual está grabada una fina escala
dividida en centésimas de milímetro; es decir, que cada una de sus divisiones mide 10 µm.
Para calibrar el micrómetro ocular, se colocan en los respectivos sitios del microscopio el ocular
micrométrico y el objetivo micrométrico, se enfoca y se hacen las coincidir las líneas iniciales de
ambas escalas, se localiza alguna división en la que vuelvan a coincidir las escalas
exactamente y se calcula la equivalencia en micras de cada división del ocular, sabiendo que
cada división del objetivo mide 10 µm (Ramírez-Gama, et al., 2003).
VIII.- TINCIONES DIRECTAS
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su protoplasma posee un
índice de refracción cercano al del agua, se requiere de tinciones biológicas, para visualizar o
demostrar el fino detalle de sus estructuras internas. Las tinciones se llevan a cabo con
soluciones acuosas u orgánicas de colorantes o mezclas de colorantes, que confieren una
variedad de colores a los microorganismos, tejidos animales o vegetales y a otras sustancias de
importancia biológica.
Los colorantes no sólo sirven para la tinción directa de materiales biológicos, sino que también
se pueden emplear a fin de demostrar las funciones fisiológicas de los microorganismos
empleando las llamadas técnicas supravitales. Los colorantes sirven asimismo como
indicadores de cambio de pH en los medios de cultivo y como indicadores redox, para
demostrar la presencia o ausencia de condiciones anaerobias.
La mayoría de los colorantes biológicos son derivados del alquitrán, poseen anillos bencénicos
en especial como derivados de la anilina y fenilamina. La clasificación de los colorantes está
basada en los cromóforos presentes formando dos grupos, el de los colorantes "ácidos" y el de
los colorantes "básicos", términos que nos indican si una parte significativa de la molécula es
aniónica o catiónica.
Desde el punto de vista práctico, los colorantes básicos tiñen estructuras de naturaleza ácida
como la cromatina nuclear de la célula y los colorantes ácidos reaccionan con sustancias
básicas tales como la estructura citoplasmática. Si en una preparación se deben teñir las
estructuras nucleares y citoplasmáticas, se puede emplear una combinación de colorantes
ácidos y básicos; un ejemplo común son las tinciones con hematoxilina (básica) y eosina (ácida)
empleadas para examinar cortes de tejidos (Locquin, 1985). Las coloraciones más comunes
son las técnicas de Gram y de Ziehl-Neelsen.
La aplicación de diferentes colorantes y la combinación de colorantes, mordentes y

decolorantes, han permitido desarrollar diversas clases de tinciones, que pueden ser:
Tinciones simples
Tinciones diferenciales
Tinciones simples.- consisten en aplicar un solo colorantes a la preparación para observar la

morfología de los microorganismos. Se usan principalmente colorantes básicos como el azul de
metileno, el cristal violeta o la safranina.
Tinciones diferenciales.- consiste en aplicar una combinación de colorantes, mordentes y

decolorantes que permiten poner de manifiesto alguna diferencia importancia en la composición
de los microorganismo. De este modo, se pueden distinguir microorganismos que, aún cuando
presentan igual morfología
8.1.- TINCION DE GRAM
El método de Gram es ampliamente utilizado en la tinción de bacterias, ya que es un factor

importante en la taxonomía de ellas, sobre todo de algunas especies patógenas. El carácter
taxonómico consiste en la respuesta del microorganismo a la coloración y se conocen dos
grupos por su diferente reacción tintórea ante la coloración de Gram los cuales son: la bacterias
Gram-Positivas y las Gram-Negativas.
En esta técnica se utiliza el cristal violeta o violeta de genciana que actúa como colorante
primario, que se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solución
débil de yodo. Algunas especies de bacterias debido a la naturaleza química de su pared
celular, poseen la capacidad de retener él cristal violeta aun después del tratamiento con
decolorantes orgánicos (mezcla de acetona-alcohol), tales bacterias se denominan Gram-
Positivas. Otras bacterias las llamadas Gram-Negativas pierden la coloración primaria del cristal
violeta al ser tratadas con decolorantes debido a un mayor contenido de lípidos en su pared
celular y mediante la aplicación de un colorante secundario como la safranina adquieren un
color rosado o rojo vistas al microscopio habiendo fijado la safranina como contracolor a su
pared celular y se realiza de la manera siguiente:
* Cubrir el frotis ya fijado con solución de cristal violeta durante un minuto, luego se deja escurrir
el exceso del colorante.
* Lavar gota a gota con agua de la llave, cubrir el frotis con lugol durante un minuto.
* Escurrir y lavar con agua de la llave o destilada.
* Inclinar el portaobjetos y agregar gota a gota una mezcla de acetona al 30% en alcohol etílico
para decolorar, aproximadamente 15 segundos.
* Lavar con agua de la llave gota a gota.
* Cubrir con safranina en solución al 2.5% en alcohol del 95% durante un minuto.
* Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire
* Observar al microscopio y determinar si es Gram-positiva (se tiñe de color violeta) o Gram-

negativo (se tiñe de color rojo).
8.2.- TINCIONES ACIDORRESISTENTES O DE ZIEHL-NEELSEN
Las microbacterias poseen una cápsula gruesa y cerosa resistente a la tinción, sin embargo,
una vez teñidas la cápsula resiste a la decoloración con potentes solventes como el alcohol y el
ácido. Por tal motivo los microorganismos que tienen esta propiedad se les llama
acidorresistentes.
A fin de que el colorante primario (Carbolfucsina) logre penetrar las cápsulas cerosas de los
bacilos acidorresistentes, se requiere de un tratamiento físico como es la aplicación de calor
después‚ de haber aplicado el colorante de cabolfucsina a la muestra.
Otras tinciones que se utilizan son la Azul de Metileno de Loefflere como coloración simple en
una gran variedad de microorganismos, en donde se tiñen intensamente los gránulos
metacromáticos, diferenciándose del citoplasma que adquiere un color azul claro. También se
usa el Lactofenol Azul de Algodón, como contracolor para tejidos sin fijar, bacterias y protozoos;
además en la actualidad se usa para tinción directa de micelio fúngico y cuerpos fructíferos que
toman un color azul claro (Moreno, 1988).
8.3.- TINCIONES SELECTIVAS
Este tipo de tinción nos permiten observar un organelo celular determinado, ya que el colorante
se combina selectivamente con él. Para lograrlo se usan mordentes, agentes acidificantes o
precipitantes y de contraste, las importantes son:
Tinción de endosporas,
Tinción de flagelos,
Tinción de núcleo y
Tinción de cápsula.
Tinción de endospora.- las endosporas son organeros de resistencia de algunas

bacterias y se producen dentro de la célula. Tienen una capa externa muy resistente
formada por complejos de calcio, ácido dipicólinico y peptidoglucano, muy difícil de
colorear, por ello se debe emplear una tinción acidorresistente, en donde se tiñe con
fucsina fenicada en caliente y luego se aplica un colorante de contraste para distinguir a
la espora.
Tinción de flagelo.- los flagelos son estructuras que están constituidos por una
sustancia llamada flagelina, son muy pequeños, ya que su espesor va de 10 a 30 µm, no
son vistos en el microscopio óptico, por ello se tiñen para aumentar su grosor. Se utiliza
ácido tánico como mordente, que precipita sobre los flagelos al teñirse con para-rosa-
anilina y el colorante de contraste usado es el azul de metileno, para teñir el resto de la
célula, no se fija a la flama. Los flagelos de organismos eucariotes, como algas y
protozoarios son más gruesos y se pueden observar con tinciones simples.
Tinción de núcleo.- el núcleo contiene a los cromosomas, los cuales se pueden teñir
con métodos como el de Feulgen o Giemsa-HCL. El HCL reduce la afinidad del
citoplasma (RNA) por el colorante y aumenta la afinidad del núcleo por el mismo.
Observando al núcleo bien teñido y el citoplasma en color claro. También se puede
utilizar una solución diluida de azul de metileno, que tiene afinidad por los ácidos
nucleicos y no se fija a la flama, pues se precipitarían todas las proteínas.
Tinción de cápsula.- este organelo es una cubierta extracelular constituida por

polisacáridos, que se acumula alrededor de la célula, puede ser muy gruesa y no se
combina fácilmente con colorantes y para observarse se utiliza la tinción negativa,
usando la tinta china o nigrosina para oscurecer el fondo.
IX.-AISLAMIENTO DE BACTERIAS
El número de bacterias en el suelo es grande pero los individuos son pequeños y constituyen
menos de la mitad de la masa celular microbiana total. Taxonómicamente las bacterias se
ubican según el Manual de Bergey (1988) en grupos donde se consideran sus característica
fisiológicas, nutricionales y metabólicas, así como el tipo de energía que utilizan para realizar su
metabolismo como podría ser el uso de carbohidratos, nitrógeno, etc.
La morfología celular también sirve para caracterizar a las bacterias, las cuales pueden ser
bacilos, cocos y espirilos (poco comunes en el suelo). Algunos bacilos producen endosporas
que permanecen en estado latente en condiciones adversas, otras especies poseen estructuras
que también se toman en cuenta como son la presencia de flagelos y posición de los mismos.
La cantidad y tipo de bacterias están determinadas en gran medida por el tipo de suelo,
humedad, aireación, temperatura, pH, cantidad de materia orgánica, profundidad, prácticas de
cultivo y estación del año. Por lo general el número de bacterias es mayor en zonas cultivadas
que en zonas vírgenes, ya que el cultivo favorece las condiciones para la proliferación de las
mismas (Alexander, 1990; Sprent, 1990)).
Los géneros de bacterias que aparecen comúnmente en placas de agar con suspensión de
suelo diluido son: Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium,
Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Sarcina, Staphylococcus, Streptococcus y
Xantomonas. Además de Azotobacter, Nitrobacter, Nitrosomona, Aerobacter, Azospirillum, y
Rhizobium.
Los géneros Bacillus y Clostridium son formadores de endoesporas. De todos los géneros antes
mencionados que aparecen en placas de agar son del 5% al 60% de Artrobacter del 7% al 67%
de Bacillus, del 3% al 15% de Pseudomonas, 20% de Agrobacterium y menos del 5% lo
representan los otros géneros.
Figura 8.- Bacteria común que se encuentra en el suelo Pseudomonas sp. (foto de
Alexander, 1990)
Para aislar las bacterias del suelo hay que realizar el método de dilución de suelo serial y
posteriormente sembrar en el medio de cultivo que se requiera para el estudio, incubando a una
temperatura óptima para el desarrollo de estas bacterias. Revisar periódicamente el cultivo
hasta que aparezcan las primeras colonias, las cuales se podrán observar a través del
microscopio óptico utilizando las técnicas del montaje en solución salina, gota pendiente y para
conocer la abundancia de ellas en el suelo, realizar un conteo en placa o bien mediante el
método del hematocitómetro calibrado.
Para conocer su ubicación taxonómica se inicia con la elaboración de una preparación fija por el
método de Gram y luego se realizan los cultivos puros para posteriormente sembrar en medios
específicos para observar que tipo de metabolismo realizan como podría ser la producción de
ácidos que actúan como fermentadores de algunos compuestos carbohidratados,
características que nos ayudan a conocer su ubicación taxonómica.
A continuación se mencionar la composición de algunos medios de cultivo que se utilizan con

mayor frecuencia en el estudio de bacterias (ver cultivos de bacterias Fig. 9). Para la
preparación de los medios se deben disolver las sustancias en agua destilada caliente, añadir el
agar y calentar; normalmente se esteriliza a 15 libras de presión durante 20 minutos. Antes de
que se enfríe el medio se vierte en las cajas Petri junto con el inoculo y se espera a que
solidifique para incubar de 3 a 4 días a la temperatura de 28ºC a 30ºC o en algunos casos
particulares puede variar, para que se desarrollen las colonias bacterias (Mac-Faddin, 1984;
Rickwood, 1997; Singleton, 1997).
MEDIO DE AGAR-EXTRACTO DE SUELO

Agar 15.0 g
K2 HPO4 0.4 g
(NH4)2 HPO4 0.5 g
Mg SO4.7H2O 0.05 g
MgCl2 0.1 g
Fe Cl3 0.01 g
CaCl2 0.1 g
Peptona 1.0 g
Extracto de levadura 1.0 g
Extracto de suelo 250 mL
Agua destilada 750 mL
Se ajusta a pH 7.4
Para ajustar el pH se utiliza NaOH, KOH y HCl 1 N, según se requiera.
MEDIO DE GELOSA SIMPLE

(MEDIO GENERAL)
Extracto de carne 1.0 g
Peptona 1.0 g
Agar-agar 4.0 g
MEDIO NFB SOLIDO (Azospirillum)

Ácido málico 5.0 g
K2HPO4 0.5 g
Fe-EDTA (Solución 1.64%) 4.0 g
Na2 MoO4.2H2 O 0.001 g
MnSO4.2H2 O 0.002 g
MgSO4 .H2 O 0.2 g
NaCl 0.1 g
CaCl.2H2 O 0.026 g
Ajustar a pH 7 con KOH, esterilizar a 15 libras durante 15 minutos, verter a las cajas Petri con el
inoculo e incubar de 2 a 3 días a 32 º C. Son bacilos cortos y ligeramente curvos Gram-
negativos y una movilidad en forma de espiral, se forma una especie de nata en el medio o
película fina blanquecina en la superficie del mismo.
AGAR-EXTRACTO DE LEVADURA DE MANITOL ROJO CONGO

(Rhizobium)
Manitol 10.0 g
K2 HPO4 0.5 g
MgSO4 .7H O 0.2 g
NaCl 0.1 g
CaCO3 3.0 g
Rojo congo (Sol. acuosa al 1 %) 2.5 mL
Agar 20.0 g
Ajustar a un pH de 7 y esterilizar a 15 libras de presión durante 20 minutos, incubar a 28 º C de

4 a 7 días, apareciendo en el medio como colonias blanquecinas sobre el medio rojo.
MEDIO DE CULTIVO PARA Nitrosomonas

MgSO4 .7H2 O 0.1 g
NaHCO3 0.5 g
Na2 HPO4 13.5 g
KH2 PO4 0.7 g
FeCl3 .6H2 O 0.014 g
CaCl2 .2H2 O 0.18 g
(NH4 )2 SO4 0.5 g
Esterilizar a 15 libras de presión durante 20 minutos e incubar a una temperatura de 25-28 º C

durante 24 días. Para la cuantificación de Nitrosomonas se utiliza el reactivo de Griess-llosvaye
que se compone de las soluciones A/B/C.
Solución A.- Disolver 0.6 g de ácido sulfanilico en 70 mL de agua destilada caliente; se enfría la
solución y se agrega 20 mL de HCl concentrado, diluir esta mezcla en 100 mL con agua
destilada.
Solución B.- Agregar 0.6 g de a-Naftilamina en 10-20 mL de agua destilada y agregar 1 mL de

HCl concentrado, diluir y aforar a 100 mL con agua destilada.
Solución C.- Disolver 16.4 g de CH-COONa.3H2 O (acetato de sodio) en 100 mL de agua

destilada. Se guardan por separado las soluciones en frasco ámbar y en refrigeración.
Para la identificación de la presencia de Nitrosomonas se añaden tres gotas del reactivo de

Griess-llosvay al tubo de cultivo, la aparición de un color rojo indica la presencia de nitritos.
MEDIO DE CULTIVO PARA Nitrobacter

El medio del cultivo lleva la misma composición que el cultivo para Nitrosomonas excepto que el
sulfato de amonio es reemplazado por la misma cantidad de nitrito de sodio, con el mismo
tiempo de esterilización, incubación y temperatura. Para la cuantificación se le agregan tres
gotas del reactivo de Griess-llosvay, si el tubo permanece incoloro esto indica la presencia de
nitratos y por lo tanto el tubo será positivo para Nitrobacter.
MEDIO DE CULTIVO PARA Azotobacter

Manitol 2.0 g
K2 HPO4 0.02 g
Ajustar el pH de 7.3 a 7.6
Se colocan 50 mL del medio de cultivo en un matraz de 250 mL, esterilizar y una vez frío
inocular con 0.1 ó 0.2 g de suelo fresco. Se incuba de 25-30 º C en la oscuridad hasta que se
desarrolle una película sobre la superficie para lo cual tendrá que hacerse un observación al
microscopio a partir del tercer día. Ellas son células grandes en forma de bacilos cortos y
gruesos con extremos achatados (levaduriformes). Se deberán purificar en el medio antes
mencionado solo que hay que agregarle 2 g de agar por cada 100 mL con el propósito de
solidificar y en este medio solo crecerán organismos fijadores de nitrógeno, ya que el medio
carece de él.
AGAR DE ENDO
(Coliformes)
Fosfato de potasio 3.5 g
Peptona 10.0 g
Agar 15.0 g
Lactosa 10.0 g
Sulfito de sodio 2.5 g
Fucsina básica 0.5 g
pH final 7.4
Este medio se utiliza para aislar coliformes y otros organismos entéricos. El sulfito de sodio y la
Fucsina básica inhiben el desarrollo de bacterias Gram-positivas; las colonias fermentadoras de
lactosa aparecen de color rosa o rojo, con un brillo metálicos. Se esteriliza a 15 libras de presión
durante 15 minutos y se incuba a 35 º C.
MEDIO DE CULTIVO PARA BACTERIAS FITOPATOGENAS

Sacarosa 10.0 g
Caseína ácida hidrolizada 8.0 g
K2 HPO4 (anhidro) 2.0 g
MgSO4 .7H2 O 0.3 g
Agar 15.0 g
MEDIO DE CULTIVO GENERAL Y PARA MANTENERLOS

Glucosa 20.0 g
CaCO3 20.0 g
Agar 15.0 g
Los dos medios anteriores se esterilizan a 15 libras de presión durante 20 minutos y se

incuba de 28-30 º C.
a b c
Figura 9 .- Cultivos de bacterias aerobias, donde se observan colonias (a), movilidad en
un medio semisólido (b), y crecimiento en medio sólido en un tubo con agar inclinado (c).
X.-AISLAMIENTO DE ACTINOMICETOS
Los actinomicetos se pueden considerar como un grupo de transición entre las bacterias
simples y los hongos, cuyos límites se superponen con ambos. Los actinomicetos son
microorganismos que producen filamentos delgados, ramificados, que se desarrollan en un
"micelio" en todos los géneros del suelo, excepto el género Actinomyces, esté filamento es largo
y puede fragmentarse en unidades pequeñas.
Las hifas o filamentos son muy parecidas a la de los hongos, pero son muy delgados,
generalmente de 0.5 a 1 milimicra de diámetro, Gram-positivos y aerobios facultativos. Muchos
de estos actinomicetos producen esporas asexuales llamadas conidias, aisladas en pares o
formando cadenas y solo algunos producen estructuras especializadas como los esporangios
(Fig. 10). Se les encuentra en suelos ricos en materia orgánica, no toleran pH bajo, ni suelos
húmedos y con baja aireación. Por regla general son saprobios, pero pueden provocar
enfermedades en las plantas, animales domésticos y el hombre ( Quintero, 1984; Alexander,
1990; Van, 1997)).
A pesar de estar asociados con las bacterias su relación con los hongos se manifiestan en tres
propiedades:
* El micelio es externo y ramificado.
* Algunos actinomicetos presentan micelio aéreo.
* El crecimiento en cultivo liquido rara vez produce la turbidez asociada a las bacterias, produce
la formación de filamentos, grumos o esferas.
El reconocimiento de los actinomicetos en placas de agar es relativamente sencillo, si se

incuban un tiempo largo las colonias tienen una consistencia firme y se adhieren al sustrato, en
algunos casos la superficie es pulverulenta pigmentada con esporas aéreas. Las estimaciones
por cuenta en placa proporcionan valores de 105 a 108 organismos/gramo de suelo, en zonas
templadas, tanto en terrenos vírgenes como terrenos cultivados y ellos constituyen del 10 al
50% de la comunidad total.
En el suelo encontramos géneros como Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces (producen

antibióticos), Frankia (fija nitrógeno), Mycobacterium, Micromonospora, Thermonospora,
Chainia, Agromyces y otros. El género Streptomyces es el que produce un olor a tierra mojada
o a terrenos recién arados, característica que se origina por una serie de metabolitos de
estreptomiceto denominados geosminas y es una sustancia formada de sesquiterpenoides,
anillos de carbono insaturado, oxigeno e hidrógeno.
El género Nocardia tiene semejanzas con las bacterias verdaderas ya que en su ciclo de vida
presenta un micelio rudimentario que se fragmenta con facilidad en células cortas semejantes a
bacilos y en medios líquidos forma turbidez.
Figura 10 .- Grupos principales de actinomicetos (Alexander,1990)
A continuación se hará mención de algunos medios de cultivo específicos para actimomicetos:
MEDIO AGAR-GLICEROL-EXTRACTO DE LEVADURA (AGEL)
Glicerol 5.0 mL
KH2 PO4 1.0 g
Agar 15.0 g
Agua 1000 mL
Sol. cristal violeta 5.0 mL (acuoso al 1 %)
Esterilizar a 15 libras de presión por 20 minutos, incubar a 30 º C durante 7 a 14 días, aparecen

colonias brillantes húmedas o de consistencia pétrea con un contorno bien definido sobre el
cual se desarrollan algunas esporas, las colonias pueden ser blancas, grises, cafés, amarillas
verdosas, rojas y casi negras.
MEDIO DE CZAPEK
Agar 15.0 g
NaNO3 2.0 g
K2 HPO4 1.0 g
MgSO4 .7H2 O 0.5 g
KCl 0.5 g
FeSO4 .7H2 O 0.01 g
Sacarosa 30.0 g
Se disuelven las sales y se ajusta a un pH de 7.0, calentar y agregar el agar, esterilizar a 15

libras de presión durante 20 minutos, sembrar la muestra e incubar de 7 a 10 días a una
temperatura de 28 º C.
MEDIO AGAR-GLUCOSA-EXTRACTO DE LEVADURA (AGE)
Glucosa 1.0 g
Agar 2.0 g
Ajustar a un pH de 6.8
Esterilizar a 15 libras por 20 minutos, prepare las placas de agar por la noche y séquelas a una
temperatura de 37 º C, inocule la placa y caliente las placas de agar inoculada a 110 º C
durante 10 minutos, esto inhibe el crecimiento y diseminación de colonias de bacterias y
hongos. Incube las placas a 30 º C durante 5 a 7 días.
XI.- AISLAMIENTO DE HONGOS
En suelos cultivados aireados, los hongos constituyen gran parte de la masa microbiana total;
ellos son abundantes en los horizontes orgánicos de suelos boscosos o selváticos y son los que
llevan a cabo la descomposición en ambientes ácidos.
Los hongos filamentosos poseen un micelio con hifas independientes, pueden ser septadas o
no septadas; con un diámetro consideradamente mayor que los actinomices comunes, poseen
hifas vegetativas y fértiles, que producen esporas sexuales o asexuales (Herrera, 1990).
En medios de cultivo el micelio es incoloro, pero las esporas asexuales están coloreadas
notoriamente, su tamaño, forma de crecimiento y estructura en cultivos ayudan para conocer su
ubicación taxonómica, con relativa facilidad en comparación con las bacterias.
La mayoría de los hongos aislados pertenecen a la clase de los Hyphomycetes y

Zygomycetese donde la clase más abundante en medios de agar es la primera, con micelios
septados y el cuerpo fructífero se presenta como un conidióforo y los Zygomycetes producen
esporas tanto asexuales como sexuales.
La patogenicidad por hongos es una característica que se origina en el suelo, ya que algunas
especies que normalmente son saprofitas pueden invadir tejido vivo y comportarse como agente
patógeno. Pueden ser parásitos facultativos o parásitos verdaderos y permanecer en el suelo
inactivos por períodos largos si la planta hospedera no esta o bien desaparecer por completo
(Moreno, 1988; Mitchell, 1992; Edwards, 1995; Rao, 1995). Solo una pequeña parte de los
hongos del suelo causan enfermedades vegetales y los que la provocan con frecuencia
pertenecen a los géneros: Armillaria, Fusarium, Helminthosparium, Ophiobolus, Phytophtora,
Plasmodiophora, Rhizoctonia, Sclerotium, Verticillium, Thielaviopsis, Phytium y Aspergillus.
Otros son cosmopolitas y sapropios como Mucor y Penicillium, entre otros (Fig. 11).
Fusarium Aspergillus
Figura 11.- Hongos típicos en el suelo

Mucor
Penicillium
Trichoderma
Figura 11.- Hongos típicos en el suelo (continuación)
Existen diversas técnicas en laboratorio para su estudio. El método que se usa frecuentemente
para enumerarlos, es el recuento en placa inoculada con diluciones de suelo en medio de agar
selectivo, este recuento es criticado debido a que no se sabe con certeza el origen de las
colonias que aparecen sobre el agar, ya que pueden ser derivadas de una espora o fragmento
de micelio vegetativo, por ello el conteo de esta manera se debe interpretar con cuidado y
considerar las limitaciones de está técnica.
Otro método utilizado es el del portaobjetos enterrado de Rossi-Cholodny, o vaciar una mezcla
de suelo y agar sobre una caja Petri. (Echegaray, 1993).
Para aislar un hongo patógeno de hojas infectadas y de otros órganos de la planta, se tiene un
método donde se seleccionan varios cortes pequeños de 5 a 10 mm a partir del borde de la
lesión infectada, a fin de que contenga tejido enfermo y tejido al parecer sano. Esos cortes se
colocan en una solución esterilizante de superficie (ver 5.3.), con lo cual la superficie se
humedece y al cabo de 15 a 30 segundos los cortes se toman asépticamente uno por uno a
intervalos de 15 segundos, a fin de que se esterilicen a diferentes tiempos (Agrios, 1996).
Luego los cortes se secan con trozos limpios de papel estéril o se pasan por tres cambios de
agua estéril y por último se colocan sobre el medio de cultivo nutritivo, de tres a cinco cortes por
caja Petri. Los cortes esterilizados en su superficie durante menos tiempo generalmente
contienen al patógeno y a varios contaminantes, mientras que los demás tiempos no permiten el
desarrollo de cualquier microorganismo, debido a la acción del esterilizante de superficie. Los
cortes con tiempos intermedios permiten que sólo el patógeno se desarrolle y forme colonias
puras en el cultivo, luego estás colonias se resiembran asépticamente para su cultivo (Fig. 13).
Figura 12 .- Cultivo de hongos en cajas de Petri con agar sólido
Fuente: Agrios, 1996.
Figura 13 .- Aislamiento de hongos patógenos en plantas.

El hecho de que los cuerpos fructíferos del hongo aparezcan sobre las hojas del hospedero
facilita su recolección y permite durante varios segundos aplicar el esterilizante de superficie
para luego ser sembrado en medio de cultivo o pueden también presionarse en una gota de
agua estéril y diluir sus esporas en forma seriada con agua estéril contenida en pequeños
tubos de ensayo; por último algunas gotas de cada uno de los tubos de dilución seriada se
colocan en un medio nutritivo, a fin de que se desarrollen las colonias libres de contaminantes.
Para aislar hongos patógenos de tallo o fruta, se puede realizar un corte de la parte infectada y
por la parte donde se hizo el corte se toma una pequeña porción con una asa flameada y luego
se coloca directamente en el medio de cultivo ( Mitchell, 1992).
Un método que nos sirve para observar en forma intacta las estructuras de un hongo y nos
facilita su determinación taxonómica es el método del Microcultivo, que se puede realizar de la
manera siguiente en condiciones asépticas.
1.- Dentro de una caja Petri coloque un triángulo de tubo de vidrio y sobre de él acomode un
portaobjetos y cubreobjetos estériles.
2.- Con una espátula flameada corte varios cuadros de agar solidificado y esterilizado en una
caja Petri, de aproximadamente 0.5 a 1 cm, colóquelos encima del portaobjetos, que esta
dentro de la caja Petri.
3.- Inocule en punto con una asa recta flameada en cada esquina del cuadro de agar y luego
coloque el cubreobjetos.
4.- Vierta unos 10 mL de glicerol al 10% en el fondo de la caja Petri, para mantener húmedo el
microcultivo.
5.- Incube a temperatura ambiente hasta notar crecimiento.
6.- Agregar de 3 a 4 gotas de formaldehido al microcultivo para inactivar al hongo por unos
minutos.
7.- En un portaobjetos limpio coloque una gota de azul de algodón, con una pinza de disección
flameada tome el cubreobjetos del microcultivo y colóquelo en el portaobjetos con el colorante .
8.- Observe al microscopio.
Los hongos pigmentados no son fáciles de observar al microscopio, y se recomienda el uso de

KOH al 10% o 30%, para aclarar y observar el color normal de las estructuras.
También se pueden realizar preparaciones semipermanentes de hongos, para realizar con

mayor facilidad su determinación y se utiliza la solución de Lactofenol de Amman, la cual tiene
la siguiente composición:
SOLUCION DE LACTOFENOL DE AMMAN

Fenol 20 mL
Ácido láctico 20 mL
Glicerol 40 mL
Azul de algodón 0.05 g
Todos los medios usados para cultivar hongos deben ser previamente esterilizados, los
matraces no deben llenarse demasiado para evitar que al hervir se derrame el medio, por
ejemplo, preparar medio litro de medio en un matraz de un litro, el cual alcanza para unas 20
cajas de Petri. A continuación se mencionar la composición de algunos medios de cultivo, los
cuales se esterilizan de 15 a 20 minutos a 15 libras de presión.
MEDIO DE ROSA DE BENGALA (MRB-2)
KH2 PO4 ...........................0.5 g

K2 HPO4 ...........................0.5 g
MgSO4 .7H O....................0.5 g
Peptona..............................0.5 g
Dextrosa..........................10.0 g
Extracto de levadura..........0.5 g
Rosa de bengala..............0.05 g
Estreptomicina................0.03 g
Agar................................17.0 g
Agua destilada.............1000 mL
Este medio es preparado y esterilizado en el autoclave durante 15-20 minutos a 15 libras de

presión, sin contener la estreptomicina, ya que ésta es termolábil y debe ser añadida justo antes
de que el agar solidifique. Este es un medio excelente para aislar hongos del suelo y de partes
de plantas. La estreptomicina retarda el crecimiento de las bacterias y el rosa de bengala
disminuye el crecimiento de algunos de los hongos de rápido crecimiento. No es necesario
disolver los ingredientes antes de la esterilización, a menos que se vayan a preparar tubos con
agar inclinado, ya que los ingredientes se disuelven durante la esterilización.
EXTRACTO DE MALTA AGAR (EMA)
Extracto de malta........20 g
Peptona.........................1 g
Dextrosa......................20 g
Agar.............................20 g
Agua destilada........1000 mL
Los hongos que pudren la madera son a menudo cultivados en un medio con la fórmula
modificada de la siguiente manera Este es otro buen medio general y se utiliza en la
determinación de Penicillium y Aspergillus. Los hongos:
Extracto de malta.........25 g
Agar...........................15 g
Agua destilada......1000 mL
PAPA DEXTROSA AGAR (PDA)
Trozos de papas peladas.............200 g

Dextrosa.......................................20 g
Agar.............................................15 g
Agua destilada........................1000 mL
Los trozos de papa se cosen y se hacen papilla y se filtran a través de varias capas de manta
de cielo y se añade el resto de los ingredientes al filtrado. En lugar de los trozos de papa se
puede usar papa para puré instantáneo, y este es un medio favorable para muchos hongos y es
utilizado para cultivar hongos patógenos de plantas.
JUGO DE 8 VERDURAS AGAR (V-8 A)
Jugo V-8.. ..............180 mL

Carbonato de calcio.......2 g
Agar.. ..........................20 g
El medio V-8 agar es un medio excelente general de uso rutinario. La mayoría de los
ascomicetos esporulan bien en él, al igual que los mucoráceos y muchos deuteromicetos. El
medio es ácido (pH de 5.5) y el jugo V-8 puede sustituirse por jugo de tomate o zanahoria.
AGAR-AGUA (AA)
Agar...........................20 g
agua destilada......1000 mL
El medio de agar- agua es útil cuando se requiere obtener un crecimiento micelial escaso, como
cuando se intenta aislar hongos del suelo y plantas, además para inducir la esporulación de
algunos hongos.
Hay muchos colorantes que pueden usarse para teñir hongos como el azul de algodón y floxina
(soluciones acuosas al 0.5%), agregando una o dos gotas a un lado del cubreobjetos para teñir
el material fúngico.
XII.- AISLAMIENTO DE ALGAS
Las algas están presentes casi en todos los suelos, pero no son tan numerosas como las
bacterias, actinomicetos y hongos. Son muy abundantes en hábitats en los cuales la humedad
es adecuada y la luz accesible, su desarrollo en la superficie de tierras vírgenes o cultivadas se
nota frecuentemente a simple vista con una coloración verde sobre la superficie del mismo y es
debido a que poseen clorofila.
Las algas pueden ser unicelulares o pueden presentarse en pequeños filamentos, pero las
cepas del suelo, como grupo, son característicamente más pequeñas y estructuralmente menos
complejas que las algas acuáticas. Las algas del suelo se dividen en Chlorophytas o algas
verdes, Cyanophytas o algas verde-azules, Bacillariophyta o diátomeas y Xanthophyta o algas
verde-amarillas (FIG. 14).
Gomphonema
Nostoc Anabaena
Gonium Pandorina Volvox Ceratium
Figura 14 .- Principales géneros de algas en los suelos
Las algas verdes son el grupo que soporta un pH ligeramente ácido, aunque son numerosas en
ambientes neutros y alcalinos, las diátomeas son menos comunes en suelos ácidos,
desarrollándose mejor en medios neutros y ligeramente alcalinos. Las algas verde-azules son
más sensibles a los medios ácidos (menos de 5.2), y son muy frecuentes en suelos neutros y
calcáreos; por último las algas verde-amarillas son muy raras en medios terrestres (Richards,
1987).
La abundancia de las algas disminuye marcadamente en condiciones adversas y se les puede

encontrar en el orden de cientos de miles o aun de millones por gramo. Su abundancia se
puede determinar preparando diluciones de suelo en agua destilada, inoculando en un medio
líquido o en arena esterilizada que contenga nutrimentos inorgánicos. La presencia de algas se
determina microscópicamente o por examen visual de los crecimientos coloreados, después de
la incubación del medio o la arena durante 4 ó 6 semanas en la luz y la cuantificación se lleva
acabo por el procedimiento del número más probable; encontrando valores para suelos de
cultivo de 10 000 por gramo o en otros tipos de suelo de 100 a 50 000 por gramo.
La enumeración de las algas en el suelo es de valor limitado ya que es difícil interpretar la

importancia de los números de unidades de algas, ya que algunas especies son filamentosas y
dan cifras bajas, otras son unicelulares y cada una representa una célula y hay otras formas
coloniales que producen muchas unidades viables (Alexarder, 1990).
Para aislar las algas presentes en el suelo se mencionan los siguientes medios de cultivo.
MEDIO BRISTOL
NaNO3.......................0.25 g
CaCl2 .......................0.025 g
MgSO4 7H2O...........0.075 g
K2HPO4....................0.075 g
NaCl.........................0.025 g
FeCl........................0.500 g
Agua destilada...............1000 mL
Se prepara el medio y se coloca en tubos de cultivo y posteriormente se esteriliza a 15 libras de

presión durante 20 minutos. Para inocular los tubos, se prepara una dilución de suelo 1:10 ( en
solución isotónica estéril al 0.8 % de NaCl) y de ella se agrega 1 mL a los tubos de cultivo con
medio Bristol con cinco repeticiones, luego se coloca donde haya luz solar a temperatura
ambiente y se deja incubar por 8 semanas, para después observar las muestras al microscopio.
SOLUCION DE CHU
K2HPO4...................0.010 g
MgSO47H2O............0.025 g
Na2CO3 ...................0.020 g
Na2SiO3 .............0.025 g
Citrato Férrico..........0.003 g
Agua destilada.........1000 mL
Ajustar a pH 7
Se realiza el procedimiento antes mencionado para la preparación del medio Bristol.

XIII.- AISLAMIENTO DE PROTOZOARIOS
Los invertebrados más abundantes en el suelo son los protozoarios, son microscópicos a
diferencia de las especies acuáticas cuyo tamaño va de algunos micrómetros hasta uno o más
centímetros y pueden formar quistes de cubierta gruesa en su fase de reposo (cistos). Se
reproducen generalmente en forma asexual por división longitudinal o transversal (Fisión
binaria). Todos los suelos tienen protozoarios, los cuales pueden ser solitarios o vivir en
colonias y ser de vida libre, simbióticos o parásitos, saprofitos y fotosintéticos.
Los protozoarios del suelo se clasifican en base a sus medios de locomoción y se dividen en
tres grupos:
a).-Mastigophora o flageladose que se mueven por medio de flagelos.

b).-Sarcodina o también llamados Rhizopoda o Amiboide, los cuales poseen pseudópodos.
c).-Ciliophora o Ciliados, los cuales presentan cilios durante el estado activo de su vida (Fig.
15).
Figura 15 .- Protozoarios comunes del suelo

La mayoría de los protozoarios depende de la materia orgánica preformada, alimentándose en

forma saprofita, obteniendo sus nutrientes de sustancias solubles tanto inorgánica como
orgánica o por una nutrición fagotrófica caracterizada por una alimentación directa de células
microbianas u otras partículas, encontrándose en gran abundancia cerca de la superficie del
suelo, particularmente arriba de los 15 cm (son escasos en el subsuelo), donde se encuentran
en abundancia las bacterias (Edwards, 1995).
Para el estudio de estos organismos se recomienda el medio líquido o de agar conteniendo

extracto de suelo; estos medios son especiales para amebas y ciliados. También se pueden
utilizar medios con infusiones de paja o estiércol, ricos en bacterias cortas, Gram negativas y no
formadoras de esporas, como medio ideal de cultivo de los flagelados.
Para la enumeración de los protozoarios se emplea la técnica de dilución estándar de suelo, en

la cual se realizan varias diluciones decimales de la muestra de suelo y se inoculan porciones
de ellas en medios ricos en bacterias. Debido a que los protozoarios no forman colonias
diferentes, es necesario basarse en el criterio de crecimiento en placas de dilución, por lo que la
presencia o ausencia del protozoario se puede determinar por examen microscópico de cada
placa y el registro de positivo en cada dilución se usará para estimar el número más probable
de protozoarios en la muestra original. Este método cuantifica tanto células vivas como quistes
y si se quiere conocer el número de quistes, se debe agregar a la muestra de suelo 2% de
ácido clorhídrico por toda la noche, este procedimiento destruye las formas vegetativas pero no
a las latentes ; la diferencia en el conteo hecho antes y después de la adición del ácido,
representa el número de células animales activas. Se tiene reportado que en estos medios los
flagelados son generalmente más abundantes que las amebas pequeñas, mientras los ciliados
son relativamente menos comunes (Alexander, 1990; Burgess, 1990).
A continuación se mencionan algunos medios de cultivo de protozoarios según su medio de

locomoción.
INFUSION DE CHICHARO Y PAJA

(Medio General)
1.- Hervir agua por 10 minutos.
2.- Vaciar 250 mL de agua hervida en otro recipiente y agregar 5 granos de chícharo y hervir
otros 10 minutos.
3.- Dejar enfriar y vaciar en un frasco de boca ancha, mezclando en partes iguales la infusión
de chícharo con la infusión de paja y la muestra de suelo.
4.- Se deja incubar de 6 a 8 días.
Para preparar la infusión de paja se sigue el mismo procedimiento de la infusión de chícharo.

MEDIO DE CULTIVO PARA FLAGELADOS
Peptona o Triptona...........2.00 g
KH2PO4............................0.25 g
MgSO4..............................0.25 g
KCL...................................0.25 g
FeCl...................................trazas
Agua destilada................1000 mL
Esterilizar a 15 libras por 20 minutos, luego se coloca en tubos, se inocula con la muestra y se
incuba de 8 a 10 días a temperatura ambiente.
MEDIO PARA AMOEBA PROTEUS Y A. DUBIA
1.- Colocar una pequeña cantidad de muestra de suelo o extracto de suelo sobre una caja Petri
con un poco de agua estéril.
2.- Agregar 2 o 3 granos de arroz sin coser o tallos de alfalfa hervida de 4 cm de longitud.
3.- Incubar a temperatura ambiente de 7 a 10 días.
MEDIO PARA PARAMECIUM CAUDATUM
Este protozoario crece en frascos cubiertos a los que se les agrega el medio Chalkley, con 7 a
12 gotas de leche sin nata, adicionada semanalmente, debe permanecer lejos de la luz en una
relación de tres partes de medio y una de muestra, se debe incubar de 8 a 10 días.
MEDIO CHALKLEY
NaCL...................0.100 g
Kcl........................0.004 g
CaCl2.....................0.006 g
Esterilizar a 15 libras de presión por 20 minutos y seguir las indicaciones antes mencionadas.
XIV.- AISLAMIENTO DE NEMATODOS
Los nematodos tienen un aspecto vermiforme, la mayoría vive libremente en aguas dulces,
saladas y en el suelo alimentándose de plantas y animales microscópicos. Se sabe que
centenares de ellos viven como parásitos y se alimentan de plantas vivas, en las que producen
una gran variedad de enfermedades (Edwards, 1995).
Los nematodos fitopatógenos son organismos pequeños de 300 a 1000 micrómetros, con
formas de anguila y en un corte transversal se ven redondos, de cuerpo liso no segmentado, sin
apéndices. Sin embargo las hembras de algunas especies se hinchan en la madurez y
adquieren la forma de una pera o cuerpos ovoides (Fig. 16); su cuerpo es más o menos
transparente, cubierto por una cutícula incolora, la cual mudan en sus diferentes etapas
larvarias. Su ciclo de vida lo llevan a cabo en 3 o 4 semanas en condiciones ambientales
óptimas, con temperatura cálida.
La mayoría de los nematodos fitopatógenos viven parte de su ciclo de vida en el suelo, en

forma libre, alimentándose de raíces y tallos subterráneos. La temperatura, humedad y
aireación del suelo afectan su sobrevivencia y se les encuentra a profundidades de 0 a 15 cm
en forma común y algunas veces en profundidades mayores en torno de raíces de plantas
susceptibles, con suelos muy húmedos (Christie,.1986).
Los pocos nematodos que atacan a los órganos aéreos de la plantas llegan en salpicaduras
cuando llueve o cuando se riega, o suben por sí mismos a las superficies húmedas de las hojas
o tallos de las plantas. Estos nematodos parásitos pueden ser Ectoparásitos o Endoparásitos,
pero en forma general se aislan de la raíces de las plantas que infectan o del suelo en torno a
las raíces de las que se alimentan. Ambos grupos pueden ser migratorios, es decir, viven
libremente en el suelo y se alimentan de las plantas sin que se fijen a ellas o se mueven dentro
de la planta, también pueden ser sedentarios, es decir, las especies una vez que han
penetrado en la raíz permanecen fijas a ellas (Eisenback, 1983; Richards, 1987; Werner, 1992).
Los nematodos ectoparásitos incluyen a los nematodos anillos (sedentarios) y a los nematodos
daga, picador y de la raíz escobilla (todos migratorios). Los nematodos Endoparásitos incluyen
a los enquistados, de los cítricos y del nudo de la raíz (todos sedentarios) y a los nematodos
espírale lanza inductor de lesiones, del bulbo y del tallo, perforador, foliar y del achaparramiento
de las plantas (Migratorios).
Los nematodos se pueden aislar de muestras frescas de suelo de 100 a 300 g, mediante los
métodos del Embudo de Baermann, Tamizado y de Centrifugación o de Flotación del azúcar.
La población de nematodos extraída se coloca en un recipiente con poca agua para contarlos
en una alícuota conocida y así proceder a su fijación.
Para su fijación, primero se relajan, para ello se aplica un calentamiento lento progresivo en la
suspensión donde se encuentran hasta que e inmovilizan. Luego se transfiere al fijador que
puede ser formalina al 2.5-5 % y se deja en él, de 5 a 6 días. Posteriormente se deshidrata en
una mezcla de etanol, glicerina y agua destilada (20:1:79), luego se deja evaporar la mezcla y
se añade de una nueva mezcla de glicerina y etanol ( 7:93 ) y por último se le agrega glicerina
pura deshidratada. Al final los organismos se colocan en una cámara desecadora la cual
contiene CaCl2, hasta su montaje.
Cuando los especímenes están deshidratadas, pueden montarse de glicerina pura sobre
portabjetos, cubriéndolos con un cubreobjetos y sellando los bordes con barniz de uñas
transparentes (Alexander, 1990; Agrios, 1996).
Fuente: Agrios, 1996.
Figura 16 .- Forma y tamaño relativo de los nematodo más importantes
METODO DEL EMBUDO DE BAERMANN
Este método consiste en la utilización de un embudo de vidrio bastante grande (de 12 a 15 cm

de diámetro), el cual se encuentra unido a una goma, con una abrazadera colocada sobre el
tubo. El embudo se coloca sobre un soporte y se llena con agua. La muestra de suelo se coloca
en el embudo sobre un papel poroso y resistente a la humedad, sostenido por una tela de
alambre o en un vaso de precipitados sobre el cual se ata un trozo de tela con una liga. El vaso
de precipitado se invierte entonces en el embudo con el trozo de tela y todo el suelo se sumerge
en el agua, dejándolo así durante toda la noche o por varias horas.
Los nematodos vivos se mueven activamente y migran a través de la tela o el papel poroso
hacia el agua y se sumergen hasta el fondo del tubo de goma inmediatamente por arriba del
nivel donde se encuentra la abrazadera. Más del 90% de los nematodos vivos se colectan en el
primer volumen de agua (5 a 8 mL) acarreada desde el tubo de goma y esta muestra se coloca
en una caja Petri para examinarla al microscopio o bien para aislar individualmente a los
nematodos.
Para aislar los nematodos de las plantas, se cortan en trozos muy pequeños y se vierten en el
embudo de Baermann según el método antes descrito.
METODO DEL TAMIZADO
El método por tamizado se basa en el hecho de que cuando una pequeña muestra de suelo, por
ejemplo: 300 g de suelo se mezclan con un volumen mucho mayor de agua ( 2 litros), los
nematodos flotan en el agua, colectándose en tamices con poros pequeños. El procedimiento
es el siguiente:
* Se mezcla la muestra de suelo con el agua.

* Se agita y se deja que repose durante 30 segundos.
* El sobrenadante se cuela en un tamiz de 20 mallas (20 orificios por pulgada), el cual retiene a
los residuos de gran tamaño, pero permite que los nematodos se cuelen hasta el frasco
receptor.
* El líquido que contiene a los organismos se vierte después a través de un tamiz de 60 mallas,
el cual retiene a los de gran tamaño y algunos residuos, pero deja pasar los nematodos más
pequeños y se colectan en otro recipiente.
* Esté último líquido se pasa a través de un tamiz de 200 mallas, el cual retiene a los
nematodos pequeños.
* Ambos tamices de 60 y 200 mallas se lavan de 2 a 3 veces para remover los residuos y los
organismos se colectan en cajas Petri con agua para su examen directo y posteriormente
aislarlos.
METODO DE CENTRIFUGACION O DE LA FLOTACION DEL AZUCAR
El método de centrifugado consiste en mezclar una cantidad de suelo con agua dentro de un
vaso de precipitado, agitar, luego vaciar la mezcla en tubos de centrifuga y se hacen girar a
3000 r.p.m. durante 4 minutos, posteriormente se tira el sobrenadante quedando los nematodos
y residuos en el fondo del tubo, luego se llena el tubo a la mitad con una solución de azúcar
(453 g/L de agua), se tapa el tubo y se agita hasta que se suspenda el sedimento, se llena el
tubo con la solución de azúcar y se centrifuga a 300 rpm durante 30 a 120 segundos. Los
nematodos se mantienen suspendidos en el sobrenadante, el cual se decanta en un tamiz fino
quedando atrapados en él, con agua se elimina la solución azucarada que los cubre lo más
rápido posible y por último los nematodos limpios se vierten en una caja Petri para efectuar una
cuantificación y hacer observaciones.
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Stainer, R.Y., Ingraham, J.L. and M.L. Wheelis. 1986. The Microbial World. Ed. Prentice- Hall.
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Reverté, S.A. España.
Ulloa, M. y Hanlin, H. 1978. Atlas de Micología Básica. Ed. Concepto S.A. México.
Van, E.J.D., Trevors, J.T. and Wellington, H.M.E. 1997. Moderm Soil Microbiology. Marcel
Dekker,Inc. New York. USA.
Werner, D. 1992. Symbiosis of Plants and microbes. Ed. Chapman and Hall.. Germany.
Microbiología de suelo
Entre todas las ciencias que estudian seres vivos, la

Microbiología es, probablemente, la única que se ocupa de
todos los aspectos relativos a los organismos que
constituyen su objeto de estudio. Se trata, por tanto, de una
biología general de los microorganismos, entendiendo por
tales aquellos organismos que son invisibles al ojo humano,
sin ayuda de un instrumento óptico que amplíe su imagen, y
que son o bien unicelulares o bien pluricelulares pero con una
organización biológica muy simple. Por consiguiente, la
Microbiología se ocupa tanto del estudio de las
características inherentes a los microorganismos, tales como
su estructura celular, su bioquímica, su fisiología y su
genética, entre otras, así como sus actividades y sus
interacciones con otros seres vivos y con el medio en el que
habitan. Entre estas últimas se encuentran aquéllas
características que tienen que ver con el papel de los
microorganismos como transformadores de la materia
orgánica e inorgánica y por tanto, con la participación de los
microbios en los ciclos de los elementos en la naturaleza, así
como aquéllas que hacen que muchos de ellos se comporten
como agentes patógenos de animales y vegetales, aspectos
todos ellos de indudable interés en la agricultura.
PAPIME EN216403 ISBN: 970-32-1907-1

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

M. en C. María de Jesús Sánchez

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

M. en C. MARÍA DE JESÚS SÁNCHEZ COLÍN

D.R. © 2004 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

II MATERIAL DE USO COMÚN EN MICROBIOLOGÍA DE 3

III ESTERILIZACION DEL MATERIAL 7

3.1 ESTERILIZACION CON CALOR SECO 7

IV CONSIDERACIONES PARA AISLAR A LOS ORGANISMOS 11

V MEDIOS DE CULTIVO SINTÉTICOS 13

5.1 CULTIVOS PUROS EN PLACA 14

6.1 INOCULACION PRIMARIA 17

VII TECNICAS MICROSCÓPICAS 19

7.1 MONTAJE EN SOLUCIÓN SALINA 19

VIII TINCIONES DIRECTAS 23

8.1 TINCION DE GRAM 23

XII AISLAMIENTO DE ALGAS 43

XIII AISLAMIENTO DE PROTOZOARIOS 45

XIV AISLAMIENTO DE NEMATODOS 49

II.- MATERIAL DE USO COMÚN EN MICROBIOLOGÍA DE SUELOS

La microscopía electrónica amplifica la imagen mediante un haz de electrones en lugar de luz y

El objetivo de menor poder aumenta el objeto 10 veces, el objetivo de mayor poder

Figura 1 .- Partes básicas de un microscopio compuesto de campo claro

2.2.- PROBETAS DE CULTIVO

2.3.- CAJA PETRI

2.4.- PIPETAS BACTERIOLÓGICAS

2.5.- EL ASA Y LA AGUJA PARA INOCULAR

III.- ESTERILIZACION DEL MATERIAL

3.1.- ESTERILIZACION CON CALOR SECO

La transferencia del calor a los materiales debe ser homogénea.

3.1.1.- La Incineración.- es un método de esterilización eficaz, pero su aplicación es muy

3.1.2. La Tindalización.- Este método se utiliza para sustancias que se desnaturalizan a

3.2.- ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN

Entrada del líquido

Filtro de Porcelana Filtro Berkefield

Figura 2.- Equipos de esterilización por filtración

3.3.- ESTERILIZACION CON CALOR HÚMEDO

El esterilizador de Arnold se recomienda solo para medios de cultivo de gelatina, leche o

El uso de la autoclave es el método más recomendado para la esterilización del material de

A continuación se muestra la relación entre la presión de vapor y la temperatura, pero esto

Presión de vapor en Temperatura

Tabla 1 .- Presión de vapor y temperatura del autoclave

3.4.- ESTERILIZACION POR RADIACIONES

Todo el material fuera del envase esterilizador es portador de microorganismos y se debe

3.5.- SOLUCIONES PARA ESTERILIZAR

Los compuestos esterilizantes que se utilizan con mayor frecuencia son:

Solución de hipoclorito de sodio al 5 %.

Alcohol etílico al 95%.

Solución de cloro al 10%.

Cloruro de mercurio en la proporción de 1:1000 en solución acuosa (Tóxico).

Solución Rada. (Cloruro de mercurio 1:1000 en alcohol etílico al 50%) (tóxico).

En estas soluciones se debe enjuagar el material en estudio y posteriormente enjuagarse con

IV.- CONSIDERACIONES PARA AISLAR A LOS ORGANISMOS

Para realizar un diagnóstico de los microorganismos presentes en el suelo o en tejidos

Para ello se deben llevar a cabo los siguientes procedimientos preliminares:

La esterilización del material de cristalería, agua y medios de cultivo, se realiza mediante la

4.2.- PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Algunos microorganismos requieren de compuestos orgánicos específicos como vitaminas,

Tener una mezcla equilibrada de todos los nutrientes.

Los medios de cultivo que se utilizan con mayor frecuencia son:

PAPA-DEXTROSA (PDA).- El cual es un medio general para aislar a la mayoría de hongos.

AGAR-AGUA o AGAR-GLUCOSA.- Se mezcla de 1 a 3 gr. de glucosa en agar - agua, este

Tinción de endospora.- las endosporas son organeros de resistencia de algunas

Tinción de cápsula.- este organelo es una cubierta extracelular constituida por