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RevdeSanid
células
Milit cancerígenas
Mex 2008; 62(4)aJul.-Ago:
través de nanopartículas magnéticas
157-165
Artículo de investigación
* Laboratorio Multidisciplinario de Investigación de la Escuela Militar de Graduados de Sanidad. ** Subsección de Biología Celular y Tisular de la
Escuela Médico Militar. *** Área de Metalografía y Microscopia Electrónica del Laboratorio Central de Pruebas. Dirección General de Industria
Militar. **** Jefe del Servicio de Urología del Hospital Central Militar. ***** Sección de Hematología Especial. Laboratorio Clínico. Unidad Médica
de Alta Especialidad “Gaudencio González Garza”. Centro Médico Nacional “La Raza”, IMSS.
Correspondencia:
Cap 1/o. I.C.E. César Antonio González-Díaz
Escuela Militar de Graduados de Sanidad. Universidad del Ejército y Fuerza Aérea, Cda. de Palomas s/n esq. Periférico, Col. Lomas de San Isidro,
C.P. 11200, México, D.F. Correo electrónico: c.cesar.gonzalez@gmail.com
Conclusión. Los resultados teóricos y experimentales sostienen Conclusion. The theoretical and experimental findings support
el valor potencial de la propuesta técnica como método no invasivo the potential value of the technical proposal as a selective and non
para la ablación focalizada de cáncer a través de RF. invasive ablative method for cancer treatment by radiofrequency.
Palabras clave: termoablación, radiofrecuencia, cáncer. Key words: Thermoablation, radiofrequency, cancer.
de neoplasias malignas a través de un proceso ablativo La visión futurista de aplicación clínica de la presente
por RF. La técnica consiste en marcar células tumorales propuesta consiste en la infusión endovenosa de nanopartí-
malignas con nanopartículas magnéticas unidas a un an- culas magnéticas unidas a un ligando cuya especificidad sea
ticuerpo monoclonal específico (de ahí su naturaleza de característica de un receptor dado en la superficie de células
nanopartícula bioconjugada), el cual reconoce antígenos blanco. Posteriormente radiar la región tumoral con RF e
característicos en la membrana de las células canceríge- inducir un proceso ablativo focalizado en las células marca-
nas blanco. Nuestra hipótesis de estudio considera que das con nanopartículas magnéticas.
las células cancerígenas marcadas con nanopartículas fe-
rromagnéticas al ser sometidas a la influencia de campos Material y métodos
electromagnéticos oscilantes en el rango de las microondas
presentan la inducción selectiva de corrientes eléctricas. La Modelación biofísica y simulación por computadora
intensidad del campo eléctrico generado por dichas corrien- Con el fin de evaluar teóricamente la viabilidad de la
tes se disipa en energía calorífica manifestándose como un técnica propuesta como un proceso ablativo selectivo, se
proceso ablativo focalizado, lo cual permite conservar la estimaron los efectos de biodegradación que la intensidad
viabilidad de células sanas. y frecuencia de campos electromagnéticos en el rango de
El presente reporte describe resultados preliminares del las microondas ejercen en un modelo biofísico propuesto
desarrollo y evaluación de una técnica no invasiva de abla- con y sin la influencia de partículas magnéticas. Se diseñó
ción selectiva por RF de células cancerígenas. Se reportan un modelo biofísico ideal de tejido renal sano y tumoral
estudios teóricos que comprenden simulaciones por compu- con partículas ferromagnéticas (concentraciones de Fe). Se
tadora del efecto ablativo por RF en tejido tumoral con con- simuló por computadora un campo magnético de alta in-
centraciones de nanopartículas ferromagnéticas, así como tensidad y frecuencia al interior de la muestra tejido-partí-
estudios experimentales que consisten en el marcado de cé- culas magnéticas, las propiedades eléctricas de tejido sano
lulas cancerígenas in vitro con nanopartículas magnéticas y y tumoral fueron adaptadas de la literatura. El modelo bio-
anticuerpos monoclonales específicos, posteriormente la físico y la simulación se realizó a través de la técnica de
exposición de dichas células a la influencia de campos elec- modelación multifísica por elemento finito utilizando los
tromagnéticos oscilantes en el rango de frecuencias de las módulos electromagnéticos y de transferencia de calor del
microondas. La técnica comprende el diseño de un equipo software FEMLAB (Comsol Multiphysics®); se calcularon
generador de RF adaptado para radiar direccionalmente y representaron las distribuciones de las líneas de flujo
muestras de células in vitro. La evaluación experimental de magnético, así como el gradiente de temperatura en el teji-
la tecnología consiste en determinar la efectividad de la téc- do con y sin la presencia de partículas magnéticas influida
nica como procedimiento ablativo a través de la observa- por la presencia del campo magnético. La figura 1 repre-
ción de viabilidad celular. senta el modelo biofísico simulado de tejido sano y tumo-
Antena generadora de RF
Concentración de
nanopartículas
ferromagnéticas
Tejido tumoral
Tejido sano
Líneas de flujo
magnético
Figura 1. Modelo biofísico de tejido sano y tumoral con concentraciones de partículas ferromagnéticas distribuidas aleatoriamente en la región
del tejido tumoral. La muestra tejido-partículas ferromagnéticas es influida por la presencia de un campo magnético de alta intensidad y frecuen-
cia.
ral con concentraciones de partículas ferromagnéticas dis- vo D-MEM (Gibco BRL) enriquecido con suero fetal de bo-
tribuidas aleatoriamente en la región del tejido tumoral. La vino (decomplementado) al 30% y una mezcla de antibiótico
muestra de tejido-partículas ferromagnéticas es influida por de anfotericina, gentamicina y amikacina, los cultivos perma-
la presencia de un campo magnético de alta intensidad y necieron a 37 ºC de temperatura y 5% de CO2, por 24 horas y
frecuencia. después de este tiempo se cambió el porcentaje del suero al
10% y cada tres días se cambió el medio para expandir y
Instrumentación biomédica formar la monocapa de células.
Se diseñó una cámara de exposición a RF para cultivos Células de leucemia. Se utilizaron células de pacientes
celulares (con opción de utilizarse en especies menores de con Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) procedentes del
experimentación biomédica). El diseño consistió en la adap- Centro Médico Nacional “La Raza” (IMSS), México, D.F.,
tación de un generador de microondas de tipo industrial las cuales se obtuvieron mediante aspirado de médula ósea.
(Magnetrón - Marca: Daewoo, Modelo 2M218 JF, 2.45GHz Estas muestras fueron inicialmente empleadas para la inmu-
a 1KW) a una cámara de acrílico cúbica expresamente dise- notipificación por citometría de flujo y posteriormente se
ñada para alojar tubos de ensayo de 45 mm de longitud por emplearon en nuestro laboratorio como un control positivo.
10 mm de diámetro. El diseño del sistema contempla que en
los citados tubos de ensayo se pueda depositar un volumen
aproximado de 1 mL de células en suspensión para ser so-
metidas a radiación de RF. El sistema se adaptó para que la
antena radiara directamente en la parte inferior del tubo de
ensayo. La figura 2 ilustra la apariencia de la cámara de ex-
posición a RF para cultivos celulares.
Las células se marcaron con el anticuerpo monoclonal anti- carboxilos de las perlas magnéticas para producir derivados
CD10 conjugado con Fluoresceína (FITC) y posteriormente altamente reactivos de la O-acilurea y enseguida reaccionar
se acoplaron a las nanopartículas magnéticas. Un análisis de rápidamente con los grupos amino del ligando. La reacción
microscopia confocal se utilizó para demostrar la funciona- genera un enlace covalente que garantiza el acoplamiento
lidad y especificidad del anticuerpo conjugado a la nano- estable de la nanopartícula al anticuerpo. El protocolo de
partícula. acoplamiento consiste en colocar las nanopartículas fluid-
MAG-ARA en un búfer (MES) a una concentración de 0.1
Inmunotipificación celular M y un pH de 5, posteriormente se adicionan 250 μL de
Una vez establecido el cultivo primario de las células de carbodimida y se incuba durante 10 min, de esta forma se
carcinoma renal se realizó la tipificación de las células me- activan los grupos funcionales de la matriz de polisacárido.
diante la técnica de citometría de flujo. Dicha técnica em- A continuación se realizan dos lavados con MES emplean-
plea una marca fluorescente FITC acoplada a un anticuerpo do un separador magnético y se adiciona el anticuerpo para
monoclonal (anti-CD10), el cual se une a la membrana de incubar durante dos horas a temperatura ambiente. Final-
células cancerígenas, lo que permite identificar de manera mente se procede a lavar las nanopartículas unidas a su li-
específica la población de células tumorales en cada cultivo gando pero ahora empleando un búfer salino de fosfatos. La
establecido. Para el estudio nos apoyamos con el equipo de figura 4 muestra la representación esquemática del princi-
citometría de flujo, modelo FacsCalibur (Becton Dickinson. pio de enlace covalente vía grupos carboxilos de una nano-
San José California, USA) utilizando el programa Cell-Quest. partícula magnética del tipo fluidMAG-ARA y su ligando
El equipo se encuentra ubicado en la Sección de Hematolo- dado por el anti-CD10, tal acoplamiento fue practicado en
gía Especial del Laboratorio Clínico de la Unidad Médica este estudio.17
de Alta Especialidad “Gaudencio González Garza” del Cen-
tro Médico Nacional “La Raza”. Microscopia
Con el objetivo de evidenciar físicamente el complejo
Acoplamiento nanopartículas-anticuerpo bioconjugado nanopartícula-anticuerpo unido a la membra-
Las nanopartículas magnéticas que se utilizaron en este na de células cancerígenas, se utilizó microscopia confocal
estudio fueron del tipo fluidMAG-ARA (Chemicell GmbH. y microscopia electrónica de barrido; para el efecto se em-
Berlín, Alemania) cuyo diámetro aproximado es de 300 na- pleó el microscopio confocal marca Carl-Zeiss, modelo LSM
nómetros y poseen una propiedad superparamagnética. Las 5 Pascal que se ubica en el Laboratorio de Histología de la
nanopartículas tienen un núcleo de magnetita (Fe3O4) re- Escuela Médico Militar, Universidad del Ejército y Fuerza
cubiertas de un polisacárido con grupos funcionales carboxi- Aérea, así como el microscopio electrónico de barrido mar-
lo. El ligando del bioconjugado corresponde al anticuerpo ca JEOL, modelo JSM-6490LV que se ubica en el área de
monoclonal anti-CD10, el cual contiene un grupo funcional metalografía y microscopia electrónica del Centro de Inves-
amino; ambos grupos funcionales son activados por medio tigación Aplicada y Desarrollo Tecnológico de la Industria
de carbodimida. La carbodimida reacciona con los grupos Militar (CIADTIM). Este último microscopio nos permitió
a su vez reconocer físicamente las nanopartículas magnéti-
cas y comprobar la presencia de Fe en las mismas, para el
efecto se utilizó el espectrómetro de energía dispersiva mar-
ca Oxford Instrument INCAX-SIGHT, modelo 7573, aco-
plado al microscopio electrónico mencionado.
O
|| Procedimiento ablativo
NH - C -
Muestras de leucocitos in vitro obtenidos mediante aspi-
O rado de médula ósea fueron marcados con nanopartículas
||
Fe3O4
NH - C -
magnéticas previamente acopladas al anticuerpo CD-10
como se describe en la sección “acoplamiento nanopartícu-
las-anticuerpo”. Muestras adicionales de leucocitos fueron
mantenidas sin acoplamiento de nanopartículas magnéticas.
Ambos tipos de muestras fueron expuestas a la influencia
Fe3O4
de RF a través de la cámara descrita en la subsección “ins-
trumentación biomédica”. Los tiempos de exposición fue-
ron tres ciclos de 100 seg segmentados en 10 seg de exposi-
ción por 90 seg de relajación (3*10/90). Una vez realizada
la ablación con RF se realizaron pruebas de viabilidad celu-
Figura 4. Representación esquemática del principio de enlace covalente
lar mediante la exclusión de tinción con azul tripano, dicha
vía grupos carboxilos de una nanopartícula magnética del tipo fluidMAG- prueba tiñe las células que han perdido la integridad de su
ARA y su ligando dado por un anticuerpo monoclonal (anti CD-10).17 membrana.
Max: tx
x10
1.2
1.1 1.1 6
1 1
0.9 0.9
0.8 No se presenta densidad 0.8
No se presenta
0.7 5
0.6
de corriente inducida en 0.7 incremento del
0.6
0.5 la región tumoral 0.5 gradiente de
0.4 0.4 4
0.3 0.3 temperatura en la
0.2 0.2 región tumoral
0.1 0.1
0 Líneas de densidad 0 3
0.1 de corriente inducida 0.1
0.2 0.2
0.3 0.3 2
0.4 0.4
0.5 0.5
0.6 0.6
0.7 0.7 1
0.8 0.8
0.9 0.9
-1 -1
1.1 1.1 0
1.2
-2 -1.8-1.6 -1.4 -1.2 -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 -2 -1.8-1.6 -1.4 -1.2 -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
Min: 0
A B
Max: tx
x10
1.2 1.2
1.1 6
1.1 1
1 0.9
0.9 Mayor concentración de 0.8 Incremento del
0.8 0.7 5
0.7 la densidad de corriente 0.6
gradiente de
0.6
0.5 inducida en la región 0.5 temperatura en la
0.4 0.4 4
0.3 tumoral 0.3 región tumoral
0.2 0.2
0.1 0.1
0
Líneas de densidad 0 3
0.1
0.1 de corriente inducida 0.2
0.2 0.3
0.3 0.4 2
0.4 0.5
0.5 0.6
0.6 0.7
0.7 1
0.8 0.8
0.9 0.9
-1 -1
1.1 0
1.1 1.2
-2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2
Min: 0
C D
Figura 5. Simulación de la distribución de la densidad de corriente inducida en tejido renal sano y tumoral: A) Sin la influencia de nanopartículas
magnéticas. B) Con la influencia de nanopartículas magnéticas. Simulación del gradiente de temperatura en tejido renal sano y tumoral: C) Sin la
influencia de nanopartículas magnéticas. D) Con la influencia de nanopartículas magnéticas. Sólo se muestra la mitad geométrica del modelo como una
técnica de optimización de recursos computacionales.
Figura 7. Aglomeración
de nanopartículas que
presentan fluorescencia
acopladas a células can-
cerígenas. A) Célula re-
nal cancerígena. B)
Blastos obtenidos me-
diante aspirado de médu-
la ósea (imágenes adqui-
ridas a X1,000 aumentos
con el microscopio con-
focal de la Escuela Mé-
A B dico Militar).
Cuadro 1. Resultados de viabilidad de células leucémicas después de la exposición a RF con y sin acoplamiento de nanopartículas magnéticas.
sencia de complejos bioconjugados anticuerpo-nanopartí- calor a través de las propiedades termoconductivas tisula-
cula magnética adheridos a la membrana de las células can- res; en este sentido, el gradiente de temperatura se incre-
cerígenas. menta en la región tumoral como una función de la con-
La figura 8 muestra una fotografía que permite identifi- centración de Fe, lo cual a su vez se puede interpretar como
car las nanopartículas ferromagnéticas utilizadas en este estu- un efecto ablativo focalizado.
dio. Las imágenes se obtuvieron con el microscopio electró- Los estudios realizados con microscopia confocal y mi-
nico de barrido del CIADTIM. Las nanopartículas fueron croscopia electrónica de barridos en células renales cancerí-
colocadas en una base de cobre y recubiertas con una fina genas y en blastos obtenido mediante aspirado de médula
capa de oro. Para su análisis se utilizó un aumento de ósea, nos permiten inferir la presencia de complejos bio-
X14,000 a 10KV. El diámetro de las nanopartículas obser- conjugados anticuerpo-nanopartícula magnética adheridos
vadas es del orden de 300 nm. Un análisis espectroscópico a la membrana de las células en estudio. Sin embargo, dicha
de una porción del campo mostrado en la figura 8 reveló un evaluación basada en imágenes representa una interpreta-
contenido importante de Fe. La figura 9 muestra un espec- ción cualitativa del efecto de acoplamiento, por lo que el
tro de energía dispersiva correspondiente a las nanopartícu- presente estudio aún requiere completarse con una técnica
las empleadas; se observa que la presencia de Fe es evidente de evaluación cuantitativa que relacione la cantidad de na-
y significativa. nopartículas empleadas en el protocolo de acoplamiento en
La observación por microscopia electrónica nos permitió una población celular determinada y en función de tal refe-
identificar la presencia de nanopartículas de Fe embebidas rencia estimar la proporción relativa de nanopartículas mag-
en la membrana de células cancerígenas, las cuales fueron néticas adheridas a la membrana celular.
sometidas al protocolo de acoplamiento previamente des- Los análisis con azul tripano realizados después de la
crito. Para el efecto se empleó el microscopio electrónico de exposición de cultivos celulares a RF arrojan un decremen-
barrido del CIADTIM; se utilizó un aumento de X10,000 a to en la viabilidad de las células marcadas con nanopartícu-
5KV. La figura 10 muestra una fotografía de las nanopartí- las magnéticas con respecto a las que permanecieron sin
culas ferromagnéticas de un diámetro aproximado de 300 marcar. Tal decremento se relaciona a una consistente dife-
nm embebidas en la periferia de la membrana de un leucoci- rencia en la temperatura alcanzada en ambas muestras de
to. La imagen representa la viabilidad experimental de la cultivos celulares, lo anterior indica que la viabilidad celu-
unión del bioconjugado nanopartícula-anticuerpo al antíge- lar está asociada a las propiedades termoconductivas de cé-
no específico en la membrana celular. lulas marcadas con las nanopartículas magnéticas. Tales
Posterior al proceso de ablación por RF, los estudios de propiedades son a su vez son una función de la conductivi-
tinción con azul tripano permitieron identificar una diferen- dad eléctrica que presenta el Fe. Así, la intensidad del cam-
cia en la viabilidad celular de aproximadamente 5% menor po eléctrico generado por las corrientes inducidas promueve
en las células marcadas con nanopartículas magnéticas con un incremento en el gradiente de temperatura principalmen-
respecto a las que permanecieron sin marcar. El incremento te en la vecindad de las nanopartículas acopladas, lo cual a
en temperatura de las células marcadas fue aproximadamente su vez se refleja como un proceso ablativo selectivo en la
22% mayor con respecto a las células sin marcar. El cuadro vecindad de las membranas de células marcadas con tales
1 muestra los resultados de viabilidad de células leucémicas nanopartículas.
después de la exposición a RF.
Conclusión
Discusión
La simulación por computadora de la exposición a RF de
La simulación biofísica por computadora de la exposi- tejido renal tumoral con concentraciones de nanopartículas
ción de tejido renal sano y tumoral a RF produjo una ma- ferromagnéticas mostró desde el punto de vista teórico la
yor inducción de corrientes en la región tumoral. Dicho pertinencia de la técnica propuesta como un método alterno
comportamiento se explica por la mayor conductividad en el tratamiento del cáncer. Los resultados experimentales
eléctrica que presenta el Fe con respecto al material bioló- indican que el protocolo de acoplamiento empleado es ade-
gico. La intensidad del campo eléctrico generado por las cuado y específico para efectos de marcar selectivamente
corrientes inducidas en el tejido se disipan en forma de células cancerígenas. La exposición a RF de células cance-
rígenas in vitro con y sin acoplamiento de nanopartículas 9. Roy-Choudhury SH, Cast JE, Cooksey G, Puri S, Breen DJ. Early
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