2° Congreso Nacional de Química Médica Hernández-Guevara y col.

ELECTROFORESIS UNICELULAR (ENSAYO COMETA)

COMO BIOINDICADOR DE ANTIGENOTOXICIDAD
INDUCIDA POR AMPHIPTERYGIUM ADSTRINGENS

1 1 1
Carolina Hernández Guevara , Ana Ruth Díaz Olguín , Cadena Eva, Edith Moreno , Lourdes Elvia
2 3 4 1
Ruiz Flores , Sandra Díaz-Barriga Arceo , Eduardo Madrigal-Bujaidar . Facultad De Química-
2
Universidad Autónoma De Querétaro, Centro De Estudios Académicos Sobre Contaminación
Ambiental-Universidad Autónoma De Querétaro Centro Universitario Cerro De Las Campanas S/N,
3
Querétaro, Qro. Cp 76010. Eruizf2000@Yahoo.Com.Mx, Facultad De Estudios Superiores
4
Cuautitlán-Unam, Escuela Nacional De Ciencias Biológicas-IPN.

RESUMEN

El cáncer humano, se asocia con la forma de vida, antecedentes infecciosos,

exposición a radiaciones, por lo que las investigaciones instrumentan acciones
preventivas en la búsqueda de tratamientos de origen natural como el uso de plantas.
Cuachalalate (Amphipterygium adstringens) es un árbol, su corteza se utiliza en medicina
tradicional para el tratamiento de cicatrizaciones, trastornos gastrointestinales y en cáncer
de estómago principalmente. Es así que el objetivo de esta investigación es evaluar la
actividad antigenotóxica del cuachalalate (Amphipterygium adstringens) en linfocitos
humanos, utilizando el ensayo de Electroforesis Unicelular (ensayo cometa), método que
evalúa el daño al ADN celular y es útil para estudios de genotoxicidad y antigenotoxicidad.
En esta investigación, el estudio genotóxico determinó la inocuidad del extracto acuoso de
cuachalalate (EA) a diferentes concentraciones y tiempos de incubación (37°C). Y en el
antigenotóxico; el efecto del extracto sobre los linfocitos dañados con peróxido de
hidrógeno. Las concentraciones y tiempos con mayor efecto se estudiaron también con
extracto hexánico de cuachalalate (EH), para evaluar efecto al ADN en las células de
estudio se utilizó el ensayo cometa mediante la técnica descrita por Singh et al., (1988).
Los resultados obtenidos indican que el EA per se no es genotóxico a los linfocitos
(Dunnett, á<0.05) y produce un efecto antigenotóxico dependiente de la concentración, el
daño es menor a medida que aumenta la concentración del EA y puede estar asociado a
la membrana nuclear. El EH al 0.2% es genotóxico y en el ensayo antigenotóxico se
potencia el efecto del peroxido hidrógeno.

Palabras clave: Cuachalalate, ensayo cometa, genotoxicidad, antigenotoxicidad

INTRODUCCIÓN

El cáncer después de las enfermedades cardiovasculares, representa la segunda

causa de muerte en México; el 66% de los casos corresponden a la población femenina y
el 34% restante al sexo masculino, se han reportado 50 mil defunciones anuales (Registro
Nacional Histopatológico de Neoplasias Malignas, RHNM, 2003), por lo que se considera
un problema de salud pública. Por lo que deben desarrollarse investigaciones dirigidas a
instrumentar acciones preventivas específicas en la búsqueda de tratamientos menos
agresivos y de origen natural especialmente de plantas.

El valor de las plantas medicinales está dado por sus constituyentes químicos,
generalmente sus metabolitos secundarios, los cuales son responsables de los efectos
fisiológicos que producen (Martínez, 1991).
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Entre las plantas usadas en medicina tradicional se encuentra Amphiptrerygium

adstringens, árbol comúnmente conocido con el nombre de cuachalalate, del cual es su
corteza a la que se le atribuyen diversas aplicaciones terapéuticas, principalmente úlceras
gástricas y cáncer de estómago. El cáncer de estómago es la segunda neoplasia más
frecuente en el mundo, ocupa el segundo lugar como causa de muerte (RHNM 2003).

La gran aceptación del cuachalalate por la población ha originado el interés por

diferentes grupos de investigación, por lo que la presente investigación forma parte del
proyecto multidisciplinario “Estudio de la capacidad anticancerígena del cuachalalate
(Amphipterygium adstringens) a través de la evaluación de su acción antigenotóxica y la
identificación de los principios activos involucrados en ésta”, coordinado por la Dra.
Sandra Díaz Barriga de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM., los cuales
han identificado los componentes principales de su extracto orgánico y acuoso para
determinar los componentes involucrados en los efectos terapéuticos, centrándose
específicamente en su capacidad antigenotóxica y su posible mecanismo de acción. Al
ser el extracto acuoso la forma más común de consumo en la población, es elemental
evaluar sus efectos genotóxicos y antigenotóxicos que apoyen la efectividad de este
extracto en la terapéutica contra el cáncer.

La genotoxicidad es el resultado nocivo de la interacción de agentes químicos o

físicos con el aparato hereditario de la célula, y se manifiesta como alteraciones genéticas
y/o cambios en el número o estructura de los cromosomas, que pueden incorporarse en
generaciones celulares subsecuentes llamadas mutaciones (Clayson, y Grant, 1992). La
determinación genotóxica ya sea en agua, aire, alimentos, contaminantes y compuestos
naturales con fines terapéuticos, resultan una herramienta útil para la identificación de
riesgos a la salud humana y poder desarrollar medidas de prevención y control ya que las
mutaciones que alteran la expresión génica se consideran como un rasgo común de todos
los cánceres, aunque muchas de ellas pueden ser ventajosas o neutras y no ocasionar
manifestaciones patológicas (Cortinas y Aguirre, 1990). Las alteraciones genómicas
asociadas con el cáncer pueden implicar cambios a pequeña escala, como la sustitución
de un solo nucleótido, o a gran escala, como reordenaciones cromosómicas, ganancia o
pérdida de cromosomas o incluso la interacción de genomas virales en el cromosoma.

Existen una gran variedad de bioensayos útiles para evaluar genotoxicidad, entre
ellos se encuentra el de electroforesis unicelular en gel, llamado comúnmente ensayo
cometa, el cual es un método microscópico fluorescente rápido y muy sensible, que
permite examinar el daño al ADN en células de forma individual, este ensayo tiene
importantes aplicaciones en el ampo de la genotoxicidad por lo que puede emplearse
también en ensayos de antigenotoxicidad.

El fundamento de este ensayo para detectar daños al ADN producidos por un

rompimiento simple o doble en la cadena, daño oxidativo inducido y entrecruzamiento de
ADN-ADN/ADN-proteína, se basa en la fragilidad que poseen los sitios dañados; al ser
sometidos a un pH superior a trece y su comportamiento en una electroforesis. Los
fragmentos de ADN, producto de la acción de la sustancia a probar, afectados por el pH
alcalino, migran a una velocidad diferente del resto del material nuclear formando la cola
del “cometa”, entre más larga sea esta porción mayor será el daño ocasionado al ADN.

Es así, que la presente investigación permitirá estudiar in vitro el posible efecto

antigenotóxico del extracto acuoso del cuachalalate
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MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizó una corteza de cuachalalate obtenida en un mercado local de la ciudad

de Querétaro, la cual se analizó por electroforesis capilar, para comprobar su identidad
por medio de la presencia de los constituyentes principales característicos de esta
especie.

El extracto de cuachalalate al 2% se preparó el día de cada experimentación

depositando 0.1 g de corteza de cuachalalate triturada en 5mL de agua tridestilada la cual
fue calentada a ebullición y se mantuvo tapada y protegida de la luz en reposo durante 30
minutos. Al término de este tiempo se filtró con una gasa estéril, y se mantuvo a
temperatura ambiente hasta su uso.

El extracto hexánico de cuachalalate se obtuvo de 17.2g de corteza con dos

porciones de 300 mL de hexano y por reflujo a 46°C durante una hora. El extracto
obtenido se disolvió con 7 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) concentrado y se conservó en
refrigeración a 4°C.

Las muestras de sangre utilizadas fueron de donadores clínicamente sanos,

obtenida por punción venosa y colectada en tubos con EDTA como anticoagulante. El
aislamiento de linfocitos se realizó de acuerdo al inserto del reactivo Histopaque-1077
Sigma®. A la suspensión celular obtenida, se le determinó el número de células/mL y el
porcentaje de viabilidad celular utilizando una cámara de Neubauer y como colorante de
exclusión, azul de tripano 0.4%. El número de células viables por mL promedio empleado
fue de 5 x 105, con una viabilidad promedio de 96%.

Se estudio la actividad genotóxica y antigenotóxica del extracto acuoso de

cuachalalate. Para el ensayo genotóxico se estudiaron las concentraciones de 0.02, 0.2 y
2 % (p/v) cada una a los tiempos de 30, 60 y 90 min. Utilizándose como testigo positivo
peróxido de hidrógeno 60 µM y como testigo negativo solución amortiguadora de fosfatos
(PBS) a pH 7.4. El volumen total en cada muestra se ajustó de modo que todas tuvieran
igual concentración celular. Al término de cada tiempo de incubación, las células se
lavaron 3 veces con PBS y por centrifugación a 1500 rpm durante 10 min. Posteriormente
se determinó la viabilidad celular y se procedió a realizar la técnica de ensayo cometa,
descrita por Sing y colaboradores en 1988.

En el ensayo antigenotóxico, los linfocitos fueron tratados con peróxido de

hidrógeno 60 µM durante 30, 60 y 90 min a 37°C, al término de la incubación fueron
lavados 3 veces con PBS y por centrifugación a 1500 rpm durante 10 min.

Posteriormente, los linfocitos fueron expuestos al extracto acuoso y hexánico de

cuachalalate a las concentraciones de 0.02, 0.08, 0.2, 1 y 2 % (p/v) e incubados al mismo
tiempo inicial, utilizando como testigo positivo peróxido de hidrógeno 60 µM y como
testigos negativos PBS, DMSO (0.02%) y extracto de cuachalalate al 0.2% Al término de
cada tiempo de incubación, las células se lavaron 3 veces con PBS. Posteriormente se
determinó la viabilidad celular y se procedió a realizar el ensayo cometa.

Para visualizar el daño al ADN, las preparaciones se observaron usando un

microscopio de fluorescencia equipado con un filtro de excitación de 515-560 nm y un
filtro de barrera de 590 nm, usando un micrómetro ocular y el objetivo de 40X., la
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evaluación se realizó observando 100 nucleoides por cada preparación y midiendo la

longitud de la cauda (X) y el diámetro celular (Y).

Después de leer las laminillas, se removió el cubreobjetos y se fijaron nuevamente

con etanol absoluto se dejaron secar y se guardaron a temperatura ambiente.

La longitud y el diámetro de cada una de las 100 células observadas por tratamiento, se
analizaron estadísticamente con el análisis de comparaciones múltiples de Dunnet con
á<0.05 entre los grupos experimentales.

RESULTADOS

En la figura 1 se muestra el electroferograma donde se observa la presencia de los

ácidos 3á-hidroximasticadienónico y masticadienónico. Como se puede observar en la
figura 2 el daño al ADN del los linfocitos fue directamente proporcional a la concentración
del peroxido de hidrógeno de tal manera que en las concentraciones mayores el ADN
estaba totalmente fragmentado.

Figura 1. Electroforesis capilar (Electroferograma), a partir de una infusión de cuachalalate en cloroformo. Las
flechas indican la presencia de los ácidos 3á-hidroximasticadienónico (derecha) y masticadienónico
(izquierda).

Figura 2. Inducción de daño genotóxico con peróxido de hidrógeno, Relación longitud/diámetro (L/D)
promedio a las diferentes concentraciones y tiempos de incubación. (*ADN con alta fragmentación)
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El extracto acuoso de cuachalalate fue inocuo a las concentraciones estudiadas

(Fig. 3). La viabilidad celular se inhibió en al incrementar las concentraciones del extracto
hexánico lo cual no ocurre con el extracto acuoso, como se observa en la figura 4.

Figura 3. Relación L/D promedio obtenido en el ensayo genotóxico.

Fig. 4. Porcentaje de viabilidad obtenido en los diferentes tratamientos en el ensayo antigenotóxico.

Los resultados en el ensayo antigenotóxico que se muestran en la figura 5 indican

que el extracto hexánico ejerce un efecto que potencializa el daño genotóxico del peroxido
de hidrógeno (Fig.6), mientras que con el extracto acuoso se observa una disminución del
daño al ADN, representado por la longitud de lo largo del cometa (Fig. 7). En el tabla I se
muestran los resultados del análisis estadístico con la prueba de Dunnett, comparando los
tratamientos con el testigo negativo de PBS.
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*células sin lisar, cromatina uniforme.

Figura 5. Relación longitud diámetro para el ensayo antigenotóxico.

Tabla I. Resultados del análisis estadístico de Dunnett (á<0.05 ) para el ensayo antigenotóxico.
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DE F

Figura 6. Imágenes del ADN de linfocitos expuestos a : A) PBS, B) DMSO, C) Extracto acuoso 2%, D)
Extracto hexánico 2%, E) Peróxido de hidrógeno 60 µM y F) Extracto hexánico 0.2% posterior a la exposición
con peróxido de hidrógeno.

Figura 7. Imágenes del ADN de linfocitos expuestos a : a) PBS sin ser sometidos a lisis celular, b) Peróxido
de hidrógeno 60 µM c, d, e, y f) Extracto acuoso 0.02%, 0.08%, 0.2% y 2% respectivamente, posterior a la
exposición con peróxido de hidrógeno, en e la imagen superior fue la encontrada con mayor frecuencia y en f ,
la imagen inferior parece tener una membrana, esta imagen fue encontrada con menor frecuencia con
respecto a la superior.
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DISCUSIÓN

En el estudio químico realizado a la corteza de cuachalalate se pudieron identificar

los ácidos 3á-hidroximasticadienónico y masticadienónico como lo menciona Rosas en el
2005, identificando estos ácidos como los compuestos mayoritarios de la corteza lo que
permiten identificarla.

Las concentraciones de peróxido de hidrógeno citadas por Mckelvin-Martin et al.,

en 1993 para sangre periférica, resultaron ser altamente dañinas para los linfocitos, lo
cual se debe a que estas células al ser aisladas de la sangre se encuentran más
expuestas.

El extracto acuoso de cuachalalate resultó inocuo para los linfocitos humanos a las
diferentes concentraciones estudiadas como se observa en la figura 3, al aplicar el
estadístico de Dunnett (á<0.05) se encontró que no existen diferencias significativas con
respecto al testigo negativo (PBS), esto difiere con los estudios realizados para el extracto
hexánico, el cual ha demostrado citotoxicidad dependiendo de la concentración como lo
cita Giner-Larza et al., (2002), atribuyéndo este daño al ácido 3á-hidroximasticadienónico
ya que suprime la producción de leucotrienos B4 de los leucocitos polimorfonucleares y al
ácido masticadienónico reportado citotóxico desconociendo su mecanismo de acción, por
lo que inocuidad del extracto acuoso posiblemente se deba a la ausencia de estos ácidos,
los cuales no se han identificado en el extracto acuoso (Rosas,2005), este efecto se
observa claramente en las figura 6 (C y D).

En el ensayo antigenotóxico al evaluar el extracto hexánico y el acuosos a la

mismas concentraciones (Fig.3) se observa que la viabilidad celular en el extracto
hexánico disminuye al aumentar la concentración llegando a valores menores al inducido
por el peróxido de hidrógeno lo que corrobora su potencial citotóxico observado por
Jiménez (2004). Este efecto fue reportado también con la ifosfamida (Martínez y Flores,
2003). En la imagen mostrada en la figura 6-F se observa claramente que el daño es
inclusive mayor al inducido por el peróxido de hidrógeno (Fig. 6 E).

El extracto acuoso de cuachalalate induce un efecto protector a los núcleos

dañados previamente con peróxido de hidrógeno, los cuales se recuperan al incrementar
la concentración, como se puede observar en la figura 7 (c, d y f), donde posiblemente
exista una recuperación de la membrana nuclear, lo que facilita la integridad del ADN, ya
que como se observa en la figura 6; A, la membrana no se observa uniforme como en los
linfocitos dañados previamente con el peroxido de hidrógeno (Fig. 7; e y f).

CONCLUSIONES

1.- La corteza con la que se realizó el estudio es cuachalalate ya que se identificaron los
compuestos mayoritarios; ácidos 3á-hidroximasticadienónico y masticadienónico.

2.-El extracto acuoso es inocuo para los linfocitos humanos y ejerce un efecto
antigenotóxico a todas las concertaciones estudiadas.

3.- El extracto hexánico es genotóxico desde la concentración de 0.2% y potencia su

efecto en linfocitos expuestos a peróxido de hidrógeno 60 ìM.
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4.- Posiblemente en el efecto protector del extracto acuoso, esté involucrada la membrana
nuclear.

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