I INTRODUCCIÓN:

Para estudiar las características de los microorganismos (forma, estructura, tamaño,

consistencia, cromogenesis y otros), es necesario sembrarlos y cultivarlos en medios de cultivos
apropiados según el tipo de microorganismo, de tal forma que proporcione los nutrientes
necesarios para su crecimiento y desarrollo. La siembra de microorganismos se realiza en
medios sólidos y líquidos. La mayoría de las bacterias son de rápida multiplicación y agotan los
nutrientes de los medios de cultivos en forma acelerada. Las mismas una vez sembrada en los
medios de cultivos deben incubarse a una temperatura óptima de crecimiento y al abrigo de la
luz.

Un material nutritivo preparado para el crecimiento de microorganismos en un laboratorio se

denomina medio de cultivo. Algunas bacterias pueden crecer bien en casi cualquier medio de
cultivo; otras requieren medios especiales y otras no pueden crecer en ninguno de los medios
inertes existentes hasta ahora. Los microbios que se introducen en un medio de cultivo para que
comiencen a crecer se denominan inoculo. Los microbios que crecen y se multiplican en un
medio de cultivo se denominan cultivo. ' Supóngase que se desea cultivar un microorganismo
determinado, tal vez los microbios provenientes de una muestra clínica particular. ¿Qué criterios
debe satisfacer el medio de cultivo? Primero, debe contener los nutrientes adecuados para el
microorganismo específico que se desea desarrollar. También debe contener humedad
suficiente, un pH ajustado de manera apropiada y una concentración conveniente de oxígeno,
tal vez ausente por completo. El medio que se va a sembrar debe ser estéril, es decir, en un
principio no debe contener microorganismos viables, de modo que el cultivo contenga sólo los
microbios (y su descendencia) que se agreguen al medio. Por último, el medio de cultivo
sembrado debe incubarse a la temperatura correcta. Se dispone de una amplia variedad de
medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos en el laboratorio. Casi todos esos
medios, disponibles en el comercio, están constituidos por componentes mezclados con
anterioridad y sólo precisan el agregado de agua y luego la esterilización. De manera continua
se elaboran y revisan medios de cultivo para ser utilizados en el aislamiento y la identificación
de bacterias que son de interés para los investigadores en los campos de la alimentación, el agua
y la microbiología clínica. Cuando se desea que las bacterias se desarrollen sobre un medio
sólido se agrega un agente solidificante como el agar, que consiste en un polisacárido complejo
proveniente de un alga marina que se utiliza desde hace mucho tiempo como espesante de
alimentos como jaleas y helados. El agar posee algunas propiedades muy importantes que lo
convierten en valioso para la microbiología y nunca se encontró un sustituto satisfactorio. Pocos
microorganismos pueden degradar el agar, de modo que permanece en estado sólido. Además,
el agar se licúa a una temperatura de alrededor de 100 °C (el punto de ebullición del agua) y al
nivel del mar permanece líquido hasta que la temperatura disminuye a cerca de 40 °C. Para el
uso en el laboratorio el agar se mantiene en baños de agua a 50 °C. A esta temperatura no altera
a la mayor parte de las bacterias cuando se vierte sobre ellas Una vez que el agar se solidifica
puede incubarse a temperaturas se aproximan a los 100°C antes de que vuelva a licuarse; esta
propiedad es particularmente util cuando se desea cultivar bacterias termófilas. Los medios con
agar suelen utilizarse en tubos de ensayo o placas de Petri. Los tubos de ensayo se denominan
tubos en pico de flauta o inclinados cuando el medio se solidifica manteniendo el tubo en un
ángulo adecuado para lograr una gran superficie para el crecimiento. Cuando el agar se solidifica
en un tubo de posición vertical, se denomina profundo. Los cultivos en placas de Petri,
denominadas así en honor a su inventor, se realizan en placas poco profundas con una tapa que
cubre perfectamente la base para evitar la contaminación.

II MARCO TEÓRICO:

2.1 Medios de cultivo:

Un gran desarrollo en la microbiología se ha logrado luego del aislamiento y cultivo de los

microorganismos en el laboratorio. Esto se logró a partir de su siembra en los llamados medios
de cultivo: conjunto de nutrientes que permiten el desarrollo de microorganismos particulares.
Todos contienen agua y fuentes de energía, C, N, S, Fe, P, etc., micronutrientes, factores de
crecimiento y aditivos como colorantes, antibióticos, sales, etc. Para el desarrollo microbiano
es necesario tener en cuenta además de los nutrientes, las llamadas condiciones de cultivo: el
pH, presión osmótica, temperatura de incubación, nivel de oxígeno, etc. a niveles adecuados,
sin las cuales el microorganismo no se desarrollará o lo hará mal.

2.2 medios de cultivo químicamente definidos

Para favorecer el crecimiento microbiano un medio debe proporcionar una fuente de energía,
así como fuentes de carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y cualquier otro factor de crecimiento
que el organismo no pueda sintetizar. Un medio químicamente definido es uno del que se
conoce la composición química exacta. En el caso de un organismo quimioheterótro- fo, el
medio químicamente definido debe contener factores de crecimiento orgánicos que actúen
como fuente de carbono y energía se incluye glucosa en el medio para favorecer el crecimiento
de la bacteria quimioeterógrafa E. cali. para cultivar especies de Neisseria deben agregarse
muchos factores de crecimiento orgánicos al medio químicamente definido utilizado. Los
organismos que requieren varios factores de crecimiento se describen como “microorganismos
con requerimientos especiales de crecimiento”. Los organismos de este tipo, como
Lactobacillus, algunas veces se utilizan en pruebas que determinan la concentración de una
vitamina en una sustancia particular. Para llevar a cabo este ensayo microbiológico se prepara
un medio de crecimiento que contenga todos los requerimientos necesarios para el desarrollo
de la bacteria excepto la vitamina que se va a evaluar. Luego se combinan el medio, la
sustancia de prueba y la bacteria y se mide el crecimiento de bacterias. Este crecimiento
bacteriano, que se refleja en la cantidad de ácido láctico producido, será proporcional a la
cantidad de vitamina presente en la sustancia de prueba. Cuanto más ácido láctico se haya
producido más células de Lactobacillus habrán podido crecer, de modo que la cantidad de
vitamina será mayor.

2.3 cultivo de enriquecimiento

En ocasiones es necesario utilizar un cultivo de enriquecimiento porque las bacterias presentes

en pequeña cantidad pueden no detectarse, en especial si hay otras bacterias presentes en
cantidades mucho mayores. Esto sucede con frecuencia en muestras de suelo o materia fecal.
El medio (medio de enriquecimiento) para un cultivo de enriquecimiento suele ser líquido y
proporciona nutrientes y condiciones ambientales que favorecen el desarrollo de un microbio
particular pero no de otros. En este sentido también es un medio selectivo, pero está
destinado a aumentar las cantidades muy pequeñas del microorganismo deseado hasta niveles
detectables. Supóngase que se desea aislar de una muestra de suelo un microorganismo que
puede crecer en presencia de fenol y que se encuentra presente en cantidades mucho más
pequeñas que otras especies. Si la muestra de suelo se coloca en un medio de enriquecimiento
líquido en el que el fenol es la única fuente de carbono y energía, los microorganismos que no
puedan metabolizar el fenol no se desarrollarán. El medio de cultivo se incuba durante algunos
días y luego se transfiere una alícuota pequeña a otro recipiente con el mismo medio. Tras una
serie de pasajes la población sobreviviente estará constituida por bacterias capaces de
metabolizar el fenol. Entre estos pasajes se deja transcurrir cierto tiempo para que las
bacterias se desarrollen en el medio; este es el estadio de enriquecimiento. Los nutrientes del
inoculo original se diluyen rápidamente con los sucesivos pasajes. Cuando la última dilución se
siembre en un medio sólido de la misma composición sólo se desarrollarán colonias de
microorganismos capaces de utilizar el fenol. Un aspecto destacable de esta técnica particular
es que el fenol resulta letal para la mayoría de las bacterias.

2.4 obtención de cultivos puros

La mayoría de los materiales infecciosos, como por ejemplo pus, esputo y orina, contienen
varias clases diferentes de bacterias, lo que también sucede con las muestras de suelo, agua o
alimento. Si estos materiales se siembran en una placa en la superficie de un medio sólido se
formarán colonias que serán copias exactas del microorganismo original. En teoría una colonia
visible se origina en una única espora o célula vegetativa o en un grupo de los mismos
microorganismos adherí- dos entre sí en agregados o cadenas. Las colonias microbianas a
menudo tienen un aspecto distintivo que distingue los microorganismos entre sí. Las bacterias
deben distribuirse de un modo lo bastante amplio como para que las colonias estén
visiblemente separadas entre sí. La mayor parte de los trabajos bacteriológicos requieren
cultivos puros, o clones, de bacterias. El método de aislamiento empleado con más frecuencia
para obtener cultivos puros es el método de siembra por estría en placa. Se introduce un ansa
de inoculación estéril en un cultivo mixto que contenga más de un tipo de microbio y se lo
distribuye en forma estriada sobre la superficie del medio nutritivo; las bacterias se
desprenden del ansa y pasan al medio. Las últimas células que se desprenden del ansa están
bastante separadas como para crecer en colonias aisladas. Estas colonias pueden tomarse con
un arisa de inoculación y sembrarse en un tubo de ensayo que contenga el medio nutritivo
para formar un cultivo puro de un solo tipo de bacteria. El método de siembra por estría en
placa funciona bien cuando el microorganismo que se desea aislar está presente en grandes
cantidades en relación con la población total. En cambio, cuando el microorganismo que se
desea aislar está presente sólo en cantidades muy pequeñas estas deben incrementarse
mediante el empleo de un enriquecimiento selectivo antes de que se lo pueda aislar con el
método de siembra por estría en placa. Los microorganismos pueden reconstituirse en
cualquier momento mediante la hidratación con un medio nutritivo líquido adecuado.

2.5 conservación de cultivos bacterianos

La refrigeración puede utilizarse para la conservación de los cultivos bacterianos durante un

corto plazo. Dos métodos comunes para preservar los cultivos microbianos durante períodos
prolongados son la ultra congelación y la liofilización. La ultra congelación es un proceso por el
cual se coloca un cultivo puro de microbios suspendido en un líquido y se congela rápidamente
a temperaturas que varían de -50 a “95 °C. El cultivo puede descongelarse y cultivarse incluso
varios años después. Durante la liofilización (congelación- desecación), la suspensión de
microbios se congela rápidamente a temperaturas que varían de -54 a -12 °C y el agua, se
elimina por vacío elevado (sublimación). Mientras se produce el vacío el recipiente se sella
fundiendo el vidrio con un soplete a alta temperatura. El residuo pulverulento que contiene los
microbios sobrevivientes puede guardarse durante años.

2.6 crecimiento de cultivos bacterianos

La capacidad de representar de modo gráfico las poblaciones enormes que se producen como
resultado del crecimiento de los cultivos bacterianos es una parte esencial de la microbiología.
También es necesario ser capaz de determinar las cantidades de microorganismos, sea de
modo directo, mediante su recuento o de modo indirecto, mediante la medición de su
actividad metabólica.

2.7 tiempo de generación

Para calcular el tiempo de generación de las bacterias, sólo consideraremos la reproducción

por fisión binaria, que de hecho es el método más frecuente. La división de una célula produce
dos células, la división de dos células produce cuatro células y así sucesiva- mente. Cuando el
número de células en cada generación se expresa como potencia de 2, el exponente indica el
número de duplicaciones (generaciones) que se han producido. El tiempo necesario para que
una célula se divida (y su población se duplique) se denomina tiempo de generación. Este
tiempo varía considerablemente entre los microorganismos y con las condiciones ambientales,
como la temperatura. La mayoría de las bacterias tienen un tiempo de generación de 1 a 3
horas; otras requieren más 'de 24 horas por generación. (En el apéndice D se presentan los
cálculos matemáticos necesarios para calcular los tiempos de generación.) Si la fisión binaria
continuara de todo descontrolado se produciría una cantidad enorme de células. Si la
duplicación se produjera cada 20 minutos, como es el caso de E. coli en condiciones
favorables, después de 20 generaciones una única célula inicial aumentaría a más de 1 millón
de células. Esto requeriría algo menos de 7 horas. En 30 generaciones, o 10 horas, la población
llegaría a ser de mil millones de células y en 24 horas sería de un número acompañado por 21
ceros. Resulta difícil graficar cambios poblacionales de -una magnitud tan grande mediante
números aritméticos; por eso se emplean escalas logarítmicas para graficar el crecimiento
bacteriano. La comprensión de las representaciones logarítmicas de las poblaciones
bacterianas requiere ciertos cálculos matemáticos que son necesarios para cualquiera que
estudie microbiología. (Véase apéndice D.)
III OBJETIVOS

 Comparar los principales métodos de cultivo utilizados para los diferentes tipos de
microorganismos.
 Conocer los principales métodos de cultivo utilizados para los diferentes tipos de
microorganismos