Manual de Microbiologia Agricola

i H O A V IN E A i
U N IV E R SID A D N A C IO N A L AG RAR IA LA M O LIN A
MANUAL DE ,
MICROBIOLOGIA AGRICOLA
RH IZO BIU M , PGPRs,

IN D IC A D O R ES D E
FER TILID A D E IN O C U ID A D
DORIS ELIZABETH ZÚÑIGA DÁVILA

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
MANUAL DE
MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA
RHIZOBIUM, PGPRs,
INDICADORES DE FERTILIDAD E
INOCUIDAD
2012
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
Dr. JESÚS ABEL MEJÍA MARCACUZCO

Rector
Dr. JORGE LUIS ALIAGA GUTIÉRREZ

Vicerrector Académico
Mg.Sc. EFRAÍN DONALD MALPARTIDAINOUYE

Vicerrector Administrativo
Mg.Sc. MARÍA BEATRIZ OLAYA MORALES

Jefe de EDIAGRARIA
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS,

INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD
© Doris Elizabeth Zúñiga Dávila
© Universidad Nacional Agraria La Molina

Av La Universidad s/n La Molina
Derechos reservados
ISBN: N° 978-612-4147-04-3
Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú:

Registro: N° 201206340
Primera Edición: mayo del 2012 - Tiraje: 1 000 ejemplares

Impreso en Perú - Printed in Perú
Editor:
M aría Beatriz Olaya Morales
Diseño, diagramación e impresión:

Q & P Impresores S.R.L
Av. Ignacio Merino 1546 Lince
Telf. 470-1788 - www.qypimpresores.com
Queda terminantemente prohibida por la Ley del Perú la reproducción total o parcial de
esta obra por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, químico, óptico, incluyendo
sistema de fotocopiado, sin autorización escrita de la Universidad Nacional Agraria La
Molina y la autora.
Todos los conceptos expresados en la presente obra son responsabilidad de la autora.

PRESENTACIÓN
ice el lema de la Universidad, “quiero cultivar al hombre y al cam po”,
D como una forma de expresar la interrelación entre la cultura y la

naturaleza; sabia combinación que garantiza la existencia de la sociedad.
Para que ésta se optimice, el hombre ha creado la ciencia, perenne y constante
preocupación por su entorno, que garantiza el desarrollo y progreso de los pueblos
del mundo.
La Universidad Nacional Agraria La M olina, es el espacio donde se desarrollan

estas preocupaciones y retos en un ambiente de debate y consolidación de la
técnica, la ciencia y las humanidades. Sus profesores son los principales agentes
de la investigación, cuyos resultados son m ateria de las clases en aulas, y fuera en
ella, en foros académicos, donde sale a la luz su excelente preparación e idoneidad
experimental.
Bajo estos preceptos y antecedentes, me complace presentar este libro “Manual

de Microbiología Agrícola RMzobium, PGPRs, Indicadores de Fertilidad e
Inocuidad” de Doris Elizabeth Zúñiga Dávila, destacada docente de nuestra
universidad, quien en este trabajo demuestra la agudeza de sus investigaciones y
comparte sus resultados, como una forma de optimizar el papel de la Universidad
para la com unidad universitaria y la sociedad en general.
D r . J esús A bel M ejía M arcacuzco

R ector
A la Memoria de mis queridos padres
Celia y Francisco
por iluminar siempre m i sendero.
A mis hijos E th ely Eduardo

por todo su cariño
A m i nietecita Adriana
Sol de m i vivir
COLABORADORES:
Laboratorio de Ecología M icrobiana y Biotecnología

M arino Tabusso - UNALM
Blga. Elena Ram os Vásquez
Blgo. M inora M atsubara Bautista
Blga. Katty Ogata Gutiérrez
Bach. Blga. Stefany Cépeda Gonzáles
Blga. N atalia Kohashikawa Takaezu
Blga. Pam ela Calvo Vélez
Centro de Ciencias Genómicas - UNA M (Cuernavaca, México)

Dr. Ernesto Orm eño Orrillo
Coordinador de la Red Biofag - CYTED, España

Dr. Juan Sanjuán Pinilla (CSIC-EEZ, Granada)
Fotografías y diagrama de la portada
Fotografías laterales
(D. Zúñiga, E. Ramos y R. Santos)
1. Efecto de la inoculación de cepas de Azotobacter en plantas de papa.

2. Control de Rhizoctonia por cepas de Bacillus sp.
3. Producción de ácido indol acético por cepas aisladas de frijol.
4. Perfiles de amplificación BOX-PCR de Bacillus aislados de papas
amargas.
5. Semillas germinadas de Phaseolus lunatus.
Diagrama central (D. Zúñiga)

“Señales moleculares de la interacción Rhizobium -leguminosa”
INDICE
PRÓLOGO 13
I. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE RHIZOBIOS
1. Recolección de nodulos 17
2. Aislamiento de rhizobios 17
2.1. Tratamiento de nodulos 17
2.2. Aislamiento de rhizobios a partir de nodulos 17
2.3. Mantenimiento y conservación de rhizobios aislados 18
3. Pruebas de pureza 19
3.1. Crecimiento en agar levadura lactosa (LLA) 19
3.2. Crecimiento en agar peptona - glucosa con indicador
púrpura de bromocresol (PGPBC) 19
3.3. Crecimiento en agar Luria Bertani (LB) 19
4. Autenticación de las cepas de rhizobios 20
4.1. Desinfección de semillas 20
4.2. Evaluación de la germinación 20
4.3. Preparación del inoculo 20
4.4. Trasplante de semillas a tubos con solución nutritiva 20
4.5. Inoculación de las plántulas 21
5. Caracterización fenotípica de cepas de rhizobios 22
5.1. Caracterización morfológica de colonias 22
5.2. Producción de acidez o alcalinidad en medio LMA
con azul de bromotimol (LMA-ABT) al 0.5% 22
5.3. Efecto de los agentes físico-químicos sobre el crecimiento
de las cepas de rhizobios 23
5.4. Tolerancia a iones metálicos Cu2+, Zn2+, Al3+, Mn2+ 24
5.5. Crecimiento en diferentes fuentes de carbohidratos y aminoácidos 26
5.6. Sensibilidad a antibióticos en disco 26
II. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS PGPR
6. Aislamiento de bacterias promotoras de crecimiento (PGPR) 31

6.1. Procesamiento de las muestras de rizósfera 31
6.2. Aislamiento de Bacillus sp. 31
6.3. Aislamientos de Azotobacter sp. 31
6.4. Aislamiento de actinomicetos 32
7. Pruebas para bacterias promotoras de crecimiento 32
7.1. Detección de acido indol acético (ALA.) 33
7.2. Detección de bacterias solubilizadoras de fosfato 34
7.3. Pruebas de antagonismo contra hongos fitopatógenos 34
7.4. Efecto de la inoculación con PGPRs en la germinación
de diferentes cultivos. 36
III. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR E INTERPRETACIÓN
DE DATOS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN BOX-PCR
Introducción 39
'8. Notas generales para hacer PCR 39
9. Extracción de DNA por lisis alcalina 40
10. Verificación de la calidad del DNA extraído
(Control de calidad) 41
11. Amplificación BOX-PCR 42
12. Agrupamiento de perfiles BOX-PCR semejantes 45
13. Amplificación del gen ribosomal 16s 46
14. Purificación del producto de PCR 47
15. Secuenciamiento 47
16. Elaboración de árboles filogenéticos 50
IV. PRODUCCIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE BIOFERTILIZANTES
17. Producción de biofertilizantes 53

17.1. Producción de biomasa del rhizobio 53
17.2. Preparación del soporte sólido 53
17.3. Presentación del biofertilizante 55
18. Control de calidad del biofertilizante 56
18.1. Recuento de células viables de bacterias fijadoras de nitrógeno 56
18.2. Capacidad infectiva y efectiva de los inoculantes en
plántulas de leguminosas 56
18.3. Recuento de microorganismos contaminantes del biofertilizante 56
18.4. Análisis físico-químico 56
19. Enumeración de bacterias simbióticas fijadoras de
nitrógeno por número más probable 58
V. INDICADORES DE LA FERTILIDAD BIOLOGICA DEL SUELO
Introducción 63
20. Preparación de muestras y diluciones 65
21. Recuento de bacterias 66
21.1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas viables 66
21.2. Recuento de heterótrofos 66
22. Recuento de hongos totales 69
23. Recuento de bacterias anaerobias mesófilas 70
24. Recuento de actinomicetos 71
25. Enumeración de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre 72
26. Actividad microbiana 73
26.1 Determinación de la respiración de los microorganismos del suelo 73
26.2 Determinación de la actividad deshidrogenasa de los
microorganismos del suelo 73
VI. INDICADORES DE INOCUIDAD DE AGUA Y SUELO
Introducción 79
27. Enumeración de coliformes totales 81
27.1. Enumeración de coliformes totales (ICMSF, 2000) 81
27.2. Enumeración de coliformes totales
(Standard Methods, 1998) 83
28. Enumeración de coliformes fecales 86
28.1. Enumeración de coliformes fecales (ICMSF, 2000) 86
28.2. Enumeración de coliformes fecales
(Standard Methods, 1998) 88
29. Enumeración de Escherichia coli 90
29.1. Técnica para el aislamiento y purificación de cultivos 90
29.2. Técnica para la prueba del indol 90
29.3. Técnica para la prueba del rojo de metilo 90
29.4. Técnica para la prueba de Voges-Proskauer 90
29.5. Técnica para la prueba del citrato sódico 91
30. Determinación de Salmonella 92
30.1. Enriquecimiento no selectivo de salmonelas 92
30.2. Enriquecimiento selectivo de salmonelas 92
30.3. Siembra en medios de agar selectivo para salmonelas 92
30.4. Bioquímica de Salmonella 92
30.5. Serología somática 93
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 95
ANEXOS 99
N° 1: Medios de cultivo y reactivos 100
N° 2: Ensayos de sensibilidad a diferentes antibióticos 106
N° 3: Tablas de número más probable 107
N° 4: Material de biología molecular 111
A B R E V IA T U R A S
AP Agua peptonada
APT Agua peptonada tam ponada
EC Caldo EC
LMC Caldo extracto de levadura - m anitol
CG Caldo glucosa
Brilla Caldo lactosa bilis (2 %) verde brillante
CL Caldo lactosado
LST Caldo lauril sulfato triptosa
SC Caldo selenito cistina
T-VB Caldo tetrationato verde brillante
TSC Caldo tripticasa de soya
CT Caldo triptona
TY Caldo triptona - extracto de levadura
M M - ABT M edio mineral sin nitrógeno con
indicador azul de bromotimol
SS Solución salina 0.85 %
PRÓLOGO
a fertilidad del suelo generalmente está relacionada con la cantidad de nutrientes
L disponibles para las plantas y los microorganismos juegan un rol importante en el

reciclaje de todos estos elementos nutricionales que muchas veces no se comprende.
A nivel mundial existen muchas investigaciones relacionadas con la dinámica de la
microflora de diferentes suelos y su relación con la producción de diferentes cultivos, pero
estos análisis resultan aún muy costosos.
En el primer manual Fertilidad Biológica del Suelo con énfasis en el estudio del Rhizobium
editado en Junio del 2006 fue utilizado dentro del I Curso Internacional de Fertilidad
Biológica del Suelo, auspiciado por la Red Biofag (Cyted España). Después de una revisión
e incorporación de nuevas técnicas como el aislamiento de bacterias promotoras de
crecimiento (PGPR) y pruebas de actividad microbiana investigados en nuestro laboratorio,
se propuso darle el título de Microbiología Agrícola: Rhizobium, PGPR, indicadores de
fertilidad e inocuidad, puesto que los ensayos se enfocan principalmente en el estudio de
los suelos para la producción de diversos cultivos de manera sostenible.
Por otro lado, en los últimos años se ha incrementado la demanda de análisis

microbiológicos en suelos, agua de riego y residuos orgánicos, que nos indican la riqueza
natural de estos sustratos; y mas aún por empresas que trabajan a nivel de exportación de
cultivos, cuyas exigencias se basan en las normas de Eurepgap, son mayores cuando se
trata de productos orgánicos. Estas involucran las buenas prácticas agrícolas, seguridad
alimentaria, protección del ambiente y salud. Pero además, los pequeños agricultores
cuya proyección es ofrecer productos nativos manejados de manera tradicional, también
requieren de estas técnicas y conocimientos.
El presente manual se organiza en 6 capítulos con un total de 30 temas. En primer

lugar se describe todo lo relacionado con el Rhizobium aislados de nodulos de diferentes
leguminosas, es decir, desde su aislamiento, purificación, y autenticación en plántulas
hasta su caracterización fenotípica: morfológica y bioquímica.
En segundo lugar, se presentan las técnicas de aislamiento de bacterias promotoras de

crecimiento con énfasis en Bacillus y Azotobacter no presentadas en el manual anterior de
Fertilidad Biológica. Así también se describen algunas técnicas para evaluar la capacidad
promotora de crecimiento (PGPR), como solubilización de fosfato y producción de ácido
indol acético (AIA). En la presente obra, también se incluyen dos pruebas importantes
como es la capacidad antagónica de fitopatógenos y efecto de las bacterias en la germinación
de semillas.
Todas estas pruebas, nos permite conocer no solo el potencial de la fijación simbiótica
de nitrógeno en diferentes ecosistemas, sino también diferentes bondades de las bacterias
PGPR que favorecen significativamente la producción de leguminosas y otros cultivos.
13
La caracterización molecular que aparece como tercer capítulo permite determinar la
diversidad intra e interespecíficas de cepas bacterianas con énfasis en rhizobios, pero que
pueden ser aplicadas o adaptadas a bacterias PGPRs. Estas herramientas moleculares son
muy importantes para conocer con qué cepas bacterianas estamos trabajando y poderlas
aplicar sin riesgo para el agricultor, el ambiente y el consumidor.
Como cuarto capítulo, se muestra la metodología de producción de inoculantes en soportes

sólidos a nivel de laboratorio y algunas de las técnicas para evaluar su control de calidad:
número de células viables en el soporte, capacidad infectiva y efectiva en el cultivo entre
otras.
En el quinto, se presentan algunos métodos para la determinación de la actividad

microbiana y poblaciones microbianas, como indicadores de la fertilidad del suelo.
En el último capítulo se describen las técnicas de análisis de coliformes y Salmonella, las

cuales son útiles para determinar el estado sanitario del suelo, residuos orgánicos, compost,
bioles, lodos y agua de riego. Es necesario resaltar que el LEMYB Marino Tabusso está
realizando investigaciones para validar estos métodos ya que no existen todavía normas
estandarizadas en nuestro país y en otros, aún están en proceso de discusión.
Esperamos que el contenido de este segundo manual, resultado también de mucha

dedicación y de investigación sea útil para diferentes investigadores, profesores, alumnos
y todas aquellas personas relacionadas con la agricultura, interesadas en incursionar
en el fascinante mundo de las bacterias fijadoras de nitrógeno y otros microorganismos
promotores de crecimiento que son clave en el manejo sustentable de los suelos.
Finalmente, quiero agradecer a todas las personas del laboratorio que hicieron posible la
publicación del presente manual, en especial a Elena Ramos y Minoru Matsubara. Así
también al Dr. Juan Sanjuan, coordinador de la Red Biofag (Cyted España) y Dr. Ernesto
Ormeño, del Centro de Ciencias Genéricas UNAM (México).
Doris Zúñiga
14
I. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION
DE RHIZOBIOS
1. R eco lecció n de n o d u lo s
2. A islam ien to de rh izo b io s
3. P ru eb a s de p u re z a
4. A u te n tic a c ió n de las cepas de rh izo b io s
5. C ara c te riz a c ió n fen o típ ica de cepas de rh izo b io s
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD
1. RECOLECCION DE NODULOS
Esta metodología se realiza de acuerdo al m anual del CIAT (1988).
1. Con ayuda de una lampa, extraer la planta que presente mejor aspecto.
Luego colectar entre 10 y 20 nodulos de la raíz (Figura 1.1).
2. Colocar los nodulos en frascos con silica gel y algodón para su posterior
conservación, asignándoles a cada muestra un código de acuerdo al lugar
de muestreo y núm ero de planta. Se recom ienda un tiempo máximo de
3 meses de almacenamiento bajo esta condición.
3. Posteriormente se trasladan al laboratorio para su tratam iento y
procesamiento respectivo.
2. AISLAMIENTO DE RHIZOBIOS
2.1. Tratamiento de los nodulos
* Seleccionar 3 nodulos de cada frasco con silica gel.
■ Colocarlos en sobres de papel de filtro estéril e hidratarlos en agua
destilada tam bién estéril durante 30 m in (en caso que los nodulos estén
secos).
■ Desinfectar con alcohol al 70 % por espacio de 1 min en u n recipiente
estéril.
* Trasladar a otro recipiente que contenga lejía (hipoclorito de sodio) al 3
% y dejar reposar durante 3 min (Figura 2.1)
■ Enjuagar con agua destilada estéril durante 6 veces hasta que no se
perciba el olor a lejía.
2.2. Aislamiento de rhizobios a partir de nodulos
* Con ayuda de pinzas estériles, abrir los sobres que contienen los nodulos.
■ Colocar los nodulos en placas Petri estériles y con ayuda de una pipeta
agregar una gota de agua destilada estéril a cada uno.
■ Con una bagueta proceder a la m aceración del nodulo (es necesario que
por cada nodulo se utilice una bagueta).
17
D O RIS ELIZA B ETH Z Ú Ñ IG A DÁ V ILA
■ El macerado se siembra en placas Petri con medio agar levadura manitol

con rojo congo (LMA-RC) por estrías paralelas.
■ Incubar las placas a 28 °C por 24 - 72 horas (Rhizobium sp.) o 5 - 7 días
(Bradyrhizobium sp.).
* U na vez observado el crecimiento, se procede a elegir las colonias de los
posibles rhizobios teniendo en consideración las características típicas
de estos (Tema 5.1). Posteriormente se reaíslan de 2 - 3 veces en placas
Petri con LMA-RC hasta obtener colonias aisladas con crecimiento
homogéneo.
2.3. Mantenimiento y conservación de rhizobios aislados
* Sembrar a partir de una sola colonia en medio LMA, incubar a 28 °C por
3 - 1 0 días, y luego conservar a 4 °C. Realizar el mismo procedimiento
cada 6 meses.
■ Para tener cultivos stocks, hacer crecer las cepas en Caldo Extracto de
Levadura - M anitol sin rojo congo (LMC) hasta una población de
aproxim adam ente 108 cel/m L.
■ M ezclar 1 mL de este cultivo con 0,5 mL de glicerol al 87 % y guardar
a -80 °C.
Desinfección: alcohol al 70 % x 1 min.
Desinfección: hipoclorito de sodio 3 % x 3 min.
I
Enjuague: 5 - 6 veces con H20
EfEEEzEE3
Triturado del nodulo y siembra por estría en medio
LMA-RC. Incubar a 28 °C por 24 - 72 h ó 5 - 7 días
Reaislamiento del rhizobio en medio LMA-RC.

Incubar a 28 °C por 24 - 72 h ó 5 - 7 días
Conservación de cepas a 4 °C
FIGURA 2.1. Aislamiento de rhizobios a partir de nodulos
18
3. PRUEBAS DE PUREZA
Las pruebas de pureza siguen la metodología em pleada por el CIAT (1988).
3.1. Crecimiento en agar - levadura - lactosa (LLA)
■ Sembrar los cultivos aislados en placas con LLA por estrías paralelas.
■ Incubar a 28 °C por 2 - 1 0 días (según sea Khizobium sp. o Bradyrhizobium sp).
■ Observar el crecimiento de la bacteria.
■ Adicionar 5 m L del reactivo de Benedict, e incubar a tem peratura
ambiente por 10 min .
■ Observar el cambio de coloración, de blanquecino a amarillento (Figura 3.1).
El cambio de color en el reactivo de Benedict a amarillo se debe a la producción
de a-cetolactosa, característico del género Agrobacterium y no de rhizobios.
3.2. Crecimiento en agar peptona - glucosa con indicador púrpura de
bromocresol (PG-PBC)
■ Sembrar los cultivos en medio PG-PBC mediante estrías paralelas.
■ Incubar a 28 °C por 2 - 1 0 días (según sea Rdiizobium sp. o Bradyrhizobium sp.).
■ Observar el crecimiento y cambio de coloración (Figura 3.1).
Generalmente los rhizobios no crecen o crecen poco virando ligeramente a
amarillo el medio de cultivo. Resultados diferentes a los antes descritos indicarían
el crecimiento de un microorganismo contaminante.
3.3. Crecimiento en agar Luria Bertani (LB)
■ Sembrar los cultivos en medio LB mediante estrías paralelas.
■ Incubar a 28 °C por 2-10 días.
Cepas de rhizobios
éEEEEEj Í5EEEE3
Siembra por estría Siembra por estría Siembra por estría
Medio PG-PBC Medio LLA Medio LB
Incubar a 28 °C por 2 -10 días
Agregar 5 mL de
reactivo de.
Benedict e incubar
Evaluar crecimiento Evaluar crecimiento
y viraje de color
Evaluar crecimiento
Rvo. Benedict.
FIGURA 3.1. Pruebas de pureza
19
D O R IS EL IZA B ETH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA
■ Observar crecimiento (Figura 3.1).

AI igual que en el medio PG-PBC, en este medio no se observa un buen
crecimiento de los rhizobios. Se ha observado excepcionalmente el
crecimiento de las cepas de Rhizobium tropici de frijol.
4. AUTENTICACIÓN DE LAS CEPAS DE RHIZOBIOS
4.1. Desinfección de semillas
■ Escoger las semillas de interés para realizar la autenticación.
■ Desinfectar utilizando hipoclorito de sodio al 2 % durante 5 min (de
acuerdo a la sensibilidad de la semilla).
■ Enjuagar con agua destilada estéril varias veces cada 5 min.
■ La hidratación de las semillas se realiza colocándolas en vasos de
precipitación con 400 mL de agua destilada estéril. Las semillas grandes
(mayor a 1 cm) se dejan hidratar por 3 - 4 h y las semillas pequeñas
durante 1 - 2 h.
■ Con ayuda de pinzas estériles se tom an 10 semillas de cada variedad.
■ Colocar en placas Petri con la base recubierta de papel de filtro estéril
hum edecido (Figura 4.1).
■ Cubrir las placas con papel para proteger de la luz.
■ Llevar a una estufa a 24 °C por 24 - 72 h. (según el tipo de semilla).
4.2. Evaluación de la germinación
La germinación de las semillas se evalúa cada doce horas, teniendo en
consideración los siguientes parámetros: porcentaje de germinación,
número de radículas con punta roma, número de radículas con punta fina.
4.3. Preparación del inoculo
* De las cepas de rhizobios conservadas en refrigeración, tom ar una asada.
■ Sembrar en caldo levadura manitol.
■ Incubar a 28 °C por 2 - 7 días (según la bacteria) con la finalidad de
obtener una población de bacterias de 108 U F C /m L .
4.4. Transplante de semillas a tubos con solución nutritiva
■ Para la autenticación se escogen las semillas que presentaron radículas
con punta fina.
■ Las semillas pequeñas germinadas (trébol, alfalfa) se transfieren a tubos
de ensayo que contienen material de polipropileno, papel de filtro y
aproxim adam ente 10 mL de solución nutritiva (Figura 4.2).
■ Las semillas grandes (pallar, frijol) colocarlas en placas Petri. Con ayuda
de un bisturí y pinzas quitar el pericarpio.
■ Luego, transferirlas a tubos grandes con 25 m L de solución nutritiva o a
jarras Leonard.
■ Los tubos que contienen las semillas se cubren con un papel en la parte
externa inferior para proporcionarle la oscuridad necesaria a la raíz.
30
MANUAL P E MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES P E FERTILIDAD E INOCUIDAD
■ Colocarlos en gradillas y trasladarlos a u n a cám ara de crecimiento,

proporcionándoles 12 h de luz blanca y directa (utilizándose dos
fluorescentes de 40 watts cada uno) y 12 h de oscuridad, a u n a tem peratura
de 1 8 - 2 2 °C.
4 .5 .Inoculación de las plántulas
■ R ealizar la inoculación de las plántulas a los 7 dias.
■ C olocar 1 m L del inoculo bacteriano cerca de la radícula de cada
plántula.
■ Regar las plántulas con la solución nutritiva cada 3 o 5 días (si fuera
necesario).
■ O bservar la aparición de nodulos, cada 7 días, por cinco sem anas
aproxim adam ente.
L a pru eb a de autenticación confirm a que la colonia aislada de Rhizobium es
capaz de n o d u lar (nod +).
Desinfección de semillas con hipoclorito de
sodio 2 % durante 5 min
Enjuagar las semillas con agua destilada

estéril cada 5 min ( 5 - 7 veces)
Hidratar las semillas de leguminosa en agua estéril

Semilla grande: 3 - 4 h Semilla pequeña: 1.5 - 2 h
Colocar las semillas en placas con papel filtro

humedecido con agua destilada estéril
Semilla grande: 6 mL Semilla pequeña: 2 mL
i
Cubrir las semillas en placas y llevarlas a incubar a 24 °C
l
Evaluación de la germinación
FIGURA 4.1. Desinfección y germinación de semillas de leguminosas
21
D O RIS ELIZA B ETH ZÚ Ñ IG A DÁVILA
Semillas de leguminosa pre germinadas
Transplante de las sem illas a tubos de ensayo

con solución nutritiva
Llevar a cámara de crecimiento de 18 a 22 °C
Inoculo de plántulas a los 7 días con cepas de

rhizobios (108 UFC/mL)
Observar la aparición de nodulos cada 7 días por cinco

semanas.
FIGURA 4.2. Autenticación
5. CARACTERIZACION FENOTIPICA DE CEPAS DE RHIZOBIOS

La caracterización fenotípica se realiza en base a los protocolos recomendados
por Somasegaran y Hoben (1985), CIAT (1988), M atos et al. (1998) y Hungría
et al. (2001).
5.1. Caracterización morfológica de colonias
" Sembrar las cepas en el medio LM A - RC.
■ Incubar a 28 °C por 2 - 1 0 días.
■ M edir diámetro, forma, apariencia y color de la colonia, así como la
cantidad, textura y consistencia de la gom a producida.
■ D e acuerdo a las- características evaluadas, las cepas en estudio pueden
agruparse en distintos géneros de rhizobios (Tabla 5.1).
5.2. Producción de acidez o alcalinidad en medio LMA con azul de bromotimol
(LMA - ABT) al 0.5%
■ Sembrar las cepas de rhizobios en el medio LM A con azul de bromotimol
(ABT) al 0.5 %.
22
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RKZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD
* Incubar a 28 °C por 2 - 12 días (Figura 5.1).

■ El cambio de color de verde a amarillo o a azul depende del género del
rhizobio en estudio (Tabla 5.1).
TABLA 5.1. Características morfológicas de rhizobios en medio LMA

(modificado de W ang y M artinez-Romero, 2005).
TIEMPO DIÁMETRO TEXTURA APARIENCIA COLOR GOMA LMA-ABT
A zu l
A z o rh iz o b iu m 2 d ías > 2 mm C re m o s o Translúcidas B la n co R e g u la r
(Á lc a li)
L ig o so / P oco a A zu l
B ra d y rh iz o b iu m 5-7 d ía s < 2 mm Opacas B la n co
c re m o so re g u la r (Á lc a li)
R e g u la r a A m a rillo
M e s o rh iz o b iu m 3-7 d ía s 2 -4 m m C re m o s o Semitranslúcidas B la n co
a b u n d a n te (Á cid o )
L ig o so / Semitranslúcidas B la n co A m a rillo
R h iz o b iu m 2-5 d ía s 2 -4 m m A b u n d a n te
cre m o s o u opacas ó b eige (Á cid o )
Cultivo de rhizobios de 3 - 1 0 dias
i
Sembrar por estría en medio LMA
con azul de bromotimol
Incubar a 28 °C x 3 -1 2 días
I
Evaluar viraje del medio:
amarillo: acidez / azul: alcalinidad
F IG U R A 5.1. Producción de acidez o alcalinidad
5.3. Efecto de los agentes físico - químicos sobre el crecimiento de las cepas
de rhizobios
■ Para realizar los siguientes ensayos es necesario tener las cepas previamente
crecidas en caldo LM C a una población de aproximadamente 106- 108
U F C /m L (cultivos de rhizobios de 3 días ó de bradyrhizobios de 5 días)
23
D O RIS EL IZA B ETH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA
■ Luego, tom ar 5 pL con u n pipetor autom ático y colocarlo en la placa con

medio LM A a las diferentes condiciones a ensayar (pH, concentraciones
de NaCl). En caso de no contar con un pipetor, usar una asada del
cultivo líquido y realizar una pequeña estría (Figura 5.2).
■ Cada placa Petri de 1 0 x 9 m m se divide en cuadrantes y sirve para 9
cepas de rhizobios ó 16 de bradyrhizobios.
5.3.1. Crecimiento a varios niveles de pH
• Sembrar las cepas en medio LM A a diferentes pH (4, 5, 8 y 9).
■ Incubar a 28 °C y evaluar elcrecimiento de las cepas cada 24 o 48 h
por 10 días para los rhizobios y 15 días para los bradyrhizobios.
5.3.2. Crecimiento a diferentes concentraciones de NaCl
■ Sembrar las cepas en medio LM A con diferentes concentraciones de
N aCl (0.25, 0.5, 1, 2 % a más).
■ Incubar a 28 °C y evaluar el crecimiento de las cepas en estudio
cada 24 o 48 horas por 10 días para Rhizobium y 10 - 15 días para
Bradyrhizobium.
5.3.3. Crecimiento en diferentes temperaturas
* Sembrar las cepas en medio LMA.
■ Incubar a diferentes temperaturas: 8, 28, 37 y 40 °C, y evaluar el
crecimiento de las cepas en estudio cada 24 o 48 horas por 10 días
para Rhizobium y 15 días para Bradyrhizobium. Luego, a los 15 y 20
días como evaluación final.
5.4. Tolerancia a iones metálicos Cu2+, Zn2+, AP+, Mn2+
■ Sembrar las cepas en medio LM A con diferentes concentraciones de
Cu2+ y Zn2+ (10, 20 y 40 pg/m L); Al3+ (0.625, 1.25 y 2.5 pg/m L) y M n2+
(0.3125, 0.625 y 1.25 pg/m L). Los iones metálicos se obtienen a partir de
C uS0 4.5H20 y ZnSO4.7H20, A1C13.6H20 y M n S 0 4.H20.
■ Incubar a 28 °C.
* Evaluar el crecimiento de las respectivas cepas cada 24 horas por 12 días
(Figura 5.3).
24
/
Cultivo de rhizobios de 24 a 48 h
1
Inoculo (5 j jL d e lO 6 UFC/mL)
LMA con diferentes LMA con diferentes

concentraciones de LMA
niveles de pH
NaCI (0.5, 1 y 2 %) (4, 5, 8, 9)
Incubar a 28 °C x Incubar a 8, 28, 37 y 40 °C

3 a 15 días por 3 a 20 días
Reportar el crecimiento: Abundante (++++), bueno (+++),

regular (++), escaso (+) y no crecimiento (-).
FIGURA 5.2. Crecimiento en diferentes niveles de NaCI, pH y temperatura
Cultivo de rhizobios de 24 a 48 h
LMA con diferentes LMA con diferentes LMA con diferentes LMA con diferentes
concentraciones de concentraciones de concentraciones de Al concentraciones de
Zn (40, 20,10 pg/mL) Cu (40, 20, 10 pg/mL) (2.5, 1.25, 0.625 Mn (1.5, 0.625,
pg/mL) 0.3125 pg/mL)
Incubar a 28° C x 3 -1 2 días
Reportar el crecimiento: abundante (++++), bueno

(+++), regular (++), escaso (+) y no crecimiento (-).
FIGURA 5.3. Tolerancia a metales
25
D O RIS FJ.TZAHETH ZÚ Ñ IG A DÁV tLA
5.5. Crecimiento en diferentes fuentes de carbohidratos y aminoácidos

■ Inocular una asada del cultivo fresco en el medio base de Bergersen
descrito por Somasegaran (1985) con el carbohidrato (1%) o aminoácido
(0.1%) en estudio.
■ Incubar a 28 °C por 2 a 10 días (Figura 5.4).
■ Evaluar cambio de color del medio:*Si vira a color amarillo la reacción es
positiva (metabolismo del carbohidrato o aminoácido). La turbidez del
medio también indica reacción positiva).
Cultivo fresco de rhizobios de 24 a 48 h
i
Transferir una asada del cultivo fresco
ai medio base con el carbohidrato o
aminoácido de interés
i
Incubar a 28 °C x 2 a 10 días
i
Evaluar viraje del medio:
Amarillo: fermentación del carbohidrato o aminoácido
Evaluar crecimiento:
Turbidez: crecimiento positivo
FIGURA 5.4. Crecimiento en diferentes fuentes de carbohidratos y aminoácidos
5.6. Sensibilidad a antibióticos en disco

* Sembrar las cepas de interés, por duplicado, en medio LMA, esto se
puede realizar con la ayuda de una espátula de vidrio o por el m étodo de
incorporación. El inoculo de rhizobios es de 106 U F C /m L .
■ Colocar los discos sobre el medio sembrado (de 2 a 4 discos por placa).
* Los antibióticos pueden ser: rifampicina, penicilina, carbenicilina,
sulfatrimetropin, doxiciclina, lincomicina, cloramfenicol, eritromicina,
ceñxima, kanamicina, norñoxacina, tetraciclina, estreptomicina (León,
1998).
26
■ Incubar las placas a 28 °C durante 3 a 10 días y evaluar el halo formado

alrededor del disco, medir el diámetro del halo en milímetros (Figura 5.5).
Siembra de Rhizobium y Bradyrhizobium

en caldo Levadura Manitol
I
Incubar a 28 °C por 2 -1 0 días
X /
Siembra del inoculo (10° cel/ml) en medio LMA
Colocación de discos de antibióticos

4 discos por placa (2 repeticiones)
1
Incubar a 28 °C por 2 - 1 2 días
i
Evaluación de la sensibilidad o resistencia de las cepas
FIGURA 5.5. Sensibilidad a antibióticos en disco
27
II. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION
DE BACTERIAS PGPR
6. A islam iento de bacterias prom otoras de crecim iento (PG PR )

7. Pruebas para bacterias prom otoras de crecimiento.
6. AISLAMIENTO DE BACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIEN

TO (PGPR)
6.1. Procesamiento de las muestras de rizósfera
El procesamiento se realiza de acuerdo al Tema 20, con la diferencia de que la
muestra es tom ada de la porción de suelo que se encuentra alrededor de las raíces
(rizósfera).
6.2. Aislamiento de Bacillus sp.
Para este ensayo se aplica la metodología A PH A (1992) y M erck (1994), pue
de realizarse un pre-tratamiento térmico para eliminar la microflora no deseada,
quedándonos únicamente con las esporas bacterianas.
El tratam iento térmico consiste en calentar el frasco con la muestra a la dilución
(-1) por 30 min en baño m aría a 80 °C. Después del tiempo indicado, se procede
a realizar las diluciones de m anera rutinaria.
■ Sembrar en placas Petri 1 m L de las diluciones (-2) hasta (-5) e incorporar
agar glucosa triptona extracto de carne (TGE) fundido tem perado a 45 °C,
hom ogenizar bien e incubar a 28 °C por 48 h.
■ Seleccionar colonias características de Bacillus y sembrar por estría en una
placa con medio TGE. Repetir este procedimiento por aproximadamente 2
veces hasta obtener un cultivo puro.
■ Para confirmar la pureza se debe realizar una tinción Gram. Se debe observar
la morfología al microscopio para verificar la presencia de bacilos Gram posi
tivos.
■ U na vez obtenidos los aislamientos se deben guardar en agar TGE inclinado
a 4 °C para su m antenim iento hasta un máximo de 6 meses.
Las colonias del género Bacillus sp. se caracterizan por ser blanquecinas mucosas
o secas con bordes irregulares. Algunas colonias van a presentarse más compac
tas y otras más dispersas dado que el microorganismo es mótil y pueden hallarse
colonias muy invasivas.
6.3. Aislamientos de Azotobacter sp.
El procesamiento de la muestra se realiza de igual m anera que en el Tema 20 y se
realizan diluciones para el aislamiento del microorganismo según Zapater (1975).
■ Colocar 1 mL de las diluciones (-2) hasta (-5) en tubos que contienen medio
mineral sin nitrógeno con el indicador azul de bromotimol (ABT) al 0.5%
y por triplicado.
■ Incubar a 28 °C por 7 - 1 0 días.
■ Los tubos se reportan como positivos cuando hay viraje de color a amarillo,
presencia de turbidez y formación de un velo en la superficie del caldo.
■ Tomar una alícuota de los tubos positivos y estriar en una placa que contiene
medio mineral sin nitrógeno.
■ Incubar a 28 °C por 3 - 5 días.
■ Repetir este procedimiento por 2 veces hasta obtener un cultivo puro.
■ Para confirmar la pureza, se debe realizar una tinción G ram y observar la
31
D O RIS ELIZA B ETH ZU N IG A D A V ILA
morfología al microscopio para verificar la presencia de Azotobacter spp. que

son gram negativos.
■ U na vez obtenidos los aislamientos se deben guardar en cuñas con medio
mineral sin nitrógeno a 4 °C para su mantenimiento hasta un máximo de 6
meses.
En los tubos que contienen el medio sin nitrógeno es muy importante verificar la
formación de velos que son estructuras en forma de película o aspecto filamento
so entrelazados (observar al microscopio para no confundir con micelio de hon
gos). Además de la formación de turbidez en el medio, los tubos positivos serán
aquellos que presenten velo y /o turbidez.
Dado que el medio de cultivo no contiene nitrógeno, es bastante selectivo y solo per
mite que las bacterias que son fijadoras Ubres de nitrógeno puedan crecer. Las colo
nias de Azotobacter spp. en placa presentan en general una morfología característica,
son traslúcidas, de consistencia mucosa, superficie húmeda y poco convexas.
6.4. Aislamiento de actinomicetos
Los actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas G ram positivas. Como
resultado de un adecuado crecimiento y ramificación, se forma una estructura
ramificada de filamentos, denom inada micelio, el mismo que aún siendo de di
mensiones bacterianas es análogo al micelio que forman los hongos filamentosos.
M uchos actinomicetos forman esporas por esta razón. Las colonias son fáciles de
reconocer por presentar una forma redondeada a m anera de costra; el color suele
ser muy variable: blancas, verdes, rojas, moradas, grises, marrones, entre otros y
su aspecto es espolvoreado en la superficie. Adicionalmente las placas que con
tienen actinomicetos suelen presentar un olor característico a mohoso o a tierra
de campos recién arados.
Se sigue la metodología del APHA-AWWA-WPCF (1998).
* El procesamiento de la muestra se realiza de igual m anera que en el Tema 20
y se realizan diluciones sucesivas para el crecimiento del microorganismo y
su posterior aislamiento.
■ Sembrar por incorporación, lm L de las diluciones (-2) hasta (-5) en placas con
medio de almidón-caseína suplementado con fluconazol (al 0.25 % para inhi
bir el crecimiento de hongos), homogenizar e incubar a 28 °C por 6 - 7días.
■ Seleccionar una colonia característica de Actinomiceto y sembrar por estría
en una placa con medio alm idón - caseína. Repetir este procedimiento por 2
veces hasta obtener un cultivo puro.
■ Para confirmar la pureza se debe observar el microscopio las colonias selec
cionadas y visualizar las estructuras características.
■ U na vez obtenidos los aislamientos se deben guardar en agar triptona glucosa
(TGA) inclinado a 4 °C para su mantenimiento hasta un máximo de 6 meses.
7. PRUEBAS PARA BACTERIAS PROMOTORAS D E CRECIMIENTO
Las siguientes pruebas: producción de ácido indol-acético, solubilización de fos
fato, antagonismo contra hongos fitopatógenos y ensayos de prom oción de la
germinación, son utilizadas para determ inar las capacidades prom otoras de cre
cimiento (PGPR), que en nuestro caso, se han utilizado de m anera eficiente en
Rhizobium, Bacillus y Azotobacter.
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RH1ZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD
7.1. Detección de Ácido Indol Acético (AIA)

Se utiliza la metodología para bacterias del grupo de Pseudomonas seguida por
N aik y Sakthivel (2005) y m odificada para cepas de Rhizobium y otros m icroorga
nismos PGPR.
■ Reactivar las cepas en estudio.
■ Sembrar una colonia de cada cepa en tubos con medio líquido específico
para cada microorganismo y suplementado con 5 mM de L-triptofano.
■ Incubar aproximadamente por 5 - 7 días a 28 °C.
■ Emplear controles positivos con cepas productoras de AIA y controles nega
tivos.
Evaluación
* Tomar una alícuota de 100 pL del caldo bacteriano respectivo y adicionar 400
pL del reactivo de Salkowski
* Homogenizar con cuidado.
■ Incubar en oscuridad por 30 min.
■ Se reporta como positivo si el medio vira de amarillo claro a tonos rojizos
(Figura 7.1).
Reactivar las ceDas
Sembrar en un tubo con medio apropiado + 5 mM L- triptófano
Incubar a 28 °C por 5 días

y tom ar 100 jjL del cultivo
Agregar 400 pL del

reactivo Salkowski,
Incubar en oscuridad y observar cambio de coloración
FIGURA 7.1. Método de detección del ácido indol acético
33
D O RIS ELIZA B ETH Z Ú Ñ IG A DÁ V ILA
7.2. Detección de bacterias solubilizadoras de fosfato

La metodología de solubilizadores de fosfatos se tom ó en base al protocolo utili
zado por Nautiyal (1999).
■ Reactivar las cepas en estudio.
■ Sembrar por estría en el medio de cultivo National Botanical Research Institute’s
phosphate growth médium (NBRIP) con fosfato bicalcico o tricalcico.
■ Incubar las placas por 5 - 1 5 días a 28 °C
Evaluación
■ Se tom arán como positivas las cepas que crezcan en el medio de cultivo y
muestren presencia de un halo transparente alrededor de la estría (Figura 7.2).
Cultivo en estudio
Sembrar la cepa con una estría en el

medio para solubilizadores de fosfatos
Observar crecimiento de la cepa y formación

de halo alrededor.
FIGURA 7.2. Método de detección de bacteria solubilizadoras de fosfato
7.3. Prueba de antagonismo contra hongos fítopatógenos

Esta metodología puede ser adaptada a las bacterias que se deseen probar, los
ensayos se realizan de acuerdo a A hm ed et al. (2005).
* Reactivar las cepas de bacterias que se van a utilizar.
■ Dividir una placa con agar papa dextrosa (PDA) en un máxim o de 4 cuadran
tes m arcando el punto central de la placa y una línea equidistante del centro
en cada cuadrante.
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RJHIZOBIUM, PGFRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD
■ En cada una de las líneas se sembrarán las diferentes cepas a probar y se

incubarán a 28 °C hasta obtener su crecimiento (puede variar según él genero
de bacteria a utilizar).
■ Simultáneamente se hará crecer en una placa con medio PDA el hongo fito-
patógeno hasta obtener un crecimiento del micelio que llegue a cubrir toda
la placa.
■ Con un sacabocado de 1 cm. de diámetro retirar una porción del micelio del
hongo ya crecido y colocarla boca abajo en el centro de la placa que contiene
las bacterias.
■ Se debe utilizar una placa control donde solo se sembrará el hongo sin bac
teria y placas donde se prueben cepas como controles positivos y negativos.
Todo el ensayo se realiza por duplicado.
■ Incubar a la tem peratura óptima del hongo.
■ Evaluar si hay inhibición del crecimiento del hongo por las bacterias después
de que la placa control haya completado su crecimiento (Figura 7.3).
■ M edir las áreas de inhibición alrededor de cada cepa bacteriana.
Micelio del hongo en placa de PDA
Reportar como cepas positivas

aquellas que presenten un halo Placa control con micelio
evidente alrededor de la bacteria del hongo.
FIGURA 7.3. Prueba de antagonismo contra hongos fitopatógenos
35
1
D O RIS ELIZA B ETH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA
7.4. Efecto de la inoculación con PGPRs en la germinación de diferentes cul

tivos.
Desinfección de semillas e inoculación
• Se utilizan semillas de diferentes cultivos a las que se les hace una prueba de
germinación previa.
■ Las semillas se desinfectan en alcohol de 96 ° por 2 - 5 minutos dependiendo
del tam año (Figura 4.1).
■ Se enjuagan con agua destilada estéril hasta eliminar los residuos de alcohol.
■ Se procede a embeber las semillas con los inóculos que contenga una pobla
ción bacteriana de 106 cel/m L.
■ El tiempo de inhibición va a depender de cada tipo de semilla por ejemplo
para tom ate se inbebe por dos horas y para frijol por tres.
■ Con ayuda de pinzas estériles se tom an 20 semillas y se colocan en placas Pe-
tri de 18 x 140 m m con papel filtro y papel toalla, esterilizados. La cantidad
de semillas por placa depende del tam año de la semilla.
■ U na vez colocadas las semillas en la placa asegurarse que el papel este hú
medo, para eso se puede adicionar con pipeta agua destilada estéril sobre el
papel.
■ El número de repeticiones recomendadas es de 4 placas por tratamiento.
■ Es im portante tener un control solo con agua destilada estéril y otro con el
medio de cultivo sin bacteria.
■ Las placas se envuelven en papel y se colocan en una cám ara temperada, la
tem peratura adecuada va a depender de los requerimientos fisiológicos de
cada semilla.
Evaluación de la germinación
La germinación de semillas se evalúa cada 24 horas por un periodo determinado
de germinación para cada tipo de semilla, teniendo en cuenta el porcentaje de
germinación y la forma y tam año de la radícula. Se siguió la metodología de
M ishra (1998).
36
III. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR E
INTERPRETACIÓN DE DATOS MEDIANTE
AMPLIFICACIÓN BOX - PCR
8. N o ta s generales p a ra h a c e r P C R
9. E x trac ció n de A D N p o r lisis alcalin a
10. V erificación de la ca lid ad del A D N extraído
(co n tro l de calidad)
11. A m p lificació n B O X - P C R
12. A g ru p a m ie n to de perfiles B O X - P C R sem ejantes
13. A m p lificació n del gen rib o so m al 16s
14. P u rificació n del p ro d u c to de P C R
15. S ecu en ciam ien to
16. E la b o ra c ió n de árboles filogenéticos
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos del suelo presentan un rol relevante para el m antenim ien
to de la vida, la fertilidad, la calidad y el equilibrio en el ecosistema. Estudiar
su diversidad resulta importante, porque estos microorganismos forman parte de
comunidades muy complejas y dinámicas conformadas por numerosas especies.
Para entender la función e interacción de cada uno de los miembros que confor
m an estas comunidades en los nichos específicos es esencial la identificación de
los mismos.
La técnica de reacción de la cadena polimerasa dirigida a rDNA 16s ha sido uti
lizada ampliamente en el estudio de la diversidad en procariotas. El m étodo de
rep-PCR es utilizado en bacterias y proporciona un fingerprint de la estructura
cromosómica, la cual es considerada variable entre cepas y por comparación, se
pueden detectar diferencias a nivel intra e interespecíficas.
8. NOTAS GENERALES PARA HACER PCR

1. Trabajar siempre en un lugar limpio y de preferencia con guantes. Cualquier
contam inante puede ser una fuente de ADN.
2. Usar puntas (tips) nuevas y estériles.
3. Cambiar de punta siempre que se vaya a agregar el siguiente reactivo.
4. Los volúmenes de los reactivos para las reacciones de P C R dependen de las
concentraciones de las soluciones stocks disponibles. De m anera que siempre
se m antengan las concentraciones especificadas en las condiciones de amplifi
cación.
5. Incluir siempre un control positivo con un A D N en buen estado y un control
negativo sin ADN.
6. Usar agua de grado molecular autoclavada tres veces y dispensadas en alícuo
tas de 1.5 mL en tubos eppendorf.
7. Cuando se preparan las mezclas para PCR, m antener todos los reactivos, in
cluyendo las muestras, en hielo picado. G uardar los reactivos a -20 °C lo más
rápido posible después de utilizarlos.
8. Si se tienen dos tampones de PCR [KC1 y S 0 4(NH4)2]. Usar por defecto en
reacciones rutinarias el que trae KC1. El otro se usa para amplificaciones que
empleen mayores concentraciones de MgClr
9. Seguir el siguiente orden al m om ento de agregar los reactivos a los tubos para
hacer PCR:
a. Agua milli-Q. Agua desionizada ultra pura.
b. Buffer KC1. Otorga las condiciones óptimas para la actividad de la Taq A D N
polimerasa.
39
D O RIS EL IZA B ETH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA
c. MgCl,. Influye en la fuerza de la interacción entre los primers y el A D N molde.

d. Dimetil sulfóxido (DMSO) -si es que es necesario-. Inhibe la formación de
estructuras secundarias en el A D N molde o primers.
e. Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs). Son las bases de nucleótidos que
la Taq A D N polimerasa utiliza para la extensión de las cadenas de ADN.
f. M uestra
g. Primer(s). Fragmentos cortos de una cadena simple de A D N (15-30 nucleó
tidos) que son complementarios a las secuencias que flanquean la región de
A D N de interés. El propósito de los primers PCR es proveer un grupo libre
3’-OH para que la A D N polimerasa pueda añadir dNTPs.
h. Taq A D N polimerasa. Aislada de la bacteria Thermus aquaticus. Puede sinteti
zar A D N de m anera eficiente bajo condiciones de calor intenso.
10. Cuando se trabajen más de 3 muestras, es posible realizar una sola mezcla de
reacción. Se multiplican todos los volúmenes de los reactivos listados en el
punto anterior, por el núm ero de muestras que se vayan a ensayar, más una
adicional. Luego de repartir la mezcla en los tubos para PCR, se agrega la
muestra respectiva.
11. Después de adicionar todos los reactivos necesarios y la muestra en el tubo,
se dan unos ligeros golpes al tubo para homogeneizar la mezcla de reacción,
evitar formar burbujas y centrifugar por 15 segundos a 13000 rpm. Finalmente
colocar los tubos en el termociclador.
9. EXTRACCIÓN DE A D N POR LISIS ALCALINA
El aislamiento del A D N genómico se basa en su liberación a través de lisis celular
y el aislamiento de proteínas, polisacáridos y lípidos. El método se desarrolla se
gún lo establecido por Herrera-Cervera et al. (1999) y modificado por M atsubara
(2010). (Método para lisis de bradyrhizobios).
A . Materiales y equipos
Cultivo microbiano de la noche anterior, crecido en caldo Triptona - Extracto
de levadura (TY)
■ M icrocentrífuga a 12000 rpm
■ Refrigeradora a 4 °C
■ Baño de agua a 80 °C
■ Baño de agua a 37 °C
■ Vortex
■ N aO H 0.05 M
■ Dodecil sulfato de sodio (SDS) 0.25 %
■ 2 (iL, 1 - 10 pL, 10 -100 pL y de 100 - 1000 pL
■ Tips de 10 pL, 100 pL y 1000 pL (estériles y de prim er uso)
■ Microtubos de 2 mL
40
B. Procedimiento
1. Tomar con un palillo estéril masa bacteriana “fresca” crecida en placa.
2. Resuspender los microorganismos en un microtubo conteniendo 20 pL de
una solución NaO H 0.05 M y SDS 0.25 %. Hom ogeneizar haciendo uso de
un vortex.
3. Colocar en baño de agua a 80 °C por 15 min.
4. Colocar en baño de hielo por 10 min y homogeneizar con vortex.
5. Agregar 200 pL de agua milli-Q estéril. Homogeneizar.
6. Centrifugar 5 min a 12000 revoluciones por minuto (rpm).
7. Trasvasar el sobrenadante a un microtubo limpio y conservar a 4 °C.
10. VERIFICACIÓN DE LA CALIDAD DE A D N EXTRAÍDO (CONTROL
DE CALIDAD)
■ Balanza digital de 200 g de capacidad
■ Horno microondas
■ Probetas de 100 y 1000 mL
■ Micropipetas de 0.1 - 2 pL y 1 - 10 pL
■ Tips de 10 pL
■ Cámaras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 10 cm
■ Fuente de poder de voltaje y tiempo regulable
■ Transluminador de luz UV
■ Cám ara digital
■ Buffer de carga (6X D N A Loading dye, Fermentas Inc. USA)
■ M arcador molecular Lam bda A D N 500 pg, Fermentas Inc. USA
- Buffer tris-borato-EDTA (TBE) IX
* Agarosa
■ Solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 pg/m L)
■ Agua destilada
B. Procedimiento
B .l Preparación del gel de agarosa 1%
1. Pesar 0.75 g de agarosa y mezclar con agua destilada (c.s.p. 75 mL).
2. Licuar el horno m icroondas hasta la completa disolución de los cristales de
agarosa.
3. Temperar a 50 °C y vertir en una bandeja electroforética de 15 x 10 cm, pre
viamente nivelada.
4. Colocar el peine que marca los pocilios de la bandeja.
5. Dejar solidificar, evitando la formación de burbujas.
6. Retirar las paredes de goma de la bandeja del gel y el peine, teniendo cuidado
de no dañar los pocilios de vertido de la muestra.
41
3 Q R IS ELIZA B ETH ZÚK 1G A D Á V ILA
B.2 Corrida electroforética de las muestras

7. Transferir la bandeja con el gel a la cámara de electroforesis.
8. La cámara de electroforesis es cargada con buffer TBE IX, hasta cubrir los
pocilios de muestra.
9. M ezclar 1 pL de buffer de carga con 5 pL de la muestra.
10. M ezclar 1 pL del m arcador molecular con 1 pL de buffer de carga y 4 pL de
agua milli-Q.
11. Cargar las mezclas realizadas con una micropipeta de 1 - 10 pL, dispensando
cada muestra en un pocilio del gel.
12. Cerrar la cámara de electroforesis y conectar los cables en sus electrodos co
rrespondientes.
13. Se programa la fuente de poder a 80 V por 60 min.
14. Iniciar la corrida.
B.3 Tinción del gel
15. Concluido el tiempo de corrida, trasladar cuidadosamente el gel a una ban
deja de solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 pg/m L), dejando reposar
durante 15 min.
16. Trasladar el gel de agarosa a la bandeja con agua destilada y dejar reposar
durante 10 min para su lavado.
17. Colocar el gel sobre el translum inador y encender la luz UV.
18. El gel revelado es observado a través el fotodocumentador.
11. AMPLIFICACIÓN BOX - PCR
* Termociclador
■ Micropipetas de 0.1 - 2 pL, 1 - 10 pL, 10 - 100 pL y de 100 - 1000 pL
■ M icrotubos de 1.5 mL
■ Tubos para PCR de 0.2 mL (estériles y de prim er uso)
■ Buffer de carga (6X DN A Loading dye, Fermentas)
■ Primer BOX A IR (5’ - CTA CG G CA A G G CG A CG CTG A CG - 3’) 10 pm ol/
mL
■ Buffer Taq KC1 10X
• Dimetil sulfóxido (DMSO) 100%
■ MgC12 25 mM
■ dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 m M cada uno)
■ Taq A D N polimerasa 5U /pL
■ Agua milli-Q
42
B. Procedimiento
B. 1 Mezcla de Reacción
1. Se realiza un master mix, multiplicando todos los volúmenes requeridos (Ta
bla 11.1) por el núm ero de muestras a ensayar más una adicional.
2. Dispensar la mezcla obtenida en cada uno de los tubos de PCR.
3. Se procede a colocar el volumen respectivo de A D N y agua milli-Q (c.s.p. 25
pL de reacción).
NOTA: La cantidad de A D N depende de la concentración del mismo en el

eluente de extracción, el cual se evalúa previamente en la verificación del ADN.
TABLA 11.1. Mezcla para reacciones de amplificación BOX-PCR
Reactivos Concentración Concentración Volumen

Inicial Final (25 pL)
Buffer KC1 (X) 10 1,00 2,50
MgCl2 (mM) 25 7,50 7,50
DMSO (%) 100 10,00 2,50
dNTPs (mM) 25 1,25 1,25
Primer BOX AIR (pmol/mL) 10 0,80 2,00
Taq ADN Polimerasa (U/pL) 5 0,08 0,40
ADN (pL) 5 -8
Agua milli-Q (pL) c.s.p. 25,00
B.2 Reacción de amplificación BOX-PCR

4. Introducir los tubos para PCR en el termociclador, previamente programado
para la reacción de amplificación BOX (Versalovic et al., 1991).
5. El perfil de temperaturas para el termociclador se muestra en la Tabla 11.2.
TABLA 11.2. Perfil de temperaturas para las reacciones de amplificación

BOX-PCR
Desnaturalización inicial 95 °C por 3 min
25 ciclos desnaturalización 93 °C por 45 segundos
annealing 53 °C por 1 min
extensión 65 °C por 8 min
Extensión final 65 °C por 16 min
43
DORJS EL IZ A B E TH Z Ú Ñ IG A DÁVILA
B.3 Comprobación de la amplificación por electroforesis

Materiales y equipos
■ Balanza digital de 200 g de capacidad
■ Probetas de 100 y 1000 mL
■ M icropipetas d e 0 . 1 - 2 p L y l - 1 0 p L
■ Tips de 10 pL
* Cám aras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 15 cm
■ Fuente de poder de voltaje y tiempo regulable
■ Translum inador de luz UV
■ Cám ara digital
■ Buffer de carga (6X D N A Loading dye, Fermentas)
■ M arcador m olecular Gene Ruler 1 kb A D N Ladder Plus (Fermentas Inc.,
USA)
■ Buffer TBE IX
■ Agarosa
■ Solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 pg/m L)
■ Agua destilada
■ Agua milli-Q
Procedimiento
1. Preparar agarosa al 1.5 % en buffer TBE IX y vertir en una bandeja electrofo-
rética para gel de 15 x 15 cm.
2. Introducir el gel dentro de la cámara de electroforesis conteniendo la misma
solución buffer.
3. M ezclar 1 pL del buffer de carga con 5 pL del amplificado.
4. M ezclar 1 pL del m arcador Gene Ruler 1 kb A D N Ladder Plus con 1 pL de
buffer de carga y 4 pL de agua milli-Q.
5. Se carga cada uno de los pocilios con los amplificados, colocando los marca
dores moleculares a los extremos del gel.
6. Se cierra la cámara de electroforesis y se conectan los cables en sus electrodos
correspondientes.
7. Las muestras son corridas a 80 V por 180 min.
8. El gel es revelado y observado a través del fotodocumentador.
44
12. AGRUPAMIENTO DE PERFILES BOX-PCR SEMEJANTES

A . Materiales
- Fotografías de los geles electroforéticos revelados con los productos de ampli
ficación BOX-PCR
- Software de edición fotográfica.
B. Procedimiento
1. Alinear las imágenes de los geles en función a los marcadores de peso molecular.
2. Com parar los perfiles BOX de cada una de las cepas ensayadas, buscando
bandas en com ún que muestren un mismo peso molecular.
3. Form ar agrupamientos de alta similitud, de m anera que los patrones de los
diferentes grupos obtenidos se diferencien unos de otros.
4. Para hacer comparaciones entre geles, se alinean las bandas de los marcadores
con un mismo peso molecular
Extracción del ADN bacteriano
1
Verificación de la calidad de ADN extraído
Am plificación BOX - PCR
Prim er BOX A1R

(5’-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3')
Gel de Agarosa al 1.5 %
Com probación de la am plificación por electroforesis
Revelado con Bromuro^de etidio, 0.5 pg/mL
Exposición al translum inador y tom as fotográficas

Agrupam iento de perfiles sim ilares
FIGURA 9. Caracterización molecular de cepas bacterianas
45
D O RIS EL IZ A B E TH Z Ú Ñ IG A DÁVILA
13. AMPLIFICACIÓN DEL GEN RIBOSOMAL 16s

La reacción de amplificación del gen ribosomal 16s se realiza con el fm de secuen-
ciarlo y determ inar la identidad de las cepas ensayadas.
A. Materiales y equipos
■ Termociclador Eppendorf
■ M icropipetas de 0.1 - 2 pL, 1 -1 0 pL, 10 -100 pL y de 100 - 1000 pL
■ M icrotubos de 1.5 mL
■ Tubos para PCR de 0.2 mL (estériles y de primer uso)
■ Buffer de carga (6X A D N Loading dye, Fermentas)
■ Primers:
■ fD 1: 5’ - CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3’
■ rD l: 5’ - CCCGG GATCCAAGCTTAAG GAGG TGATCCAGCC - 3’
- Buffer Taq KC110X
- M gCl2 25 mM
■ dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 m M cada uno)
■ Taq A D N polimerasa 5U /pL
■ Agua milli-Q
B. Procedimiento
B .l Mezcla de Reacción
1. Rotular debidamente los tubos de PCR.
2. Preparar una mezcla de reacción de 25 pL para cada una de las muestras a
ensayar. E n la Tabla 13.1 se detalla la formulación de la misma.
TABLA 13.1 Mezcla para reacciones de amplificación 16S

Reactivos Concentración Concentración Volumen
Inicial Final (25 pL)
Buffer KC1(X) 10 1,00 2,50
MgCl2 (mM) 25 1,50 1,50
dNTPs (mM) 10 0,50 0,20
Primer fDl (pmol/mL) 10 0,50 0,20
Primer rDl (pmol/mL) 10 0.50 0,20
Taq ADN Polimerasa (U/pL) 5 0.50 0,10
ADN (pL) 5
Agua milli-Q (pL) c.s.p. 25,00
B. 2 Reacción de amplificación
3. Introducir los tubos para PC R en el termociclador previamente programado
para la reacción de amplificación del gen ribosomal 16s.
46
4. El perfil de temperaturas para el termociclador se muestra en la Tabla 13.2.
TABLA 13.2 Perfil de temperaturas para las reacciones de amplificación del

gen ribosomal 16s
Desnaturalización inicial 93 °C por 2 min

30 ciclos desnaturalización 93 °C por 45 segundos
annealing 62 °C por 45 segundos
extensión 72 °C por 2 min.
Extensión final 72 °C por 5 min.
B.3 Comprobación de la amplificación por electroforesis

Materiales y equipos
* Lo requerido en la sección 11 - B.3, con la siguiente variante en la bandeja de
electroforesis y m arcador molecular:
■ Cámaras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 10 cm
■ M arcador m olecular Ladder A D N m arker (300 - 10000 pb), Fermentas Inc.
USA
Procedimiento
1. Preparar un gel de agarosa al 1 % en buffer TBE IX, en una bandeja electrofo-
rética para gel de 15 x 10 cm. Colocar el peine y dejar solidificar.
2. Proceder como lo señalado en el Tema 11, B.3
3. M ezclar 1 pL del m arcador molecular con 1 pL de buffer de carga y 4 pL de
agua milli-Q.
4. Cargar las muestras en los pocilios del gel y los marcadores moleculares a los
extremos del gel.
5. Cerrar la cámara de electroforesis y conectar los cables en sus electrodos co
rrespondientes.
6. Correr las muestras a 60 V por 150 m in aproximadamente o hasta que la ban
da más oscura del buffer alcance la m itad del largo del gel.
7. Revelar el gel con bromuro de etidio, enjuagarlo y observarlo a través del tras-
luminador.
14. PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR

Puede hacerse uso de kits comerciales de purificación de productos de PCR, los
cuales se basan en el empleo de columnas que contienen resinas con alta selectivi
dad y recuperación de fragmentos de ADN. Remueve los primers no constituidos
(< 50 nucleótidos), enzimas y mononucleótidos o sin marcar.
15. SECUENCIAMIENTO
Para la identificación por secuenciamiento del gen ribosomal 16s, las muestras son
enviadas a un laboratorio especializado en dichos servicios. En la Figura 15.1 se
muestra un cromatograma proporcionado como resultado del secuenciamiento.
47
DO RIS ELIZA B ETH Z Ú Ñ IG A DÁ V ILA
170 180 190

G C T T G 7 T T G .... CC GC. T G G T i C . . . C . . T . ' . . .
■ '
-A . . ; :i < ’
H ñ ! ':
u J ; .„ ; L J J G & u ii. \ i \ - i rl*L -4vJ•Í^J 'LjlrJ
290 300 10 32 330 340 350 360

G G ..G G G T G T C G G C C »CACT 3G G CTG . G ..C
f ; ' |Í
L J s lM ¿ u ^ h L. ) j ^ á M i
420 430 440
É ilk ... m m o I ^ M
FIGURA 15.1. Sección de nucleótidos proporcionados por un cromatograma
Tras el envío de las secuencias, se procede de la m anera siguiente:

Se adquiere un banco de secuencias de las posibles especies a la que pertenece el
microorganismo en cuestión: “N ational Center for Biotechnology Inform ation”
(http://w w w .ncbi.nlm .nih.gov/).
Lim piar y unir las secuencias dadas por cada Prim er (fD l y rD l), empleando
los programas BioEdit versión 7.0.5.3 y Chromas Lite versión 2.01, así como el
banco de secuencias.
Los programas BioEdit y Chromas Lite son utilizados para alinear las secuen
cias de las muestras con secuencias de especies ya conocidas y detectar posibles
errores en el cromatograma (Figuras 15.2 a 15.4), ya que muchas veces este tiene
bases solapadas o extras y la corrección ayuda a la definición de las posibles espe
cies con mayor afinidad.
FIGURA 15.2 Secuencias del banco de genes (genebank, NCBI) y cepa en estudio. Tras la obten
ción de secuencias similares a las secuencias en estudio por medio de la NCBI, se procede a limpiar
las secuencias por medio de los programas BioEdit (arriba) y CHROMAS Lite (abajo), el primero
se emplea para comparar la semejanza entre las bases de la secuencia de la muestra con las secuen
cia extraídas de la NCBI y el segundo para corroborar esta información con el cromatograma, ya
que en este se pueden observar los posibles errores de secuenciamiento.
48
FIGURA 15.3 Aplicación de ClustalW para la alineación de secuencias. La aplicación ClustalW

permite alinear todas las secuencias en el archivo, permitiendo así la comparación entre estas.
FIGURA 15.4 Secuencias alineadas para la corrección de posibles errores. El programa CHRO-
MAS, es determinante al momento de realizar las correcciones necesarias, ya que el cromatograma
permite determinar si la diferencia en una base es real o si existe un error en la lectura de este.
49
D O RIS ELIZA B ETH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA
16. ELABORACIÓN DE ÁRBOLES FILOGENÉTICOS

1. Se obtienen los datos de las secuencias del gen ribosomal 16s de distintas ce
pas patrón del género en estudio.
2. Las secuencias obtenidas son alineadas con las secuencias limpias de las
muestras. La aplicación ClustalW Múltiple Alignment del program a BioEdit
(Figura 16.1) es un sistema empleado para alinear secuencias homologas de
nucleótidos. Para la alineación de múltiples secuencias, ClustalW utiliza mé
todos de alineación progresiva, donde las secuencias más parecidas se alinean
primero y luego los grupos de secuencias cada vez más distantes hasta obtener
una alineación global.
3. Alineadas las secuencias, se cortan los extremos para que todas las secuencias
tengan la misma longitud.
4. Posteriormente se emplea el program a M E G A versión 4, en la opción “Phylo-
geny” se selecciona el m étodo estadístico “N EIG H B O R JO IN IN G ”, el cual
es empleado en estudios de evolución basados en técnicas moleculares. Este
tiene la capacidad de m anejar un amplio conjunto de datos, por lo que es uno
de los pocos métodos que permite la rápida inclusión de todas las secuencias
homologas en un solo árbol. En resumen este m étodo utiliza una matriz de
distancias, la cual va agrupando en parejas según la divergencia promedio
hasta llegar a una base.
5. Para evaluar la fidelidad del árbol filogenético construido, se emplea el test
de filogenias inferidas “bootstrap” , el cual crea un núm ero arbitrario de posi
bles dendogramas por medio de cambios puntuales en diferentes bases de las
secuencias y elige uno de consenso, así, en cada divergencia se muestra un
porcentaje el cual representa el núm ero de ramas que se han repetido del total
de árboles creados.
FIGURA 16.1 Alineación de cepas de referencia y cepas en estudio para la creación del dendogra-
ma. Se empleó nuevamente el programa BioEdit para la alineación de todas las secuencias en estu
dio corregidas y las secuencias de cepas tipo o de referencia para la construcción del dendograma.
50
IV. PRODUCCIÓN Y CONTROL DE CALIDAD
DE BIOFERTILIZANTES
17. P ro d u c c ió n de b iofertilizantes
18. C o n tro l de ca lid ad del b io fertilizan te
19. E n u m e ra c ió n de bacterias sim bióticas fijadoras de
n itró g en o p o r n ú m e ro m ás probable
17. PRODUCCION DE BIOFERTILIZANTES

De acuerdo a las necesidades, se pueden producir inoculantes líquidos o en so
portes sólidos. Estos soportes pueden ser o no esterilizados. El LEMYB M arino
Tabusso produce inoculantes en soportes sólidos según Orm eño y Zúñiga (1999a)
y recientemente inoculantes líquidos. La producción del inoculante sólido consta
de dos partes, la prim era incluye el incremento de biom asa celular del rhizobio
en un medio líquido de bajo costo (Ormeño y Zúñiga, 1998) y la segunda incluye
la preparación del soporte sólido y la respectiva incorporación de la población
bacteriana en este.
17.1. Producción de biomasa del rhizobio
■ Reactivar la cepa correspondiente en el medio LMA
■ Sembrar 2 asadas en 100 m L de caldo LM A e incubar en agitación a 100 rpm
a 28 °C por 24 a 48 h (cepa rápida) o 72 - 98 h (cepa lenta). Debe alcanzar una
concentración de 108 cel/m L aproximadamente (fase logarítmica).
■ Tomar 1 - 5 mL del caldo anterior y sembrar en matraces de 1000 o 5000 mL
conteniendo el medio modificado según Orm eño y Zúñiga (1998) e incubar
de la misma m anera que el paso anterior.
■ Com probar la pureza de la cepa (observación al microscopio) y concentra
ción de las células por densidad óptica o núm ero de células viables (Figura
17.1).
17.2. Preparación del soporte sólido
■ Secar el sustrato (suelo, compost, entre otros) a 60°C por 24 horas.
■ Tam izar el sustrato en malla de 2.25 mm.
■ M ezclar los sustratos en la proporción 2:3 (compost: suelo) y homogenizar.
■ Colocar 250 g de la mezcla en bolsas de polietileno.
■ Esterilizar tres veces consecutivas la bolsa con el soporte a 121°C y 15 Ib de
presión por 30 m in (modificado de Orm eño y Zúñiga (1999a).
■ Inocular el sustrato con el cultivo líquido de rhizobios (106 - 109 cel/m L).
■ Incubar a 28°C por 6 - 8 días.
■ Usar inm ediatam ente o refrigerar hasta su uso (4 - 8°C) (Figura 17.1).
Cantidad de inoculante Cantidad de semilla Diluyente (agua)

250 g 35 kg (semilla mediana: frijol) 600 mL
53
D O R IS E L IZ A B E TH ZÚ Ñ 1G A D Á V ILA
Cepa de Rhizobium
I
Siem bra en
m edio líquido
Siem bra en
m ayor
volum en
Em pacado en bolsas
de 250 g
Esterilizar a 121° C x
108- 109 cei/mL, 30 min por dos días
agitación
I
M aduración a 28 °C
por 7 días
I
Alm acenam iento a 4o C
por 3 a 6 m eses
agitación
FIGURA 17.1. Producción de biofertilizantes
54
17.3 Presentación del biofertilizante

17.3.1. Preparación de la ficha técnica
Deben considerarse los siguientes puntos para la presentación del fertilizante
1. Nom bre del producto: ECORIZO, inoculante para leguminosas de grano
2. Bondades: Las bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno interaccionan con
diversas leguminosas formando nodulos en las raíces y que son capaces de
transform ar el nitrógeno atmosférico en amonio. Este nutriente es asimilado
directamente por la planta favoreciendo su crecimiento, rendimiento y cali
dad de grano. Este inoculante disminuye los costos de producción, porque
reemplaza el uso de fertilizantes químicos y disminuye la contam inación del
ambiente.
3. Nom bre del cultivo sobre el cual puede aplicarse el producto: En este caso los
inoculantes son específicos para cada cultivo, por ejemplo: cultivo de pallar,
cultivo de frijol, cultivo de arveja holantao, cultivo de haba, cultivo de soya.
4. Lugar: Los inoculantes pueden ser específicos dependiendo de la zona de cul
tivo, así, pueden haber inoculantes específicos para el cultivo de pallar en la
región de lea y otros para la región de Barranca; de m anera similar existen
cepas para frijol en zonas de costa que difieren de zonas altoandinas.
5. Presentación: inoculantes en soporte sólido de 250 g y líquidos de 40 mL con
una concentración de 108 células/g ó 108 células/m L respectivamente.
17.3.2. Etiquetado
Debe m encionar el lote, fecha de producción y fecha de vencimiento
E C O R IZ O - I n o c u la n te s s a lu d a b le s p a r a c u ltiv o s L a b o r a to r io d e E c o lo g ía ^
M ic r o b ia n a y B io te c n o lo g ía M a r in o T a b u s s o - U N A L M . ¿
I N O C U L A N T E P A R A A R V E JA H O L A N T A O í'
P r e s e n ta c ió n F r a s c o x 4 0 m L , r in d e p a r a 3 0 k g d e s e m illa
C o n c e n tr a c ió n d e r h iz o b io s 10s c el/ m L
A p lic a c ió n M e z c la r u n if o r m e m e n te el in o c u la n te c o n 2 0 0 g d e s u e lo y la s e m i
lla. D e ja r s e c a r p o r 30 m in u to s b a jo la s o m b r a . S e m b ra r.
C o n s e r v a r e n re fr ig e r a c ió n h a s ta s u u s o . N o e x p o n e r las s e m illa s
P r e c a u c io n e s tr a ta d a s al s o l n i a v ie n to s d e s e c a n te s . U tiliz a r t o d o el p r o d u c to e n
el m o m e n to . U s a r g u a n te s p a r a la a p lic a c ió n .
L o te 003
F e c h a d e P r o d u c c ió n 1 5 -0 1 -2 0 1 2
F e c h a d e V e n c im ie n to 1 5 -0 3 -2 0 1 2
DO RIS EL IZ A B E TH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA
18. CONTROL D E CALIDAD DEL BIOFERTILIZANTE

18.1 Recuento de células viables de bacterias fijadoras de nitrógeno
Se utilizó la metodología según Ormeño y Zúñiga (1999b).
■ Suspender 10 g del inoculante en un m atraz conteniendo 90 m L de diluyente:
solución salina al 0.85% (dilución I d 1). Agitar vigorosamente por dos m inu
tos.
■ Con una pipeta estéril tom ar una alícuota de 1 mL de la suspensión anterior y
transferir a un tubo con 9 m L del diluyente (dilución 10'2). Realizar diluciones
sucesivas, hasta llegar a la dilución 10'8 (Figura 18.1).
■ Transferir a placas Petri, por duplicado, alícuotas de 1 mL de cada una de las
diluciones realizadas. Incorporar el medio de cultivo LM A temperado. Dejar
solidificar.
* Incubar las placas a 28 °C por 2-10 días.
■ Transcurrido el tiempo de incubación, realizar el conteo de colonias en pla
cas que contengan entre 30 y 300 colonias
Esta técnica puede utilizarse para el recuento de bacterias fijadoras de nitrógeno
de vida libre así como para bacterias prom otoras de crecimiento considerando el
medio de cultivo específico para cada caso.
También se puede utilizar la técnica del número más probable para cuantificar
bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno (Tema 19).
18.2. Capacidad infectiva y efectiva de los inoculantes en plántulas de legu
minosas
Este ensayo se realiza para com probar que el rhizobio en forma comercial (sopor
te sólido) mantiene su capacidad de nodular la planta y de fijar nitrógeno.
■ Inocular 1 g del inoculante almacenado durante el periodo de un mes, a cada
plántula cultivada en tubos de ensayos según Ormeño y Zúñiga (1999b). Fre
cuentemente se usan de 8 a 10 tubos. Paralelamente se instalan de 8 a 10
plántulas controles sin inocular.
■ Las plántulas son mantenidas por u n periodo de 30 días con un fotoperiodo
de 12 h de luz.
■ Cuidar el riego de dichas plántulas.
■ Evaluar la nodulación semanalmente (infectividad) y la m ateria seca a la co
secha (efectividad) y com parar los resultados con el control sin inocular.
18.3 Recuento de microorganismos contaminantes del biofertilizante
■ Recuento de bacterias aerobias mesófilas viables (descrito en el Tema 21.1)
" Recuento de hongos totales (descrito en el Tema 22)
■ Recuento de actinomicetos (descrito en el Tema 23)
18.4 Análisis físico-químico
■ Determ inación de la hum edad, tem peratura y conductividad eléctrica del
inoculante.
Inoculante
10 g
10"'
1 mL
Tubos con 9 mL
S.S. 0.85%
10“ 10“ 10-4 ... 1(T
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
r i' ir i
Incorporar
medio LMA
Incubar a 28 °C por 2 -10 días
1
Elegir las placas con 30 - 300 colonias
y realizar el conteo
FIGURA 18.1. Control de calidad de biofertilizantes
57
DO K IS ELIZA B ETH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA
19. ENUMERACIÓN DE BACTERIAS SIMBIOTICAS FIJADORAS DE

NITRÓGENO POR NÚMERO MÁS PROBABLE
Este m étodo se emplea de acuerdo a Somasegaran y Hoben (1985).
■ Tomar 10 g de suelo o del inoculante y agregar a un m atraz con 90 mL de
solución salina al 0.85% (diluyente). Agitar vigorosamente por dos minutos
(dilución 10'), con una pipeta estéril tom ar 1 m L de la suspensión y transfe
rir a un tubo con 9 m L de solución salina al 0.85% (dñución 10'2) y así suce
sivamente hasta llegar a la dilución 10'5.
■ Tomar 1 mL cada una de las diluciones e inocular a cada uno de los cuatro
tubos que contienen plantas de trébol blanco (Trifolium repens) de una semana
de crecimiento (Figura 19.1).
■ Incubar las plantas en la cám ara de crecimiento a 18 - 22 °C por 4 semanas.
■ Luego de cuatro semanas evaluar la presencia o ausencia de nodulos en la
raíz y utilizar la tabla de N úm ero M ás Probable (NMP) para la cuantificación
(Anexo N° 3, Tabla A .3.4).
58
m a n u a l d e m ic r o b io l o g ía a g r íc o l a r h iz o b iu m , pgprs , in d ic a d o r e s d e f e r t il id a d e in o c u id a d
Suelo
10 g
1
l
' \
90 mL
10-1 S.S.0.85%
1 mL
1 mL 1 mL
Tubos con 9
mL S.S. 0.85%
1 0': 10r3 10'4 ... 10'5
1 mL 1 mL 1 mL 1 1 mL
Inocular cada dilución en cuatro tubos con plántulas
u u u
i
Incubar a 22 - 24°C p o r 2 8 d ía s
t
Evaluar la presencia de nodulos cada 7 días y
contar el número de plantas noduladas
i
Expresar los resultados en N M P /g
FIGURA 19.1 Cuantificación de Rhizobium por numero más p ro b a b le .
59
V. INDICADORES DE LA FERTILIDAD
BIOLOGICA DEL SUELO
20. Preparación de muestras y diluciones
21. Recuento de bacterias
22. Recuento de hongos totales
23. Recuento de bacterias anaerobias mesófilas
24. Enumeración de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre
26. Actividad microbiana
INTRODUCCIÓN
l componente microbiológico del suelo puede ser útil como indicador del
E estado general del suelo, pues una buena actividad microbiana, es reflejo
de condiciones fisicoquímicas óptimas para el desarrollo de procesos me-
tabólicos de microorganismos (bacterias, hongos y actinomicetos) que actúan
sobre sustratos orgánicos y cultivos asociados.
Para evaluar la calidad del compost como inoculante, también se tom a en cuenta
el factor microbiano. El compost term inado debe contener al menos 108 U F C /g
de peso seco de bacterias aerobias y estar en relación 10:1o mayor a las bacterias
anaerobias. Además, la carga de mohos y levaduras debe estar en 103-104 U F C /g
y la de actinomicetos entre 106-108 U F C /g. U n compost de mala calidad puede
estar asociado a inm adurez del procesamiento y puede inhibir la germinación de
semillas o causar una rápida disminución del nitrógeno del suelo.
Por otro lado, la medición de C 0 2 producido es una estimación de la actividad y

por tanto de la presencia microbiana. Tal actividad varía en función de muchos
factores, como el uso del suelo, mineralogía, cobertura vegetal, prácticas de m ane
jo, calidad de los residuos que entran al sistema, factores ambientales, entre otros.
De esta m anera podem os afirmar que la actividad m icrobiana nos da idea de la
biota del suelo y puede ser un parám etro útil para la medición de su fertilidad.
63
20. PREPARACIÓN DE MUESTRAS Y DILUCIONES

20.1. Diluyente
M uchos diluyentes pueden ser utilizados, como el agua destilada, la solución sali
na al 0.85 %, agua tam ponada, entre otros. Un diluyente de uso general es el agua
peptonada al 0.1 %.
Agua tam ponada Disolver 34 g K H 2P 0 4 / L de agua destilada.

pH 7.2 ±0. 5.
Añadir 1.5 mL de esta solución y 5 m L de una solución de
MgCl2 (81.1 g de MgCl2.6H20 / l L ) en 1 L de agua.
Agua peptonada 1 g de peptona/ 1 L de agua destilada
N o deben suspenderse las bacterias en el diluyente por más de 30 m in a tempera

tura ambiente ya que puede producir la muerte o la multiplicación de las mismas.
20.2 Método
La técnica empleada va de acuerdo al Standard M ethods (1998)
* Antes de proceder al estudio rotular cada tubo con el número de dilución
correspondiente.
■ Pesar 10 g de muestra sólida ó 10 mL de muestras líquidas y adicionarlo a 90
m L del diluyente, así se obtiene una dilución 1 0 1 (Figura 20.1).
■ M ezclar cuidadosamente las muestras m ediante unos 25 movimientos com
pletos de arriba a abajo (y de delante a atrás). También se puede utilizar un
agitador mecánico.
■ Tomar 1 mL de la dilución 10'1y adicionarlo en u n tubo que contiene 9 mL
del diluyente, obteniéndose una dilución de 10 u Homogenizar.
■ Repetir el paso anterior hasta la dilución conveniente de acuerdo a la muestra.
Nota: Al extraer la muestra, las pipetas no se introducen más de 2.5 cm por deba
jo del nivel de la superficie de la dilución.
1 mL 1 mL
Muestra 10'1 10'2 10‘3
FIGURA 20.1. Preparación de muestras y diluciones
65
21. RECUENTO DE BACTERIAS

21.1 RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS VIABLES
El procedimiento empleado (APHA, 1992), se realiza para la estimación de bacte
rias mesófilas en muestras de suelo, humus, bioles, compost y otros relacionados.
■ Pesar 10 g de suelo y se agregar a un m atraz con 90 m L de solución salina
al 0.85% (diluyente). Agitar vigorosamente por dos minutos (dilución 104).
■ Con una pipeta estéril, tom ar lm L de la suspensión y transferir a un tubo
con 9 mL de solución salina al 0.85% (dilución 10'2) y así sucesivamente hasta
llegar a la dilución 10’6.
■ Transferir alícuotas de 1 mL de las diluciones realizadas a placas Petri esté
riles (dos placas por dilución) e incorporar el medio de cultivo Píate Count.
Homogenizar.
■ Incubar a 28 °C por 48 h.
■ Hacer el recuento de colonias en placas que contengan entre 30 - 300 colonias.
■ Expresar los resultados en U F C /g de suelo seco (Figura 21.1)
21.2 RECUENTO DE HETERÓTROFOS
El Standard M ethods (2000) considera el m étodo “Pour píate” (9215B), en la
estimación del núm ero de bacterias heterotróficas viables en agua, tratamientos
de agua y aguas de piscina.
■ M edir 10 mL de muestra y agregar a un m atraz con 90 m L de agua peptona-
da 0.1% (diluyente). Hom ogenizar (dilución 104).
■ Con una pipeta estéril, tom ar lm L de la suspensión y transferir a un tubo
con 9 mL de solución salina al 0.85% (dilución 10 z) y así sucesivamente hasta
alcanzar el núm ero de diluciones necesarias.
■ Transferir alícuotas de 1 m L de las diluciones realizadas a placas Petri estéri
les (dos placas por dñución). De ser conveniente, de acuerdo a la naturaleza
de la muestra, sembrar por duplicado, 1 m L de la muestra original.
■ Incorporar el medio de cultivo Píate Count. Homogenizar.
■ Incubar a 35 °C por 48 h.
■ Hacer el recuento de colonias en placas que contengan entre 30-300 colonias.
■ Expresar los resultados en U F C /m L (Figura 21.2).
66
Muestra
10 g 1 mL 1 mL 1 mL
9 mL 9 mL 9 mL 9 mL
SS 0.85% SS 0.85% SS 0.85% SS 0.85%
10-1 10-2 10-3 10-4 ... 10-6
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
' T
Incorporar agar píate count
1
Incubar a 28 °C por 48 h
1
Elegir las placas que contengan entre 30 - 300 colonias
I -
Expresión de resultados: UFC/g suelo seco
FIGURA 21.1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas viables
67
D O RIS ELIZA B ETH ZTÍÑIGA D Á V ILA
10 mL 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
i r ' r ▼
lí
Incorporar Agar Píate Count
i
Incubar a 35°C por 48 h
i
i
Expresión de Resultados: UFC/mL
FIGURA 21.2. Recuento de heterótrofos
68
22. RECUENTO DE HONGOS TOTALES

Se aplica la metodología recom endada por M erck (1994).
■ Pesar 10 g de suelo y colocarlo en un m atraz con 90 mL de solución salina
al 0.85 % (diluyente). Agitar vigorosamente por dos minutos (dilución 1 0 1).
■ Con una pipeta estéril tom ar 1 m L de la suspensión y transferir a un tubo
con 9 mL de solución salina al 0.85% (dilución 10'2) y así sucesivamente hasta
llegar a la dilución 10'5.
■ Transferir alícuotas de lm L de las diluciones realizadas a placas Petri esté
riles (dos placas por dilución) e incorporar el medio de cultivo Czapeck o
papa-dextrosa-agar (PDA). Para inhibir la población bacteriana se recomien
da bajar el pH del medio a 4 ó adicionar 30 m g / L de estreptomicina.
■ Hacer el conteo de colonias en las placas que contengan entre 8 - 8 0 colonias.
■ Expresar los resultados en U F C /g de suelo seco (Figura 21.1)
ii it ii ii ii |i i|
Incorporar agar - papa - dextrosa (APD)
i
Incubar a 22 °C por 3-5 días
4
Elegir las placas que contengan entre 8 - 8 0 colonias
4
FIGURA 22.1. Recuento de hongos totales
69
D O RIS BLIZA BETH Z Ú Ñ IG A DÁVILA
23. RECUENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS MESÓFILAS

M erck (1994), recomienda la siguiente metodología para el recuento de bacterias
anaerobias mesóñlas:
■ Pesar 10 g de la m uestra y diluir con agua peptona, agitar por 2 min. Realizar
diluciones hasta 10'3.
■ Transferir 1 m L de cada dilución por duplicado, adicionar agar triptona sulfi-
to neom icina (TSN) y homogenizar.
■ Dejar solidificar. Invertir las placas e introducirlas en una jarra de anaerobiosis.
* Incubar a 35 °C durante 24 horas.
* Hacer el conteo de colonias en placas que contengan de 30 - 300 colonias.
■ Expresar los resultados como U F C /g de suelo seco (Figura 23.1).
9 mL
A P 0 .1%
1 mL
'i. .... ii ii H ii ii
In c o rp o ra r m e d io T S N
In c u b a r en ja rra de a n a e ro b io s is a 35 ± 1 °C p o r 2 4 h
I
R e a liza r el c o n te o en p la ca s q ue co n te n g a n e n tre 30 — 3 00 c o lo n ia s
i
E xp re sió n de R e su lta d o s: U F C /g su e lo seco
FIGURA 23.1. Recuento de bacterias anaerobias mesófilas
70
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD
24. RECUENTO DE ACTINOMICETOS

Se sigue el m étodo descrito en APHA-AWWA-WEF (1998)
■ Pesar 10 g de la muestra y diluir con agua peptona, agitar por 2 min. Realizar
diluciones hasta 10'5.
■ Transferir 1 m L de cada dilución por duplicado, adicionar 18 mL de agar
alm idón - caseína y homogenizar.
■ Sembrar por incorporación usando 1 mL de las diluciones -2 hasta -5 con
agar alm idón - caseína suplementado con fluconazol al 0.25 % para inhibir el
crecimiento de hongos.
■ Hacer el conteo de colonias en placas que contengan de 30 - 300 colonias.
Reportar como U F C /gram o de suelo seco (Figura 24.1).
Muestra
Incorporar agar almidón - caseína suplementado con fluconazol 0.25 %
I
Incubar a 28 °C por 6 - 7 días
1
i
FIGURA 24.1. Recuento de actinomicetos
71
D O RIS ELIZA B ETH /.Ú Ñ IG A DÁVILA
25. ENUMERACIÓN DE BACTERIAS FIJADORAS DE NITRÓGENO

DE VIDA LIBRE
Recuento de Azotobacter sp.

* Tomar 10 g de suelo de rizósfera y agregar en un m atraz con 90 mL de solu
ción salina 0.85 %. Agitar vigorosamente .
■ Se debe colocar lm L de las diluciones -2 hasta -4 en tubos que contienen cal
do sin nitrógeno (Zapater, 1975). Se consideran 3 tubos por dilución.
■ Se incuba a 28°C por 7 -10 días (Figura 25.1).
■ Se realiza el conteo de los tubos positivos de cada una de las diluciones ob
servando viraje de color, turbidez y la formación de un velo en la superficie
del caldo, se expresa este conteo en N M P /g (gramo de rizósfera seca) (Anexo
N° 3, Tabla A .3.1)
Suelo
Tubos con 9 mL
AP 0.1 %
1 mL /tb 1 mL /tb 1 mL /tb

1
I . 10 mL caldo mineral
| sin nitrógeno - ABT
Incubar a 28 + 1 °C por 7 - 10 días
1
Viraie de color a amarillo se reoorta como positivos
i
Leer los tubos positivos y consultar la tabla de NMP
para reportar el resultado final
FIGURA 25.1. Enumeración de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre
72
26. ACTIVIDAD MICROBIANA

Pre - tratamiento de la Muestra
El suelo colectado debe ser gentilmente aireado, hasta alcanzar una hum edad
conveniente para el tamizado. Se procede al retiro de todo material o residuo
vegetal de la porción de suelo obtenida.
Se realiza el tam izado del suelo a un tam año m áxim o de partícula de 500 gm y se
almacena en frascos de vidrio a tem peratura ambiente hasta el análisis respectivo.
U na porción de suelo es separada para ensayar el contenido de hum edad gravi-
métrica.
26.1. Determinación de la respiración de los microorganismos del suelo
Este ensayo se realiza de acuerdo a la metodología de Anderson (1982).
■ Los sistemas a instalar consisten en un recipiente plástico de 250 g de capaci
dad, con 25 g de suelo tam izado (peso húmedo).
■ A cada sistema, se añade 0.5 mL de solución de glucosa al 25%. M ezclar
* Se introduce un pequeño vial conteniendo 3.5 mL de solución N aO H 1N,
inmediatamente se cierra el sistema y se sella con cinta parafilm.
■ Del mismo m odo se instala un recipiente vacío que sirve como blanco.
■ Los sistemas, junto con el blanco, se incuban a 28°C por 24 horas.
■ Cumplido el periodo de incubación, se retira el vial del sistema colector y se
trasvasa su contenido y el de su agua de enjuague (agua destilada) hacia un
m atraz de 250 mL de capacidad.
■ Añadir 3.5 mL de BaCl2y el N aO H no combinado es titulado con HC10.25N
en presencia de fenolftaleína (Figura 26.1).
■ Calcular los resultados:
■ Vol. N aO H convertido en N a ,C 0 3 (mL) = gasto HC1 blanco (mL) - gasto
HC1 sistema (mL)
■ C 0 2 (mg) = Vol. N aO H convertido en N a2C 0 3 (mL) x N HC1 x 22
Donde:
N: norm alidad del HC1
26.2. Determinación de la actividad deshidrogenasa de los microorganismos
del suelo
La actividad deshidrogenasa en suelos, se determ ina por reducción de sales tetra-
zolium, su extracción y cuantificación espectrofotométrica de acuerdo al m étodo
descrito por Casida (1977) y modificado para la presente obra (Ramos y Zúñiga,
2007).
■ Se tom an 10 g de suelo tam izado (peso húmedo), que son mezclados con 0.1
g de carbonato de calcio, C a C 0 3.
■ De esta mezcla se pesan 2 g en frascos estériles color ám bar con cierre her
mético.
73
D O R IS EL IZ A B E TH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA
Pesar 25g de suelo tamizado
Adicionar 0.5mL de
sol. glucosa 25%
i
Incubar a 28°C por 24 horas
i
Trasvasar el contenido del vial a un matraz
Adicionar 3.5mL
de BaCI2 +
fenoftaleína
Titular el NaOH no combinado (hasta el viraje

de rosa grosella a blanco)
i
Calcular la tasa de C 0 2 producido: mg C 0 2/g*h
FIGURA 26.1. Respiración de los microorganismos del suelo
■ Para la instalación del ensayo, se añade 1 m L de solución de extracto de

levadura al 0.1% esterilizada por autoclavado y 1 mL de solución de cloruro
de trifenil tetrazolium (TTC) al 3% esterilizada por filtración a cada uno de
los sistemas; excepto para el suelo blanco, al cual se añade 1 m L de agua
destilada estéril en lugar de adicionarle la solución de TTC. Homogeneizar.
■ Cerrar los frascos y sellar con cinta parafilm.
■ Los sistemas son incubados a 37 ± 1 °C por 24 h.
■ Cumplido el periodo de incubación, se extrae el trifenil form azán formado
74
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS. INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD
como producto de la reducción microbiana. Se añaden 12 mL de etanol ab

soluto a cada frasco instalado. Se agita vigorosamente de m anera constante
por espacio de 5 minutos.
■ El sobrenadante es separado del suelo por filtración al vacío.
■ Se efectúa la lectura al espectrofotómetro de la solución obtenida contra el
sobrenadante del blanco, a una longitud de onda de 485 nm (Figura 26.1).
* El contenido de la sal reducida es cuantificado con la ayuda de una curva de
calibración de formazán, en pg de form azán/ g suelo seco/ 24h.
20 g suelo tamizado + 0.2 g CaC03

i
Pesar 2 g
Muestra
1 1
+ 1 mL extracto de levadura 0.1 %
1 1
+ 1 mL agua + 1 mL TTC 3 %
Incubar a 37 ± 1°C / 24 horas

i
Añadir 12 mL de etanol absoluto y
agitar vigorosamente por 5min
Filtrar al vacio
i
Leer al espectrofotómetro a 485 nm
i
Cuantificar la cantidad de formazán haciendo uso
de una curva de calibración
i
pg de formazán/ g suelo seco/ 24h
FIGURA 26.2. Determinación de la actividad microbiana de los microorganismos del suelo
75
VI. INDICADORES DE INOCUIDAD DE
AGUA Y SUELO
27. Enumeración de coliformes totales

28. Enumeración de coliformes fecales
29. Enumeración de E sch erich ia co li
30. Determinación de S a lm o n ella sp.

INTRODUCCIÓN
as pruebas de inocuidad en suelo y agua son ensayos que se realizan para
L la determ inación del estado sanitario de muestras de suelo, compost, bio-

les, agua y otros, para m inim izar los riesgos para la salud hum ana durante
su manejo para la producción de cultivos.
Tradicionalmente se considera que los microorganismos coliformes y Salmonella,

son indicadores de contam inación en el control de calidad de agua y suelo. Su
presencia es relevante desde el punto de vista de aporte de contam inación a los
alimentos que crecen bajo y al ras del suelo y que son consumidos crudos y que
pueden originar enfermedades e infecciones gastrointestinales.
En nuestro país, dentro del sistema agrícola de riego, es com ún la utilización de

efluentes tratados y aguas residuales. Estos suelen aportar u na alta carga micro
biana. Así mismo, el uso inadecuado de abonos y compost puede contam inar el
suelo. El riesgo sanitaro se encuentra latente y existe la necesidad de norm ar los
límites permisibles para cada caso. Por decreto supremo N° 002-2008-MINAM
se estableció como parám etros biológicos de agua para riego de vegetales de tallo
bajo, la tolerancia no m ayor de 5 x 103 N M P /1 0 0 m L de coliform es totales y
1 x 103N M P /100 mL de fecales, así como la ausencia de Salmonella. En tanto que
el riego de vegetales de tallo alto admite hasta 2 x 103 N M P /100 mL coliformes
fecales y las mismas especificaciones para los otros parámetros.
79
27. ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES

27.1. Enumeración de coliformes totales (ICMSF, 2000)
La metodología para la determinación de los coliformes totales en muestras sólidas
se realiza por la técnica del número más probable (NMP) - método norteamericano.
■ Preparar la muestra como lo descrito en el Tema 20, Preparación de muestras.
■ Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones en tubos de caldo lauril sulfato
triptosa, utilizando tres tubos para cada dilución.
* Incubar los tubos a 35 - 37 °C durante 24 y 48 horas.
■ Pasadas las 24 primeras horas, anotar los tubos que muestren producción de gas.
■ Volver a la estufa los tubos negativos para su incubación durante 24 horas más.
■ Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestren producción de gas
■ Confirmar que los tubos de caldo lauril sulfato seleccionados en el paso ante
rior son positivos de organismos Coliformes, transfiriendo una asada de cada
tubo a otro de caldo lactosa bilis (2%) verde brillante.
■ Incubar durante 24-48 horas a 36 + 1°C y observar la producción de gas. La
formación de gas confirma la presencia de coliformes (Figura 27.1).
■ Para determ inar el núm ero de microorganismos, consultar la Tabla del N M P
(Anexo N° 3, Tabla A .3.1) y reportar como N M P /g.
Expresión de Resultados
Elegir la dilución más alta en la que sean positivos de formación de gas los tres
tubos de una dilución y tom ar en cuenta las diluciones superiores más próximas.
Por ejemplo:
N° de tubos positivos
Ejemplo
-1 -2 -3 -4
1 3/3 3/3 1/3 0/3
2 0/3 0/3 0/3 0/3
3 2/3 2 /3 1/3 1/3
4 3/3 3/3 3/3 3/3
Para la lectura en la tabla del Núm ero M ás Probable, se tom arían las siguientes
combinaciones de tubos positivos:
Combinación
Ejemplo de positivos Clave N M P N M P /g ó mL
1 3:1:0 40 400
2 0:0:0 <3 <3
3 2:1:1 20 200
4 3:3:3 1 100 11 000
Calcular el N M P de organismos coliformes por gramo o mililitro de muestra,

para ello se multiplica el valor de la tabla por el factor de dilución que le antecede.
En el ejemplo 1 : 40 x 10 = 400 N M P / g ó mL.
81
Suelo
10 mL caldo lauril simple

i
Incubar a 36 + 1 °C por 24 - 48 h
'i
Seleccionar los tubos positivos (presencia de gas) y transferir
una asada a caldo lactosa bilis (2%) verde brillante
II
| 10 mL caldo lactosa bilis (2 %) verde brillante
Incubar a 36 + 1 °C por 24 - 48 h
‘ I
FIGURA 27.1. Enumeración de coliformes totales (ICMSF, 2000)
82
27.2. Enumeración de Coliformes Totales (Standard Methods, 1998)

La metodología de Standard M ethods (1998), es aplicado a muestras líquidas.
■ Preparar la muestra como lo descrito en el Tema 20, Preparación de muestras.
■ Pipetear 1 m L de cada una de las diluciones en tubos de caldo lauril sulfato
triptosa, utilizando cinco tubos para cada dilución.
■ Para agua potable utilizar 10 tubos con caldo lauril sulfato triptosa a doble
concentración y agregarle 10 mL de la muestra.
■ Si se trata de agua no potable, usar 5 tubos por dilución, empezando con 5
tubos de caldo lauril sulfato triptosa de doble concentración (10, 1, 0.1, 0.01
mL, etc.).
* Incubar los tubos a 35 ± 0.5 °C durante 24 y 48 horas.
" Pasadas las 24 primeras horas, anotar los tubos que muestren producción
de gas. Volver a la estufa los tubos negativos para su incubación durante 24
horas más.
■ Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestren producción de gas.
■ Confirmar que los tubos de caldo lauril sulfato seleccionados en su lugar son
positivos de organismos coliformes, transfiriendo una asada de cada tubo a
otro de caldo lactosa bilis (2%) verde brillante (Figura 27.2).
■ Incubar durante 24 - 48 horas a 35 ± 0.5 °C y observar la producción de gas.
La formación de gas confirma la presencia de Coliformes.
■ Para establecer definitivamente la existencia de bacterias coliformes, realizar
la prueba completa en el 10% de tubos positivos, sembrándolos en agar Me
Conkey ó Endo Les.
■ Para determinar el núm ero de microorganismos, consultar la tabla de N M P
(Anexo N° 3 Tabla A .3.2)
■ La tabla 9221IV indica los valores de N M P para combinaciones de 5 tubos
(10, 1, 0.1 mL). En caso de que las series decimales sean distintas hacer el
siguiente cálculo:
NMP/100mL = valor de NMP (tabla) x ( --------------- —---------------

^ mayor volumen estudiado
■ Cuando se utilicen más de tres diluciones en series de diluciones decimales,

sólo se tom arán los resultados de tres de ellas para calcular el NMP. Para
seleccionar las tres diluciones a utilizar en la determinación del índice del
NMP, elíjase la dilución más alta con resultado positivo entre las cincos estu
diadas (no hay ninguna dilución m enor que haya dado un resultado negativo)
y las dos siguientes diluciones más altas. Para calcular el índice del NMP,
utilícense los resultados de estos tres volúmenes.
83
E je m p lo 1 mL 0 .1 m L 0 .0 1 m L 0 .0 0 1 m L C o m b in a c ió n d e ín d ic e
p o s itiv o s N M P /lO O m L
a 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 5.000

b 5/5 4/5 2/5 0/5 5-4-2 2.200
c 0/5 1/5 0/5 0/5 0 -1 -0 20
■ E n los ejemplos siguientes, el num erador representa los tubos positivos, y el

denominador, el total de tubos estudiados; la combinación de positivos indica
únicam ente el núm ero total de tubos positivos por dilución.
■ E n el ejemplo c, selecciónese las primeras tres diluciones, de m anera que se

incluya el resultado positivo en la dilución media.
■ Cuando se presenta un caso como ejemplificado en la línea d, en que una di

lución muestra un positivo mayor que las tres elegidas según la regla general,
el resultado se incorporará a la mayor de las diluciones elegidas; se genera
entonces una com binación como la del Ejemplo e:
E je m p lo 1mL 0 .1 m L 0 .0 1 m L 0 .0 0 1 m L C o m b in a c ió n d e ín d ic e
p o s itiv o s N M P /1 0 0 m L
d 5 /5 3/5 1/5 1/5 5-3-2 1.400

e 5 /5 3/5 2 /5 0/5 5-3-2 1.400
84
m 10 mL
i” ,
Muestra i
original
Ctst 90 mL 10'
AP 0.1%
10 mL /tb 1 mL /tb 1 mL /tb
10
lili
10 mL caldo lauril doble
MI
10 mL caldo lauril simple
Incubar a 35 + 0.5 °C por 24 - 48 h

" i
Seleccionar los tubos positivos (presencia de gas)
iüii 10 mL caldo lactosa bilis (2%) verde brillante

ü
1
Incubar a 35 + 0.5 °C por 24 - 48 h

FIGURA 27.2. Enumeración de coliformes totales (Standard Methods, 1998)
85
28. ENUMERACIÓN DE COLIFORMES FECALES

28.1. Enumeración de coliformes fecales (ICMSF, 2000)
La metodología para la determinación de los coliformes fecales se realiza por la
técnica del N M P y las siembras se hacen a partir de los tubos de caldo lauril sul
fato triptosa gas positivo. Este m étodo se aplica a muestras sólidas.
■ Tomar los tubos de caldo lauril sulfato triptosa gas positivo, presuntivas de
crecimiento coliforme.
■ Transferir una asada de cada tubo a otro de caldo E. coli.
■ Incubar los tubos de caldo E. coli a 44.5 + 0.2°C y ver si son positivos (forma
ción de gas) a las 24 y 48 horas.
■ Se presume que los tubos de caldo E. coli que presenten gas son tam bién posi
tivos de organismos Coliformes de origen fecal (Figura 28.1).
■ Para determ inar el núm ero de microorganismos, entrar a la tabla del N M P
(Anexo N° 3, Tabla A .3.1).
Similar a la expresión de coliformes totales (ICMSF, 2000).
86
1 mL
Tubos con 9 mL
AP 0.1%
10" 10'2 10-
1 mL /tb | 1 mL/tb 1 mL /tb
i»9 lll 10 mL Caldo Lauril Simple

1
Incubar a 36 + 1°C por 24 - 48 horas
" i
Seleccionar los tubos positivos (presencia de gas) y transferir
una asada a caldo EC
919 99!
10 mL Caldo EC
i
Incubar a 44.5 + 0.2 °C por 24 - 48 horas
i
Leer los tubos positivos y consultar la Tabla de NMP
FIGURA 28.1. Enumeración de coliformes fecales (ICMSF, 2000)
87
DORIS ELIZABETH ZÚÑIGA DÁVTLA
28.2. Enumeración de coliformes fecales (Standard Methods, 1998)

Este método se emplea para muestras de agua.
■ Tomar los tubos de caldo lauril sulfato triptosa gas positivo, procedentes de
las presuntivas de coliformes.
* Transferir una asada de cada tubo de laurñ a otro de caldo EC
■ Incubar los tubos de caldo EC a 44.5 + 0.2°C y observar si dan positivo (for
mación de gas) a las 24 y 48 horas (Figura 28.2).
* Se presume que los tubos de caldo EC que presenten gas son positivos de
organismos coliformes de origen fecal.
■ Para determinar el núm ero de microorganismos coliformes fecales, consultar
la tabla de N M P (Anexo N° 3, tabla A.3.2).
Similar a lo aplicado en coliformes totales (Standard Methods, 1998).
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS. INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD
10 mL
Muestra
original
i
90 mL ) l
AP 0.1 % 10'1
10 m L/tb 1 mL /tb
7
1 mL /tb
10 mL caldo lauril doble 10 mL caldo lauril simple
Incubar a 35 + 0.5 °C por 24 - 48 h

‘ I
Seleccionar los tubos positivos (presencia de gas)
Transferir una asada de los tubos positivos a Caldo EC
10 mL Caldo EC
1
Incubar a 44,5 + 0.2 °C por 24 - 48 h
I
FIGURA 28.2. Enumeración de coliformes fecales (Standard Methods, 1998)
89
29. ENUM ERACIÓN DE Escherichia coli

La metodología para la num eración de E. coli (ICMSF, 2000), se realiza a partir
de los tubos de caldo EC positivos, aislando en Agar EMB y realizando luego las
pruebas bioquímicas IMVIC (indol, rojo de metilo, Voges - Proskauer y citrato de
Simmons) a las colonias sospechosas.
29.1. Técnica para el aislamiento y purificación de cultivos
■ Sembrar por estrías una asada de cada tubo de caldo EC positivo con gas, en
placas de agar EMB o EN D O e Incubar por 2 4 h a 3 5 - 3 7 °C (Figura 28.1).
■ Tomar una colonia representativa (nucleada con o sin brillo metálico) de cada
placa y sembrarla por estrías en una placa de agar nutritivo. Incubar la placa
invertida durante 24 horas a 35 - 37 °C.
■ Seleccionar colonias individuales y sembrar una asada en agar nutritivo incli
nado y en caldo lactosado. Incubar los cultivos durante 24 horas a 35 - 37 °C.
■ A partir de los tubos con gas positivo en Caldo Lactosado, hacer una exten
sión y teñir por el m étodo de Gram para confirmar la presencia de bacilos
G ram negativos no esporulados.
■ Para inocular los medios IMVIC que se m encionan a continuación, utilizar
un asa de Kolle y hacer siembras a partir de cultivos de 24 horas en agar nu
tritivo inclinado.
29.2. Técnica para la prueba de indol
■ Inocular tubos de caldo triptona a partir de cultivos puros e incubar los tubos
sembrados a 35 - 37 °C durante 24 horas (Figura 29.1)
■ A ñadir a cada tubo 0.2 - 0.3 mL del reactivo de Kovacs y agitar.
■ Esperar 10 minutos y observar los resultados. Si aparece un color rojo oscuro
en la superficie de la capa de alcohol amílico, la prueba es positiva. U n co
lor naranja indica la presencia posible de escatol y puede ser anotado como
reacción negativa.
29.3. Técnica para la prueba del rojo de metilo
■ Incubar tubos de caldo glucosa (M R - VP) a partir de cultivos puros e incubar
los tubos sembrados a 35 - 37 °C durante 5 días (Figura 29.1).
* Pipetear 5 mL de cada cultivo en tubos vacíos y añadir a cada tubo 5 gotas de
la solución de rojo de metilo (0.03 %). Agitar.
■ A notar como positivo si aparece un color rojo bien definido y como negativo
si el color es amarillo. Colores intermedios indican reacción dudosa.
29.4. Técnica para la prueba de Voges-Proskauer
■ Inocular tubos de caldo glucosa a partir de cultivos puros e incubarlos a 35 -
37 °C durante 48 h (Figura 29.1).
■ Pipetear 1 mL de cada cultivo en tubos vacíos y añadir a cada uno de ellos 0.6
mL de la solución de a-naftol y 0.2 mL de la solución de hidróxido potásico
al 40%.
■ Agitar los tubos y dejarlos en reposo durante 2 - 4 h. Observar los resultados.
La aparición en la mezcla de un color carmesí se anota como prueba positiva.
90
29.5. Técnica para la prueba del citrato sódico

■ Inocular tubos de agar citrato de Simmons inclinado a partir de cultivos pu
ros, sembrar por picadura en la columna de agar y por estría en la superficie
inclinada (Figura 29.1).
■ Incubar el agar citrato de Simmons a 35 - 37 °C durante 48 h.
■ A notar reacción positiva si el crecimiento es visible y como negativa cuando
no lo es. El crecimiento se manifiesta, generalmente, por el cambio de color
verde claro del medio al color azul.
Expresión de resultados
Similar a la expresión de coliformes fecales.
Caldo EC positivo
A is la r co lo n ia s y p u rifica r
Colonia sospechosa de E. coli
Agar citrato
Caldo Triptona Caldo MR - VP de Simmons
_______ I
1 1
In c u b a r 2 4h a In c u b a r 5 d ía s a In cu b a r 48 h a In c u b a r 4 8 h a
3 5 -3 7 °C 3 5 -3 7 °C 3 5 -3 7 °C 3 5 -3 7 °C
A 1 m L d e cultivo ,
A d ic io n a r A d ic io n a r sol. a d ic io n a r 0 .6 mL
re a c tiv o de rojo de m etilo a -n a fto l + 0.2 mL
K o va cs 0 .0 3% KO H 40 %
N e g a tivo : no hay
ca m b io de co lo r
P o s itiv o : fo rm a c ió n P o sitivo : c o lo ra ció n N e g a tivo : no hay

de un a n illo rojo roja ca m b io de co lo r
Reacciones típicas de E. c o li
i
Los tu b o s de EC q u e co n firm a n la p re se n cia de E. c o li son p o s itiv o s y se
le e n en la ta b la d e N M P p a ra re p o rta r el re su lta d o fin a l
FIGURA 29.1. Enumeración de Escherichia coli
91
30. DETERMINACIÓN DE Salmonella sp.

Todas las Salmonelas son consideradas como patógenas para el hombre. La única
vía de entrada de estos microorganismos en el cuerpo hum ano es la oral, por lo
que es de suma importancia su determinación. Para su estudio la ICM SF (2000)
considera 5 etapas:
30.1. Enriquecimiento no selectivo de Salmonelas
■ M ezclar la muestra con 9 volúmenes del medio de enriquecimiento escogido
- agua de peptona tam ponada, en proporción peso/volum en.
■ Incubar el medio de enriquecimiento previo durante 18 - 24 h a 35 - 37 °C.
(Figura 30.1).
30.2 Enriquecimiento selectivo de Salmonelas
■ Pipetear 1 mL del cultivo de pre - enriquecimiento en 10 mL de caldo Seleni-
to Cistina. Incubar a 43 °C, durante 24 horas.
* Transferir 1 mL de cultivo de pre - enriquecimiento a 10 mL de Caldo Tetra-
tionato Verde Brillante. Incubar a 43 °C durante 24 horas.
30.3 Siembra en medios de agar selectivo para Salmonelas
* Tomar una asada de cada uno de los medios de enriquecimiento selectivo
y estriarlo en la superficie de una placa de cada uno de los tres medios de
agar selectivo señalados a continuación, de m anera que se obtengan colonias
aisladas.
■ Incubar las placas de agar verde brillante durante 24 horas a 35 - 37 °C. Las
colonias típicas de Salmonella son incoloras, rosa o fucsia o translúcidas a
opacas, con el medio que las rodea de color rosa a rojo.
■ Incubar las placas de agar bismuto sulfito a 35 - 37°C durante 48 horas. Las
colonias típicas de Salmonella en agar bismuto sulfito aparecen marrones o
grises a negro, a veces con un brillo metálico. El medio que rodea las colonias
es, generalmente, m arrón al principio, cambiando a negro según transcurre
el tiempo de incubación. Algunas cepas producen colonias verdes, con el
medio que las rodea muy poco o nada oscurecido.
■ Incubar las placas de agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) a 35 - 37 °C du
rante 48 h. Las colonias típicas de Salmonella son del mismo color que el
medio de cultivo, transparentes, a veces con centros negros (Figura 29.1).
30.4 Bioquímica de Salmonella sp.
■ Tomar con una aguja de Kolle estéril dos o más colonias de cada tipo sospe
choso del agar verde brillante, del agar sulfito bismuto y del medio XLD y
pasar a tubos de agar triple azúcar hierro y agar lisina hierro inclinados.
■ Inocular los medios mediante siembra en estrías en la superficie inclinada
y, a continuación, por picadura en la colum na de agar. Inocular primero un
medio y sin flamear la aguja, inocular el segundo medio de la misma manera.
■ Incubar los tubos de ambos medios durante 24 horas a 35 - 37°C. (Figura
30.1).
■ Los cultivos sospechosos de ser Salmonella muestran en la superficie del agar
triple azúcar hierro, reacción alcalina (color rojo) y en las columnas de medio.
92
reacción ácida (color amarillo), con o sin producción de SH2, que da lugar al
ennegrecimiento del agar. La reacción sospechosa en agar triple azúcar hierro
indica que el organismo fermenta la glucosa (columna amarilla) pero que no
fermenta la lactosa ni la sacarosa (parte inclinada roja), reacciones típicas de
las Salmonella. Sin embargo, algunas cepas pueden fermentar la sacarosa o la
lactosa y producir acidez (color amarillo) tanto en la parte inclinada como en
la colum na de medio. Los cultivos sospechosos de Salmonella presentan en el
agar lisina hierro una reacción alcalina (color púrpura) en todo el medio, con
o sin producción de SH2 (ennegrecimiento).
30.5 Serología somática
■ Depositar una pequeña cantidad de cultivo del medio TSI en una lám ina co
locar una gota de solución salina fisiológica y emulsionar el cultivo.
■ A ñadir una gota del antisuero y emulsionar con la ayuda del asa de Kolle.
■ Balancear la lám ina y observar la aglutinación en un minuto.
Expresión de resultados
El resultado se expresa como presencia o ausencia del microorganismo en 25 g de
suelo ó mL de agua.
93
225 mL APT
Incubar a 35 - 37 °C por 24 horas
Adicionar 1 mL/tubo
10 mL Caldo 10 mL caldo
Tetrationato Selenita Cistina
Incubar a 43°C por 24 horas
IL 0 AgarXLD 0 P
Estriar en cada uno de
IL------ ¡1 AgarBPLS 0 P los agares diferenciales
indicados
IL------ ¡1 Agar BAS 0 "1
1
Incubar a 35 - 37 °C por 24 horas
I
Tomar una asada de una colonia característica de cada placa y
sembrar en TSI, LIA inclinado. Incubar a 35 - 37 °C x 24 h
Agar TSI Agar LIA
Seleccionar los tubos positivos: TSI K/A++, LIA K/K
1
Serología: somática y flagelar
i
Expresión de Resultados: Presencia - Ausencia / 25g
FIGURA 30.1. Determinación de Salmonella sp.
94
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98
ANEXOS
ANEXO N° 1 Medios de cultivo y reactivos

ANEXO N° 2 Ensayos de sensibilidad a diferentes antibióticos
ANEXO N° 3 Tablas de número más probable
ANEXO N° 4 Material de biología molecular
DORIS ELIZABF.TH ZÚÑIGA DÁVILA
ANEXO N ° l . MEDIOS Y REACTIVOS
1. MEDIO LEVADURA-MANITOL-AGAR (LMA)
M anitol 10.00 g
Extracto de levadura 0.50 g
k 2h p o 4 0.50 g
M g S 0 4. 7H20 0.10g
NaCl 0.20 g
Agar 15.00 g
Agua destilada 1000 mL
Colorantes*
pH 6.8
*Colorantes:
Rojo congo al 0.0025 % 10 m L /L de LM A
Azul de Bromotimol 0.5% en alcohol al 70% 5 m L /L de LM A
MEDIO LACTOSA LEVADURA AG AR (LLA)
Lactosa 10.00 g
k 2h p o 4 0.50 g
M g S 0 4.7H20 0.10g
NaCl 0.20 g
Agar 15.00 g
pH 6.8
REACTIVO DE BENEDICT
Solución A Solución B
Citrato de Sodio 17.3 g. Sulfato de Cobre 1.73 g
Carbonato de Sodio 10.0 g. Agua destilada 10.0 mL
Agua destilada 10.0 m L .
M ezclar la solución A con la solución B al momento de usar y envasar

hasta 100 mL con agua destilada.
MEDIO PEPTONA-GLUCOSA (PG)
Glucosa 5.00 g
Peptona 10.00 g
Agar 15.00 g
Púrpura de bromocresol 10.00 mL
pH 6.8
100
5. MEDIO LB
Triptona 10.00 g
NaCl 5.00 g
Agar 15.00 g
pH 6.8 - 7.0
6. SOLUCIÓN NUTRITIVA DE BROUGHTON Y DILLWORTH (SNBD)

Solución 1 Solución 2
CaCl2.2H20 294,1 g /L k h 2p o 4 136,1 g /L
Solución 3 Solución 4
FeCl3 13.26 g /L H 3B 0 3
0.247 g /L
M g S 0 4 .7 H ,0 123.3 g /L Z n S 0 4. 7H20 0.288 g /L
k 2s o 4 87 g /L C u S 0 4. 5H20 0.100 g /L
M n S O4,.H2,0 0.338 g /L CoSO4. 7HzO 0.056 g /L
N a2M o 0 2. 2H20 0.048 g /L
Tomar 5mL cada solución stock y añadir 10L de agua destilada, ajustar
el pH a 6.6 - 6.8 para prepar solución nutritiva N +, añadir KN03(0.05%).
7. MEDIO BASE BERGENSEN

k 2h p o 4 0.3 g
k h ,p o 4 0.3 g
M g S 0 4.7H20 0.15 g
NaCl 0.05 g
CaCl2 0.05 g
d jF e 6 mg
Glutam ato monosodico 11 g
Tiam ina 0.1 mg
Biotina 0.2 mg
Pentotenato cálcico 0.1 mg
M anitol 10g
Azul de bromotimol (sol. al 5% en etanol 70 %) 5 mL
pH 7
8. NATIONAL BOTANICAL RESEARCH INSTITUYE’S PHOSPHATE

GROWTH M EDIUM (NBRIP):
Empleado para la identificar bacterias solubilizadoras de fosfato
Glucosa 10.0 g
Ca3(P 0 4)2 5.0 g
(NH4)2S 0 4 o.i g
M g S 0 4*7H20 0.25 g
KC1 0.2 g
MgCl2*6H ,0 5.0 g
Agar 15.0 g
pH 7.0
Se ajusta el pH a 7.0 y se esteriliza a 121° C durante 15 min
101
D O RIS ELIZA B ETH ZÚ Ñ IG A D Á V ILA
9. SOLUCIÓN DE SALKOWSKY
2% de FeCl3 0.05M en 35% de Acido Perclórico.
10. MEDIO GLUCOSA TRIPTONA EXTRACTO DE CARNE (TGE)

Utilizado para el aislamiento de bacterias del género Bacillus.
Triptona 5.0 g
Extracto de carne 3.0 g
D-Glucosa LOg
Agar 15 g
pH 7 . 0 + /- 0 . 1
11. MEDIO MINERAL SIN NITRÓGENO

Este medio se utiliza tanto líquido como en agar para el aislamiento de Azoto-
bacter.
K ,H P 0 4 0.655 g
M g S 0 4.7H20 0.2 g
NaCl 0.02 g
CaCl, 0.01 g
Cl3Fe(0.1% en solución) 3.4 g
N a M o 0 4(H20 ) 0.0108 g
K H ,P 0 4 0.15 g
M anitol 10 g
Agar 15.0 g
Sacarosa 10 g
Azul de Bromotimol (sol. al 0.5% en etanol 70 %) 5 mL
pH 7
12. AGAR PAPA DEXTROSA

Para cultivo de hongos.
Infusión de papa (preparada a partir 4.0
de 200 g de papa)
D-Glucosa 20.0 g
Agar 15.0 g
pH 5.6+/-0.1
13. MEDIO ALM IDÓN CASEÍNA

Alm idón 10.0 g
Caseína 0.3 g
Nitrato de potasio 2.0 g
NaCl 2.0 g
K2H P 0 4 2.0 g
M g S 0 4.7H20 0.05 g
C aC 03 0.02 g
F eS 0 4.7H20 0.01 g
Agar 15.0 g
Agua destilada 1000mL
102
14. MEDIO PLATE COUNT PARA BACTERIAS

Triptona 5.0 g
Extracto de carne 2.5 g
Dextrosa 1.0 g
Agar 15.0 g
15. MEDIO CZAPEK PARA HONGOS

Sacarosa 30.0 g
N itrato sódico N a N 0 3 3.0 g
M g S 0 4.7H20 LO g
KC1 0.5 g
2 F eS 0 4.7H20 0.018 g
k 2h p o 4 1.0 g
Agar 13.0 g
Rosa de Bengala 0.05 g
pH 7.3
16. A G A R T SN
Para recuento de bacterias anaerobias
Peptona de caseína 15.0 g
Extracto de Levadura 10.0 g
Sulfito sódico 1.0 g
Citrato de Hierro III 0.5 g
Polimixina B sulfato 0.02 g
Neomicina Sulfato 0.05 g
Agar 13.5 g
pH 7.2 ± 0.2
Esterilizar en autoclave (121°C x 10 min) verter en placas
17. CALDO LACTOSADO.

Este medio de cultivo está exento de sustancias inhibidoras para el ensayo
previo de bacterias Coliformes, especialmente E. coli. Utilizado para el enri
quecimiento de Salmonella. Composición (g/L):
Peptona de g elatin a.................................... 5.0

Extracto de c a rn e ........................................ 3.0
L a c to sa ..........................................................5.0
Disolver y distribuir en tubos de ensayo provistos de campanas D urham y
esterilizar en autoclave (15 minutos a 121°C). El caldo preparado es claro e
incoloro. pH: 6.9 + 0.1
18. CALDO SELENITO CISTINA.

Este medio es utilizado para el enriquecimiento de Salmonella a partir de
heces, alimentos y otros materiales.
103
Composición (g/L):
Peptona de C aseín a.........................................................5.0
L(-) - cistin a....................................................................... 0.01
L a c to sa .............................................................................. 4.0
Fosfato só d ico .................................................................. 2.0
Hidrógenoselenito só d ic o ............................................. 4.0
Disolver a temperatura ambiente. En caso necesario calentar brevemente

como máximo a 60°C, esterñizar por filtración, si se prevee un almacenamien
to prolongado y distribuir en tubos. N o esterilizar en autoclave. pH: 7.0 + 0.2
19. CALDO TETRATIONATO.

Este caldo es utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonelas.
Composición (g/L):
Peptona de C aseín a..........................................................2.5

Peptona de C a rn e ............................................................. 2.5
M ezcla de sales b ilia res.................................................... 1.0
Carbonato de c a lc io ........................................................10.0
Tiosulfato de so d io ..........................................................30.0
Disolver los ingredientes y en caso necesario, calentar brevemente y enfriar
rápidamente. Queda un sedimento de Carbonato de Calcio. N o necesita este
rilizar. pH: 7.0 + 0.1
20. AG AR XLD (AGAR XILOSA - LISINA - DESOXICOLATO).

Este agar es utilizado para el aislamiento y diferenciación de Enterobacte-
riaceas patógenas, especialmente de especies de Shigella y Salmonella. Com
posición (g/L):
Extracto de levadura 3.0

NaCl 5.0
D (+) - xilosa 3.5
Lactosa 7.5
Sacarosa 7.5
L(+) - lisina 5.0
Desoxicolato sódico 2.5
Tiosulfato de sodio 6.8
Citrato de am onio y hierro (III) 0.8
Rojo de fenol 0.08
Agar 13.5
Disolver rápidamente y totalmente y verter en placas. Las placas con medio
de cultivo son de color rojo y casi siempre claras. N o esterilizar en autoclave.
pH: 7.4 + 0.2
21. AG ARBPLS
Selectivo para el aislamiento de Salmonella a partir de materiales patológi
cos, alimentos, etc. Composición en (g/L):
Peptona de carne 5.0
Peptona de caseína 5.0
Extracto de carne 5.0
104
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RH1ZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD
Cloruro de sodio 3.0

Hidrogenofosfato disódico 2.0
Lactosa 10.0
Sacarosa 10.0
Rojo de fenol 0.8
Verde brilante 0.0125
Agar 12
pH: 6.9 ±0. 1
Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave (15 m in a 121°C). Verter
en placas.
22. AG AR BSA (BISMUTO SULFITO AGAR)

Selectivo para el aislamiento de Salmonella. Composición (g/L)

Peptona 10.0
Glucosa 5.0
Fosfato disódico 4.0
Sulfato ferroso 0.3
Indicador sulfito bismuto 8.0
Verde brillante (sol. Acuosa 0.5 % p /v ) 5 mL
Agar 20.0
Disolver todos los componentes en un litro de agua destilada, calentar hasta

ebullición con agitación frecuente. N o autoclavar. Verter en placas.
23. AGAR TSI (AGAR HIERRO TRES AZÚCARES)

Para la identificación de Enterobacteriacea, según Sulkin y Willet (1940),
modificado por Hajna, 1945). Composición (g/L):
Peptona de caseína 15
Peptona de carne 5.0
Extracto de levadura 3.0
Cloruro sódico 5.0
Lactosa 10
Sacarosa 10
D(+)Glucosa 1.0
Am onio de Hierro (III) citrato 0.5
Tiosulfasto sodio 0.3
Rojo de Fenol 0.024
Agar 12
Disolver los ingredientes, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave (15
min. a 121°C). Dejar solidificar en posición inclinada. E l p H e s de 7.4 ±0.1.
El medio de cultivo es claro y de color rojo anaranjado.
24. AGAR U S IN A HIERRO (LIA)

Agar para la demostración simultánea de lisina descarboxilasa (LD) y de
la formación de ácido sulfhídrico (H2S) para la identificación de Enterobac
teriacea, sobre todo de Salmonella y Árizona, según Edwards y Fife (1961).
105
DORIS ELIZABETII ZÚÑIGA DÁVILA
Composición (g/L)
Peptona de carne 5
Extracto de levadura 3
D(+)Glucosa 1.0
L-Lisina m onoclorhidrata 10.0
Tiosulfato sódico 0.04
Citrato de amonio y hierro (III) 0.5
Púrpura de Bromocresol 0.02
Agar 12.5
Disolver, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave (15 min. 121° C). D e

jar en posición inclinada de form a que, al solidificar, se produzca una co
lum na de unos 3 cm de altura, y sobre ella una superficie inclinada de, por
lo menos, la misma longitud. El pH es de 6.7 + 0.1. El medio de cultivo es
claro y de color gris violeta.
ANEXO N° 2
Tabla A .2.1 Ensayos de Sensibilidad a diferentes antibióticos
Agente microbiano Sigla Potencia Resistente Susceptible

Ampicilina A 10 mcg <13mm >17mm
Cefixima CFM 5 mcg <15mm >19mm
Cloranfenicol C 30 mcg <12mm >18mm
Doxiciclina DXS 30 mcg <12mm >16mm
Eritromicina EM 15 mcg <13mm >23mm
Estreptomocina S 10 mcg < llm m >15mm
Kanamicina K 30 mcg <13mm >18mm
Lincomicina L 2 mcg <16mm >21mm
Norfloxacino ÑOR 10 mcg <12mm >17mm
Penicilina P 10UOF <19mm >20mm
Rifampicina R 5 mcg <16mm >20mm
Sulfatrimetoprim SX 25 mcg <10mm >16mm
Tetraciclina T 30 mcg <14mm >19mm
106
ANEXO N° 3. TABLAS DE NÚMERO MÁS PROBABLE
Tabla A .3.1
Indice NMP para varias combinaciones de resultados positivos cuando son
usados tres tubos por dilución (1 0 1, 1 0 2, 1 0 3) (ICMSF, 2000)
Combinaciones de tubos positivos N M P /g
0 .1 0 .0 1 0 .0 0 1
0 0 0 <3
0 0 1 3
0 1 0 3
0 2 0 6
1 0 0 4
1 0 1 7
1 1 0 7
1 1 1 11
1 2 0 11
2 0 0 9
2 0 1 14
2 1 0 15
2 1 1 20
2 2 0 21
2 2 1 28
2 3 0 29
3 0 0 23
3 0 1 39
3 0 2 64
3 1 0 43
3 1 1 75
3 1 2 120
3 2 0 93
3 2 1 150
3 2 2 210
3 3 0 240
3 3 1 460
3 3 2 1100
107
Tabla A .3.2
TABLA 922: IV. Indice NMP y límites de confianza para varias

combinaciones de resultados positivos cuando son usados cinco tubos por
dilución (10 mL, 1.0 mL, 0.1 mL) (Standard Methods, 2005)
C o m b in a c ió n ín d ic e L ím ite s d e C o m b in a c ió n ín d ic e L ím ite s d e
d e P o s itiv o s N M P / 1 0 0 C o n fia n z a d e P o s itiv o s N M P / 1 0 0 C o n fia n z a
m L In fe rio r S u p e rio r m L In fe rio r S u p e rio r
0 -0 -0 < 1 .8
_ 6 .8 4 -0 -3 2 5 9 .8 7 0
0 -0 -1 1 .8 0 .0 9 0 6 .8 4 -1 -0 1 7 6 .0 4 0
0 -1 -0 1 .8 0 .0 9 0 6 .9 4 -1 -1 2 1 6 .8 4 2
0 -1 -1 3 .6 0 .7 0 10 4 -1 -2 2 6 9 .8 7 0
0 -2 -0 3 .7 0 .7 0 10 4 -1 -3 31 1 0 7 0
0 -2 -1 5 .5 1 .8 15 4 -2 -0 2 2 6 .8 5 0
0 -3 -0 5 .6 1 .8 15 4 -2 -1 2 6 9 .8 7 0
1 -0 -0 2 .0 0 .1 0 1 0 4 -2 -2 3 2 1 0 7 0
1 -0 -1 4 .0 0 .7 0 10 4 -2 -3 3 8 1 4 1 0 0
1 -1 -2 6 .0 1 .8 15 4 -3 -0 2 7 9 .9 7 0
1 -1 -0 4 .0 0 .7 1 12 4 -3 -1 3 3 1 0 7 0
1 -1 -1 6 .1 1 .8 15 4 -3 -2 3 9 1 4 1 0 0
1 -1 -2 8 .1 3 .4 2 2 4 -4 -0 3 4 1 4 1 0 0
1 -2 -0 6 .1 1 .8 15 4 -4 -1 4 0 1 4 1 0 0
1 -2 -1 8 .2 3 .4 2 2 4 -4 -2 4 7 1 5 1 2 0
1 -3 -0 8 .3 3 .4 2 2 4 -5 -0 4 1 1 4 1 0 0
1 -3 -1 1 0 3 .5 2 2 4 -5 -1 4 8 1 5 1 2 0
1 -4 -0 1 0 3 .5 2 2 5 -0 -0 2 3 6 .8 7 0
2 -0 -0 4 .5 0 .7 9 15 5 -0 -1 31 1 0 7 0
2 -0 -1 6 .8 1 .8 15 5 -0 -2 4 3 1 4 1 0 0
2 -0 -2 9 .1 3 .4 2 2 5 -0 -3 5 8 2 2 1 5 0
2 -1 -0 6 .8 1 .8 17 5 -1 -0 3 3 1 0 1 0 0
2 -1 -1 9 .2 3 .4 2 2 5 -1 -1 4 6 1 4 1 2 0
2 -1 -2 1 2 4 .1 2 6 5 -1 -2 6 3 2 2 1 5 0
2 -2 -0 9 .3 3 .4 2 2 5 -1 -3 8 4 3 4 2 2 0
2 -2 -1 1 2 4 .1 2 6 5 -2 -0 4 9 15 1 5 0
2 -2 -2 1 4 5 .9 3 6 5 -2 -1 7 0 2 2 1 7 0
2 -3 -0 1 2 4 .1 2 6 5 -2 -2 9 4 3 4 2 3 0
2 -3 -1 14 5 .9 3 6 5 -2 -3 1 2 0 3 6 2 5 0
2 -4 -0 15 5 .9 3 6 5 -2 -4 1 5 0 5 8 4 0 0
3 -0 -0 7 .8 2 .1 2 2 5 -3 -0 7 9 2 2 2 2 0
3 -0 -1 11 3 .5 2 3 5 -3 -1 1 1 0 3 4 2 5 0
3 -0 -2 13 6 .5 3 5 5 -3 -2 1 4 0 5 2 4 0 0
3 -1 -0 11 3 .5 2 6 5 -3 -3 1 7 0 7 0 4 0 0
3 -1 -1 1 4 5 .6 3 6 5 -3 -4 2 1 0 7 0 4 0 0
3 -1 -2 1 7 6 .0 3 6 5 -4 -0 1 3 0 3 6 4 0 0
3 -2 -0 1 4 5 .7 3 6 5 -4 -1 1 7 0 5 8 4 0 0
3 -2 -1 17 6 .8 4 0 5 -4 -2 2 2 0 7 0 4 4 0
3 -2 -2 2 0 6 .8 4 0 5 -4 -3 2 8 0 1 0 0 7 1 0
3 -3 -0 1 7 6 .8 4 0 5 -4 -4 3 5 0 1 0 0 7 1 0
3 -3 -1 2 1 6 .8 4 0 5 -4 -5 4 3 0 1 5 0 1 1 0 0
3 -3 -2 2 4 9 .8 7 0 5 -5 -0 2 4 0 7 0 7 1 0
3 -4 -0 2 1 6 .8 4 0 5 -5 -1 3 5 0 1 0 0 1 1 0 0
3 -4 -1 2 4 9 .8 7 0 5 -5 -2 5 4 0 1 5 0 1 7 0 0
3 -5 -0 2 5 9 .8 7 0 5 -5 -3 9 2 0 2 2 0 2 6 0 0
4 -0 -0 13 4 .1 3 5 5 -5 -4 1 6 0 0 4 0 0 4 6 0 0
4 -0 -1 1 7 5 .9 3 6 5 -5 -5 > 1 6 0 0 7 0 0 —
4 -0 -2 2 1 6 .8 4 0
108
Tabla A .3.3
TABLA 922: HI. índice NM P y límites de confianza al 95% para todas las
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando son usadas diez
porciones de 10 mL (Standard Methods, 2005)
N° de Tubos Indice Límites de Confianza al 95%

Positivos (10 mL) NMP/lOOmL Inferior Superior
0 < 1 .1 — 3 .4
1 1 .1 0 .0 5 1 5 .9
2 2 .2 0 .3 7 8 .2
3 3 .6 0 .9 1 9 .7
4 5 .1 1 .6 1 3
5 6 .9 2 .5 1 5
6 9 .2 3 .3 1 9
7 1 2 4 .8 2 4
8 1 6 5 .8 3 4
9 2 3 8 .1 5 3
1 0 > 2 3 1 3 —
109
DORIS ELIZABETH ZÚÑIGA PÁV1LA
Tabla A .3.4
Estimación de la cantidad de rhizobiosa
C a n tid a d d e r h iz o b io s (m , v e r fó rm u la ) e s tim a d a s e g ú n e l re c u e n to d e p la n ta s in fe c ta d a s :
d ilu c io n e s d e 1 /1 0 (A = 1 0 )*
Tubos positivos Etapas de dilución(es)
n = 4 n = 2 s = 10
4 0 2 0 > 7 x 1 0 8
3 9
3 8 19 6 .9
3 7 3 .4
3 6 18 1 .8
35 1 .0
3 4 17 5 .9 x 1 0 7
3 3 3 .1 s = 8
3 2 16 1 .7 > 7 x 1 0 “
31 1 .0
3 0 15 5 .8 x 1 0 6 6 .9
2 9 3 .1 3 .4
2 8 14 1 .7 1 .8
2 7 1 .0 1 .0
2 6 13 5 .8 x 1 0 5 5 .9 x 1 0 5
2 5 3 .1 3 .1 s = 6
2 4 12 1 .7 1 .7 > 7 x 1 0 '1
2 3 1 .0 1 .0
2 2 11 5 .8 x lO 3 5 .8 x 1 0 “ 6 .9
21 3 .1 3 .1 3 .4
2 0 10 1 .7 1 .7 1 .8
19 1 .0 1 .0 1 .0
18 9 5 .8 x 1 0 3 5 .8 x 1 0 3 5 .9 x 1 0 3
17 3 .1 3 .1 3 .1 s = 4
16 8 1 .7 1 .7 1 .7 > 7 x 1 0 2
15 1 .0 1 .0 1 .0
14 7 5 .8 x 102 5 .8 x lO 2 5 .8 x 1 0 2 6 .9
13 3 .1 3 .1 3 .4
12 6 1 .7 1 .7 1 .7 1 .8
11 1 .0 1 .0 1 .0 1 .0
10 5 5 .8 x 1 0 1 5 .8 x 10* 5 .8 x 1 0 ' 5 .9 x 1 0 1
9 3 .1 3 .1 3 .1 3 .1
8 4 1 .7 1 .7 1 .7 1 .7
7 1 .0 1 .0 1 .0 1 .0
6 3 5 .8 x 1 5 .8 x 1 5 .8 x 1 5 .8 x 1
5 3 .1 3 .1 3 .1 3 .1
4 2 1 .7 1 .7 1 .7 1 .7
3 1 .0 1 .0 1 .0 1 .0
2 1 0 .6 0 .6 0 .6 0 .6
1 < 0 .6 < 0 .6 < 0 .6 < 0 .6
0 0
A m p litu d a p ro x im a d a 109 1 0 7 1 0 5 1 0 3
F a c to r, 9 5 % d e lo s lím ite s d e c o n fia n z a * *
(X , - ) : n = 2 6 .6
n = 4 3 .8
* C u a d ro c a lc u la d o s e g ú n e l c u a d ro V III2 d e F is h e r y Y a te s (1 9 6 3 )
* * C o c h r a n e , B io m e tric s , 1 9 5 0 , c a p . 6 , p . 10 5 .
a. T o m a d o d e : V in c e n t. L . M . 1 9 7 0
11Ó
M A N U A L D E M IC R O B IO LO G ÍA A G R ÍC O L A R H IZO B IU M , PGPRS, IN D IC A D O R ES D E F E R T IL ID A D E IN O C U ID A D
Donde:
n : cantidad de repeticiones por dilución
s : cantidad de diluciones trabajadas
Consideraciones para la lectura de la Tabla de Estimación de la Cantidad de

Rhizobios
1. Sumar la cantidad total de tubos positivos (presencia de nodulos) en todas las
diluciones trabajadas.
2. El núm ero obtenido en el paso anterior debe ser buscado en la columna de
tubos positivos para el n y s adecuados.
3. Calcular el núm ero de células de Rhizobium / g de suelo.
vxn
m : núm ero más probable (por mL) en la primera dilución considerada,

d : primera dilución considerada
v : volumen inoculado
n : peso del suelo o del inoculante
ANEXO N° 4. MATERIAL DE BIOLOGÍA MOLECULAR
A .4.1 Buffer TBE (Tris-borato-EDTA) 10X:
• El buffer TBE tiene mayor capacidad de am ortiguam iento que el buffer TAE.
• Es recom endado para electroforesis de ácidos nucleicos menores a 1500 bp,
de esta m anera es usado para análisis de moléculas de A D N /A R N pequeñas.
Tris base 108 g

Acido Bórico 55 g
EDTA 0.5 M pH 8.0 40 mL
Agua destilada en csp 1000mL
• Alm acenar a tem peratura ambiente
Buffer TAE (Tris-acetato-EDTA) 10X
• El buffer TAE es recom endado para electroforesis de ácidos nucleicos m a

yores a 1500 bp, de esta m anera es recom endado para resolución de A D N
genómico, moléculas de A D N /A R N mayores a 1500 bp ó A D N superen-
rollado.
Tris base 48.40 g

Acido acético glacial 11.42 mL
EDTA 0.5 M p H 8.0 20 mL
Agua destilada en csp 1000mL
ni
A .4.2 Solución de Bromuro de etidio
Solución stock (10 m g/m L ) 100 pL

A .4.4 Porcentajes de agarosa para fragmentos de distintos tamaños
Concentración de agarosa recomendado para la separación de fragmentos de

A D N de varios tam años
Concentración Tamaño del fragmento

de Agarosa (%) de ADN (kb)
0.5 1 .0 -3 0
0.7 0 .8 - 1 2
1.0 0 .5 - 1 0
1.2 0 .4 - 3 .0
1.5 0 .2 - 3 .0
1
O
O
O
2.0
112
FE DE ERRATAS
PÁG INA 69
DICE: Expresar los resultados en U F C /g de suelo seco (Figura 21.1).
DEBE DECIR: Expresar los resultados en U F C /g de suelo seco (Figura 22.1).
PÁGINA 75
DICE: Se efectúa la lectura al espectrofotómetro de la solución obtenida contra el
sobrenadante del blanco, a una longitud de onda de 485 nm (Figura 26.1).
DEBE DECIR: Se efectúa la lectura al espectrofotómetro de la solución obtenida
contra el sobrenadante del blanco, a una longitud de onda de 485 nm (Figura 26.2).
PÁG INA 92
DICE: Incubar las placas de agar xilosa Usina desoxicolato (XLD) a 35 - 37 °C
durante 48 h. Las colonias típicas de Salmonella son del mismo color que el medio
de cultivo, transparentes, a veces con centros negros (Figura 29.1).
DEBE DECIR: Incubar las placas de agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) a 35
- 37 °C durante 48 h. Las colonias típicas de Salmonella son del mismo color que el
medio de cultivo, transparentes, a veces con centros negros (Figura 30.1).
Profesor Principal del Departamento de Biología de la Universidad Nacional

Agraria La Molina - UNALM. Jefe del Laboratorio de Ecología Microbiana
y Biotecnología “Marino Tabusso”. Sus estudios profesionales de Biología los
realizó en la Universidad Nacional Agraria La Molina y los de Maestría en la
Especialidad de Suelos en la Escuela de Post Grado de la misma universidad. El
grado de Doctor en Biología fue obtenido en la Universidad de Granada, España.
Coordinador Nacional de la Red Iberoamericana de Biofertilizantes Microbianos
para la Agricultura y el Medio Ambiente - Biofag, Cyted - España. Coordinador
Regional de la Asociación Latinoamericana de Rizobiología - ALAR, Miembro
de la Internacional Society for Microbial Ecologv - ISME. Miembro de la Red
ICPCNanoNet, Red Peruana de Nanotecnología y Sociedad Peruana de la
Ciencia del Suelo. Premio Mujer por la Ciencia otorgado por L’Oreal - UNESCO
- CONCYTEC.
Sus principales publicaciones en los últimos años:

“Characterization of rhizospheric bacteria isolated from maca (Lepidium meyenii
W.) in the highlands of Junin-Peru” y “Effect of different rhizospheric bacterias
in the growth of Gossypium barbadense L. in Perú, ambos en Microorganisms in
Industry and Environment. From scientific and industrial research to consumer
products (2011). “Characterization of Bacillus isolates of potato rhizosphere
from Andean soils of Perú and theír potential PGPR characteristics”, Braziliam
Journal of Microbiology (2010). “Growth and motilitv of plant growth
promoting rhizobacteria isolated from maca rhizophere”, en Biological Nitrogen
Fixation and Plant Associated Microorganisms (2010). “Fertilizers-Peru”, en
FAO Biotechnology Forum Learning from the past: Successes and failures with
agricultural biotechnologies in developing countries over the last 20 years (2009).
“Leguminosas y producción de biofertilizantes en el Perú”, en Biofertilizantes
en Iberoamérica: Una visión técnica, científica y empresarial (2007). “Phaseolus
lunatus is nodulated by a phosphate solubilizing strain of Sinorhizobium meliloti
in a Peruvian soil”, en Serie: Developments in Plant and Soil Sciences (2007).
* H O a VIN'EAV
íjm q
s\ Ws EDIAGRARIA
'S > o v i*1*
9 786124 147043

Manual de Microbiologia Agricola

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i H O A V IN E A i

U N IV E R SID A D N A C IO N A L AG RAR IA LA M O LIN A

RH IZO BIU M , PGPRs,

DORIS ELIZABETH ZÚÑIGA DÁVILA

DORIS ELIZABETH ZÚÑIGA DÁVILA

Dr. JESÚS ABEL MEJÍA MARCACUZCO

Dr. JORGE LUIS ALIAGA GUTIÉRREZ

Mg.Sc. EFRAÍN DONALD MALPARTIDAINOUYE

Mg.Sc. MARÍA BEATRIZ OLAYA MORALES

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS,

© Doris Elizabeth Zúñiga Dávila

© Universidad Nacional Agraria La Molina

Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú:

Primera Edición: mayo del 2012 - Tiraje: 1 000 ejemplares

Diseño, diagramación e impresión:

Todos los conceptos expresados en la presente obra son responsabilidad de la autora.

ice el lema de la Universidad, “quiero cultivar al hombre y al cam po”,

D como una forma de expresar la interrelación entre la cultura y la

La Universidad Nacional Agraria La M olina, es el espacio donde se desarrollan

Bajo estos preceptos y antecedentes, me complace presentar este libro “Manual

D r . J esús A bel M ejía M arcacuzco

A mis hijos E th ely Eduardo

Laboratorio de Ecología M icrobiana y Biotecnología

Centro de Ciencias Genómicas - UNA M (Cuernavaca, México)

Coordinador de la Red Biofag - CYTED, España

Fotografías y diagrama de la portada

1. Efecto de la inoculación de cepas de Azotobacter en plantas de papa.

Diagrama central (D. Zúñiga)

I. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE RHIZOBIOS

II. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS PGPR

6. Aislamiento de bacterias promotoras de crecimiento (PGPR) 31

IV. PRODUCCIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE BIOFERTILIZANTES

17. Producción de biofertilizantes 53

V. INDICADORES DE LA FERTILIDAD BIOLOGICA DEL SUELO

a fertilidad del suelo generalmente está relacionada con la cantidad de nutrientes

L disponibles para las plantas y los microorganismos juegan un rol importante en el

Por otro lado, en los últimos años se ha incrementado la demanda de análisis

El presente manual se organiza en 6 capítulos con un total de 30 temas. En primer

En segundo lugar, se presentan las técnicas de aislamiento de bacterias promotoras de

Como cuarto capítulo, se muestra la metodología de producción de inoculantes en soportes

En el quinto, se presentan algunos métodos para la determinación de la actividad

En el último capítulo se describen las técnicas de análisis de coliformes y Salmonella, las

Esperamos que el contenido de este segundo manual, resultado también de mucha

■ El macerado se siembra en placas Petri con medio agar levadura manitol

Desinfección: alcohol al 70 % x 1 min.

Desinfección: hipoclorito de sodio 3 % x 3 min.

Reaislamiento del rhizobio en medio LMA-RC.

FIGURA 2.1. Aislamiento de rhizobios a partir de nodulos

Incubar a 28 °C por 2 -10 días

FIGURA 3.1. Pruebas de pureza

■ Observar crecimiento (Figura 3.1).

■ Colocarlos en gradillas y trasladarlos a u n a cám ara de crecimiento,

Enjuagar las semillas con agua destilada

Hidratar las semillas de leguminosa en agua estéril

Colocar las semillas en placas con papel filtro

FIGURA 4.1. Desinfección y germinación de semillas de leguminosas

Semillas de leguminosa pre germinadas

Transplante de las sem illas a tubos de ensayo

Llevar a cámara de crecimiento de 18 a 22 °C

Inoculo de plántulas a los 7 días con cepas de

Observar la aparición de nodulos cada 7 días por cinco

FIGURA 4.2. Autenticación

5. CARACTERIZACION FENOTIPICA DE CEPAS DE RHIZOBIOS

* Incubar a 28 °C por 2 - 12 días (Figura 5.1).

6. AISLAMIENTO DE BACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIEN

7.4. Efecto de la inoculación con PGPRs en la germinación de diferentes cul