CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS

I.INTRODUCCIÓN
Cultivo de Tejidos vegetales "in vitro", es una técnica fisiológica que consiste en
cultivar en un ambiente de vidrio aséptico cualquier estructura vegetal, sea una célula,
un conjunto de células o un órgano, hasta constituir una planta completa capaz de ser
transferida a suelo para su evaluación agronómica correspondiente. Obviamente que
las sustancias químicas que conforman el medio de cultivo y las condiciones físicas
controladas, determina el crecimiento y desarrollo del explanto o estructura vegetal
sometida a cultivo.
Esta técnica tiene diversas aplicaciones en agricultura, citando entre las más
destacadas: la erradicación de patógenos sistémicos, la propagación clonal masiva y
rápida y el mejoramiento genético. Esto significa que podemos obtener actualmente una
planta sana a partir de otra infectada, propagar con facilidad y rapidez aquellas especies
vegetales de multiplicación lenta y difícil y lo que es más importante en tubas de ensayo
se pueden obtener y seleccionar plantas con mayores y mejores rendimientos,
resistencia a enfermedades y tolerancia a condiciones estresantes externas como
heladas, sequia, salinidad, etc.

II. OBJETIVOS
 Preparar medio de cultivo Murashige y Skoog (MS)
 Introducir semillas
 Evaluar el crecimiento del explante in vitro

III. MATERIAL DE PRÁCTICA

Material biológico: Semillas de alfalfa.

Material de laboratorio:
01 litro de alcohol comercial
01 paquete de papel de aluminio
01 paquete de algodón (100 g)
01 pinza de punta fina
10 frascos de vidrio
01kg de agar-agar
01liego de papel de filtro
01 caja de fósforos
02 placas petri
01 litro de ron comercial
01 bolsa de detergente (250 gr)
01 botella de lejía (250 ml)
01 bisturí con navaja
01 plumón marcador
01 mechero de vidrio
01 mascarilla
250 ml de agua estéril
100 g de azúcar blanca

IV.PROCEDIMIENTO
A. Preparación de medios de cultivo (MS)
1. Preparar medio basal MS, según indicaciones del profesor.
2. Incluir la sacarosa, el agar y medir el pH.
3. Repartir MS en recipientes de vidrio
4. Cubrir recipiente de vidrio con papel de aluminio
5. Autoclavar en autoclave por treinta minutos
6. Dejar enfriar para luego introducir explantes.

B. Preparación e introducción de explante

1. Seleccionar el explante a trabajar (semillas).
2. Lavar varias veces (3) con agua corriente.
3. Cortar en segmentos de tres centímetros, depositar en recipiente de vidrio y lavar
con detergente al 10% durante 30 minutos y con agitación permanente. Lavar con
agua corriente hasta que desaparezca detergente.
4. Limpiar su mesa de trabajo con lejía (2,5%) utilizando algodón.
5. Prender sus mecheros que contienen ron.
6. Desinfección de los explantes: Colocarlos en alcohol (70%) por treinta segundos,
luego lavar con agua estéril.
7. Dejar en lejía(2.5%) por dos minutos. Agitación constante. Lavar con agua estéril
por tres veces.
8. Los explantes desinfestados colocarlos en placa petri estéril en cuyo interior hay
papel de filtro estéril.
9. Desinfestar pinza y bisturí (quemar en llama del mechero) y cortar en segmentos de
un centímetro
10. Introducir en recipiente de vidrio con medio nutritivo.
11. Colocarlos en sala de incubación con fuente luminosa (fluorescentes)
11. Observar a los cinco días.

V. CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las áreas de un Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales?
Un laboratorio de cultivos vegetales tiene 8 áreas de trabajo que son las
siguientes:
 Area de preparación de medios de cultivo
 Area de lavado de esterilización
 Area de transferencia
 Area de incubación
 Area de observación y examen
 Area de crecimiento in vivo
 Area de cuarentena y de control fitosanitario
 Area de oficina
2. ¿Cuál es el material de vidrio que se utiliza con frecuencia?
El material de vidrio más utilizado son los matraces y los pequeños frascos de
vidrios llamados viales.
3. Cuáles son los equipos/aparatos indispensables en un laboratorio de cultivo de
tejidos?
Son el autoclave, los medidores de PH, las balanzas analíticas y los hornos
para secado.
4. ¿Qué desinfectantes se utilizan para introducir explantes libres de patógenos?
Se utilizan mayormente hipoclorito de sodio, etanol al 75% pero también se
puede usar agroquímicos contra hongos y virus más conocidos dependiendo
del tipo de planta a esterilizar como el benomilo
5. ¿En el medio MS, cuales son los macronutrientes?
Son el nitrógeno,el carbono, el oxígeno, el fosforo y el hidrógeno
6. ¿Cuál es el rango de pH que debe tener un medio de cultivo?
El rango de PH que debe tener un mediod e cultivo in vitro debe ser de 5.5 a
6.5 de Ph
7. ¿Porque se agrega sacarosa al medio de cultivo?
Por que el explante no hace la fotosíntesis eficientemente por lo tanto es
necesario darle una fuente de carbono fácilmente asimilable
 8. ¿Cuáles es la finalidad de suplementar el medio de cultivo con reguladores del
crecimiento?
La principal finalidad es la investigación de cómo estos reguladores pueden
afectar a los diversos explantes

VI. RESULTADOS
A los cinco días anotar sus resultados.

Tabla 1. Evaluación de germinación de semillas in vitro a los 07 días de edad

Variables Contaminado Necrosado Medio Semillas Tall
Explante s s fenolizad germinada o
o s Raíz
1 1 0 1 3 3
2 0 0 0 5 5
3 2 0 0 3 3
4 0 0 0 5 5
5 0 0 0 5 5
6 0 0 0 5 5
7 0 0 0 5 5
8 0 0 0 5 5
9 0 0 1 4 4
10 0 0 0 5 5
Promedi 3 0 2 45 45
o

Semilla de alfalfa contaminada Semilla de alfalfa en medio fenolizado

Cultivo finalizado por mal

Se observa el hongo tratamiento del explante,
invasivo a los 7 días de estuvo dañado y las
empezado el fotoperiodo. enzimas se combinaron y
no dejaron crecer al
explante
Semillas germinadas donde se observa los tallos y algunas raíces:

VII. CONCLUSIONES
 Se preparó 100 ml de medio MS para poder sembrar semillas de alfalfa y observar
su crecimiento por 7 días y así poder evaluarlas.
 Se esterilizaron 50 semillas de alfalfa y se fueron introduciendo 2 por cada vial a
evaluar sin embargo se observó cada semilla individual y no por vial.
 Evaluamos el crecimiento del explante para siete días y comprobamos que el
método de esterilización fue muy efectivo por observarse una contaminación
mínima en los explantes.