Industrias Lácteas

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Práctica 5. CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE LA LECHE

Introducción
La leche, está constituida por una mezcla variable, compleja, de varios constituyentes de alto
valor nutritivo y por lo tanto de gran importancia para la industria, porque de éstos depende
la composición de los productos fabricados.
Por lo tanto, durante la recepción, el control de rutina debe ejercerse especialmente para
descubrir los casos de fraude y las leches que se encuentran bajo el estándar.
Por otro lado, además del estándar de composición, hay necesidad de ejercer vigilancia sobre
el estándar microbiano (estado de frescor de la materia prima), grado higiénico y propiedad
de conservación.
Para aplicar este control es necesario establecer un criterio técnico basado en métodos
seguros, precisos y fáciles para evaluar cada aspecto de calidad.
Mientras que la calidad de composición en grasa y proteína, una vez determinada, es
inmutable para cada caso, la calidad higiénica, especialmente el aspecto microbiano, está en
constante cambio no sólo en la materia prima sino en gran parte de los productos.

Objetivos
 Reconocer los métodos (procedimientos) para determinar la calidad microbiológica
de la leche y derivados.
 Ejecutar los procedimientos de análisis microbiológico de leche y derivados.
 Determinar las características microbiológicas de la leche y derivados, y
 Definir la calidad final de la leche y derivados.

Competencia a lograr en el estudiante

Al terminar esta práctica, el estudiante estará en la capacidad de describir y ejecutar los
procedimientos adecuados para determinar y definir la calidad microbiológica de la
leche y derivados.

Marco teórico
Pruebas de acidez de leche
Es usada para determinar la reacción de la leche, esta prueba nos da un número que, en
realidad, expresa la reacción de la caseína en conjunto con la reacción del ácido láctico
existente.

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En muchos casos el valor de la prueba es relativo, pero, en general, y en la práctica, su utilidad

es innegable para apreciar el desarrollo microbiano por desdoblamiento de lactosa en ácido
láctico.

Calidad bacteriológica de la leche

El ensayo de reducción de azul de metileno, es un procedimiento simple para estimar la
calidad bacteriológica de la leche. El azul de metileno, de color azul en presencia de oxígeno,
se vuelve incoloro cuando la cantidad de oxígeno es limitada o eliminada. Normalmente la
leche contiene cierta cantidad de oxígeno disuelto. El agregado de una solución de azul de
metileno a una leche normal le da un color azul. Pero si se agrega ese colorante a una leche
que tenga bacterias y se le mantiene a una temperatura adecuada, las bacterias crecerán y
usarán el oxígeno.
Cuando el oxígeno ha sido consumido el color azul desaparece. El tiempo requerido para que
ocurra el viraje del azul al blanco, se llama “tiempo de reducción”. Cuando más grande es el
número de bacterias presentes, más corto es el tiempo de reducción.
Para reportar los resultados de la prueba de la reductasa o actividad biológica, se realiza
mediante una tabla de clasificación simple, que nos indica una idea de la calidad de la leche
y el número aproximado de bacterias presentes en la leche.
El número de microorganismos aumenta cuando la temperatura se incrementa hasta 35 o 40
ºC, como se puede observar en el siguiente cuadro:

Tiempo
Número de bacterias por ml
transcurrido
(horas) 15 ºC 25 ºC 35 ºC
0 9 000 9 000 9 000
3 10 000 18 000 30 000
6 25 000 172 000 12 000 000
9 46 000 1 000 000 36 000 000
24 5 000 000 57 000 000 800 000 000

Igualmente, al comparar el test de Resazurina con el de Azul de Metileno respecto al conteo

en placas, se obtienen los siguientes resultados mostrados en las dos siguientes tablas:

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Comparación del color de Resazurina en una hora con el conteo estándar en placa

Conteo estándar en placa (ufc(ml)

N° de Color de
muestras Resazurina 25,000 – 50,000 – 100,000 –
< 25,000 > 200,000
50,000 100,000 200,000
220 Azul 160 32 14 9 5
30 Rosado púrpura 7 12 3 3 5
32 Rosado Claro 17 10 - 2 2

14 Rosado 8 - 2 2 2
7 Rosado oscuro 4 1 - - 2
2 Blanco 1 - - - 1
Fuente: Barret, W y Keenan, J. 1938

Comparación del tiempo de reducción del Azul de Metileno con el conteo estándar en
placa

Conteo estándar en placa (ufc(ml)

N° de
TRAM
muestras 25,000 – 50,000 – 100,000 –
< 25,000 > 200,000
50,000 100,000 200,000
253 7 horas 174 48 13 12 6

19 6 horas 6 5 3 3 2
7 5 horas 2 1 2 - 2
23 < 5 horas 4 5 2 3 8
Fuente: Barret, W y Keenan, J. 1938

De los resultados obtenidos, se establece que la calidad bacteriana de la leche obtenida en

una hora de incubación con Resazurina son completamente confiables como el test de Azul
de Metileno en 7 horas de incubación; siendo además que la Resazurina es más sensible a
leches patológicas y fisiologías anormales de la ubre que el Azul de Metileno.

Metodología experimental
Determinación de la reductasa (azul de metileno o método TRAM)
a. Tomar 10 ml de leche en un tubo de prueba con tapa estéril.
b. Agregue 1 ml de solución de azul de metileno dentro de cada tubo.
c. Para preparar una solución de azul de metileno, disolver una pastilla (equivalente a 1
g) en 200 ml de agua destilada caliente y estéril o en todo caso preparar una solución

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de 55 ppm de tiocianato de azul de metileno medicinal. El tiempo de preparado no

debe exceder los seis días al momento de ser usado.
d. Una vez que la alícuota de ésta se ha añadido al tubo de prueba con tapa, llevar a
baño maría a una temperatura de 37 ºC con un control cada 30 minutos, el agua debe
encontrarse en el baño maría siempre por encima del aforo de la muestra de leche.
e. La interpretación de los resultados se realizará en base a las tablas siguientes.

Clasificación de la prueba de reductasa

Tiempo (horas) Escala de clasificación

Más de 5 horas Bueno o muy bueno

Más de 2.5 horas aceptable
Más de 20 minutos Regular
Menos de 20 minutos Malo

Clasificación de la prueba de reductasa

Tiempo de Tiempo de
Recuento Acidez
reducción conservación
(ufc) (% ácido láctico)
(horas) (horas)
9 1 400 40
7–8 15 500 47
5 178 000 35
4 0.155 30
3 1 995 000 0.160 30
2 0.165 20
1 22 400 000 0.175 20
1/2 0.190 12

Determinación de la frescura de la leche (de Morres)

Es un ensayo colorimétrico que proporciona una indicación de la frescura de la leche, basado
en la distinta coloración que toma una disolución alcohólica de alizarina (2 g de alizarina por
litro – al 0.2 % –de etanol de 68 ºC) a la que se añade igual volumen de leche. La leche fresca
da una coloración rojo – lila, que pasa al rosáceo, rojo – pardo y al amarillo a medida que la
leche es más ácida, hasta formación de flóculos más o menos abundantes a consecuencia de
la acidez.

Prueba de alcohol alizarina (de Morres)

a. Mezclar en un tubo de ensayo de 10 ml, 3 ml de leche con 3 ml de una mezcla de
alcohol neutro al 68% con 0.2% de alizarina.

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b. Observar luego si existe formación de coágulo (la leche fresca con 0.16 o 0.17% de
acidez no coagula) y cambio de color a lila – rosa (morada clara rosa) según tabla
siguiente.

Grado Acidez Color Aspecto

1º 0.16 Lila/rojo Coagulación: nula

2º 0.18 Rosa o rojo pálido Coagulación: nula a muy ligera

3º 0.20 Rojizo/castaño Coagulación: partículas muy finas

4º 0.22 Castaño/rojo Coagulación: partículas finas – flóculos

5º 0.25 Castaño Coagulación: floculados grandes y

pequeños

6º 0.27 Castaño/amarillento Coagulación: floculados grandes

7º 0.31 Amarillo/castaño Coagulación: floculados grandes (olor y

sabor)

8º 0.36 Amarillo Coagulación: espontanea

9º 0.16 Rojo ladrillo/oscuro Floculados compactos (aspecto cuajada)

presencia de bacterias formadoras de
cuajo.
10º alcalina Violeta Coagulación: floculados finos, ubre
enferma (mastitis).

OJO. Esta verificación, que es una prueba combinada para averiguar la capacidad e
intensidad de los factores de acidez, es útil para la selección en 3 grandes grupos:
 Leche buena para leche fluida, leche concentrada, leche en polvo.
 Leche que se puede emplear en la fabricación de queso.
 Leche anormal, impropia para ser empleada.
Esta prueba es rápida, pero no permite apreciar la calidad bacteriológica de la leche en
relación, por ejemplo, con bacterias termo – resistentes, que no acidifican la leche en forma
apreciable.

Determinación de la acidez mediante la resazurina en 10 minutos

Consiste en medir – por medio de una escala de comparación de tonos de color – la
decoloración que sufre la resazurina en presencia de la leche incubada por 10 minutos a 37
°C por la acción de una enzima producida por bacterias.
La escala de comparación (montada en discos) está dividida como sigue:

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N° disco Color
6 Azul

5 Lila

4 Violeta

3 Entre violeta y rosa

2 Ídem, pero más

pronunciado al rosa

1 Rosa

0 Sin color (leche

blanca)

Aplicación de los resultados de la prueba de la resazurina

N° disco Acción recomendada

4 – 6 Bueno Leche aceptada para pasteurización

1 – 3 Dudoso Se aconseja rechazar la leche para

pasteurización

0 – 1/2 Malo Rechazar la leche

Prueba para realizar la presencia de mastitis en leche

a. Tomar 2 gotas de muestra de leche a analizar en un tubo de ensayo.
b. Añadir sobre la leche 2 gotas de NaOH 1N.
c. Se mezcla, y si se observa que se corta la leche estará comprobado que tiene mastitis
clínicas.

Resultados y discusiones

Conclusiones

Recomendaciones

Referencias bibliográficas

Anexos

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Cuestionario
1. Complete el cuadro siguiente:

Principales ácidos orgánicos y su miliequivalente

Ácido PM Fórmula Miliequivalente

Ácido acético
Ácido benzoico
Ácido láctico 90 HC3H5o3 0.090
Ácido cítrico
Ácido málico
Ácido tartárico
Ácido oxálico
Ácido butírico
Ácido oleico
Ácido barbitúrico
Ácido propiónico
Ácido succínico
Ácido fumárico
Ácido fórmico

2. ¿Cuáles son los métodos del conteo en placa aplicables a leche y derivados? Explique
cada uno.
3. ¿Cuál es la relación entre la acidez titulable en °D, °SH, ºTh y % ácido láctico con la
prueba de TRAM, alizarina y resazurina? Elabora una tabla y explique.

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