TEMA 11.

- CINÉTICA ENZIMÁTICA

Introducción: Cinética enzimática.

Ecuación de Michaelis-Menten.
Ecuación de Lineweaver-Burk.

Reacciones con múltiples substratos.

Inhibición enzimática:
- Reversible
Competitiva.
No competitiva.
Acompetitiva.
- Irreversible. Ejemplos de inhibidores irreversibles
 Introducción. Cinética enzimática
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas
por enzimas.

Perfil cinético de un enzima micaeliana Perfil cinético de un enzima alostérico

 Modelo Cinético de Michaelis-Menten
• Las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas:

Primera etapa, se forma el complejo enzima-sustrato.

Segunda etapa, el complejo enzima-sustrato se transforma en el producto,
liberando el enzima.
• V1 = k1 [E] [S]
• V2 = k2 [ES]
• V3 = k3 [ES]

• En equilibrio la V de formación de ES es igual a la velocidad de descomposición.

V1 = V2 + V3

k1[S] [E] = (k2 + k3 )[ES]

[E] = [ET] - [ES]

donde la expresión (k2+ k3)/k1 se ha sustituído por KM, o constante de Michaelis-Menten

 Modelo Cinético de Michaelis-Menten

• La velocidad de reacción = la velocidad de formación del producto:

v = v3 = k3 [ES] =

• La velocidad máxima (Vmax) se obtiene cuando el enzima está saturada por el S.

Vmax = k3 [ET]

• Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad

obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:
 Modelo Cinético de Michaelis-Menten

La representación gráfica de la ecuación de

Michaelis-Menten (v frente a [S]) es una hipérbola

KM es la concentración de sustrato
para la cual la velocidad de reacción
es la mitad de la velocidad máxima.

En efecto, si KM = [S], la ecuación de

Michaelis-Menten se reduce a:
v = Vmax/2.

El valor de KM da idea de la afinidad

del enzima por el sustrato: A menor
KM, mayor afinidad del enzima por el
sustrato, y a mayor KM, menor
afinidad.
 Representación de Lineweaver-Burk
Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la
representación doble recíproca (1/v frente a 1/[S]), ya que es una línea recta. Esta
representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk

Vmax • [S]
v =
Km + [S]
KM/Vmax
1 1 Km
v
1
v
= [ ] Vmax
1 + 1
[S] Vmax

Vmax
y= m. x + b

-1
1 • pendiente es KM/Vmax
• abscisa en el origen es -1/KM
Km [S] • ordenada en el origen es 1/Vmax

A partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores

de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.
 Reacciones con múltiples substratos

a) Reacción enzimática con formación de un complejo ternario (ES1S2)

a.1. Unión aleatoria de los S

a.2. Unión ordenada de los S

b) Reacción enzimática en la que no se forma de un complejo ternario

Mecanismo ping pong

 Inhibición Enzimática
Inhibidor: Efector que se une al enzima y hace disminuir su actividad,
mediante interacciones con el centro activo u otros centros específicos.

Se excluyen todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a través de desnaturalización

de la molécula enzimática.

Dos tipos de inhibidores:

* Inhibidores reversibles: establece un equilibrio con la enzima libre,
con el complejo enzima-substrato, o con ambos.
- COMPETITIVOS: El inhibidor se fija al centro activo de
la enzima libre, impidiendo la fijación del sustrato.
- NO COMPETITIVOS: El inhibidor se fija a la enzima
independientemente de que lo haga o no el sustrato. No
impide la fijación del sustrato a la enzima, pero sí la acción
catalítica.
- ACOMPETITIVOS: El inhibidor se fija únicamente al
complejo enzima-sustrato una vez formado, impidiendo la
acción catalítica
* Inhibidores irreversibles: modifican químicamente a la enzima mediante
uniones covalentes.
Inhibición Enzimática Inhibición reversible
Inhibición competitiva

S
E ES E + P
I
Se define una constante de equilibrio [E] [I]
de disociación del inhibidor Ki =
EI [EI]
Características:

-Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente excluyentes.

- A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibición.

- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo estructural del sustrato.

- El inhibidor es tan específico como el sustrato.

Inhibición Enzimática Inhibición reversible

Inhibición competitiva Vmax • [S]

Representación directav´=
Inhibición competitiva Km
[ ]
1+[I] + [S]
Ki
120
v ´
100
Sin Inhibidor

80

60

40
Km´= Km (1+[I]/Ki)
Con Inhibidor
20

s
0
0 20 40 60 80 100 120
Inhibición Enzimática

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble

0.07
1/v
0.06

0.05

0.04

1/Vmax
0.03

0.02
-1/Km
0.01

1/s
0.00
-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

-1/(Km(1 + i/Ki))
Inhibición Enzimática

Ejemplo de inhibición competitiva

COO- FAD FADH2 COO-

CH2 CH
CH2 SDH CH
Succinato
COO- deshidrogenasa COO-
Succinato Fumarato

COO- COO-
Inhibidores CH2 C O
competitivos COO- CH2
COO-
Malonato
Oxalacetato
Inhibición Enzimática Inhibición reversible
Inhibición no competitiva

S
E ES E + P
I I
S
EI ESI
Características:

- El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre (E) y al complejo

enzima-sustrato (ES)

- Ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

Inhibición Enzimática Inhibición reversible
Inhibición no competitiva

Vmax’ < Vmax

Vmax’ = Vmax /(1+[I]/Ki)

Vmax . [S]
V´ =
Km . (1+[I]/Ki) + [S] . (1+[I]/Ki)

Vmax´= Vmax/(1+[I]/Ki)
Inhibición Enzimática Inhibición reversible
Inhibición acompetitiva o mixta

- El I sólo se une al complejo ES y en

un sitio distinto al que se fija el S en el centro
activo

- Baja la Km y Vmax, pero el cociente

Km/Vmax no se altera.

-Ocurre en reacciones multisustratos

El lugar de unión del I se crea

tras la unión del S al E
Inhibición Enzimática Inhibición reversible
Inhibición acompetitiva o mixta

Inhibición acompetitiva
Inhibición Enzimática

Inhibición Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima,
modificándola covalentemente

E + I E’
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

- Una clase especial de inhibidores irreversibles son los Inhibidores suicidas:

Son poco reactivos hasta que se unen al centro activo del enzima, donde se
transforman en un compuesto muy reactivo, inactivando irreversiblemente al enzima.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles:

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosforados

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados
Inhibición Enzimática

Ejemplos de inhibidores irreversibles

Compuestos organofosforados

Ser CH CH2 OH H3C CH3

CH
Ser CH CH2 O P O
H3C CH3 CH
CH H3C CH3
Diisopropil F P O
fluorofosfato
(DFP) CH
H3C CH3

Malation

- Actúan sobre enzimas serínicas (serin proteasas, acetil colinesterasa...),

uniéndose covalentemente a través del grupo fosfato.

Ejemplos: DFP, Insecticidas (Paration, Malation)

Gases de guerra (Sarín), gas mostaza.
Inhibición Enzimática

Ejemplos de inhibidores irreversibles

Ión cianuro, CN-: Se fija con gran afinidad a la sexta posición de

coordinación del Fe hemínico del complejo citocromo oxidasa.

Penicilinas. Inhiben enzimas serínicas que participan

en la formación de la pared bacteriana.
Inhibición Enzimática

Inhibidor suicida (Inhibidores activados enzimáticamente)

- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual

que el substrato o los inhibidores competitivos
- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especie
química muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola

- Tienen por tanto la especificidad del inhibidor competitivo y la potencia de los

inhibidores irreversibles

Modo de acción de los inhibidores suicidas

1 2 3
E + I EI EI* E’ + I*

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el sustrato o un inhibidor competitivo convencional.

2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*.
3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un
inhibidor irreversible.
Inhibición Enzimática
Ejemplo de inhibidores suicidas

Sistema de la β-lactamasa bacteriana

La utilización masiva de antibióticos β-lactámicos (penicilinas,derivados semisintéticos y
cefalosporinas) ha conducido a la aparición de resistencias a los mismos.

Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por producir una enzima, la
β-lactamasa, que inactiva a los antibióticos β-lactámicos.

Con frecuencia los preparados de penicilinas se formulan

Penicilina (activa) añadiendo un inhibidor suicida de la β-lactamasa, el
ácido clavulánico
S
R CO NH CH3
O O
N CH3 CH2OH O CH2OH
O C β-Lactamasa C
C
COO- N H O- HN H
O
COO- COO-

β-Lactamasa Ác.clavulánico Esta molécula reacciona con la

serina activa de la β-lactamasa,
produciendo su inactivación
S
R CO NH CH3
O
O C HN CH3 O CH2OH
C
O- CH CH2 O
C
COO- HN H
Ser
COO-
Ác.peniciloico (inactivo)
Inhibición Enzimática

Resumen de los parámetros cinéticos de las reacciones enzimáticas:

efecto de los distintos tipos de inhibición.

Tipo de inhibición Ecuación de velocidad Km Vmáx

Vmáx . [S]
Sin inhibidor V = Km Vmáx
Km + [S]

Vmáx . [S]
Inhibición competitiva V = Km (1+[I]/Ki) Vmáx
Km . (1+[I]/Ki) + [S]

Vmáx . [S]
Inhibición no competitiva V = Km Vmáx/(1+[I]/Ki)
Km.(1+[I]/Ki)+[S].(1+[I]/Ki)

Vmáx . [S]
Inhibición acompetitiva o V = Km/(1+[I]/Ki) Vmáx/(1+[I]/Ki)
mixta Km +[S].(1+[I]/Ki)