FEBS 29453 FEBS Letters 579 (2005) 2313-2318 aumento en la concentración de fructosa-6-P

requerida para la reversión de la inhibición MgATP

Papel de Cys-295 en las interacciones de las relativa al enzima de tipo salvaje.
subunidades y la regulación alostérica de la
fosfofructoquinasa-2 de Escherichia coli 2005 Federación de Sociedades Europeas de
Bioquímica. Publicado por Elsevier B.V. Todos los
André's Caniuguira, Ricardo Cabreraa, Mauricio derechos reservados.
Ba'eza, Claudio C. Va'squezb, Jorge Babula, Victoria
Guixe'a, *
Palabras clave: interacción de la subunidad; Grupo
a Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular,
SH; Fosfofructoquinasa; Regulación alostérica;
Departamento de Biología, Facultad de Ciencias,
Escherichia coli
Universidad de Chile, Casilla 653, Santiago, Chile b
Departamento de Biología, Facultad de Química y
Biología, Universidad de Santiago de Chile, Santiago,
Chile

Recibido el 16 de diciembre de 2004; revisado el 20

de enero de 2005; aceptado el 8 de febrero de 2005 1. Introducción

Disponible en línea el 23 de marzo de 2005

La asociación de la subunidad en proteínas
Editado por Judit Ova'di
oligoméricas y su modulación mediante la unión de
ligandos desempeña un papel central en varios
procesos biológicos tales como la regulación de la
actividad enzimática y la transducción de señales.
Resumen En un trabajo previo, la modificación
Por esta razón, las interfaces oligoméricas son
química de Cys-238 de Escherichia coli Pfk-2 generó
importantes para la estabilidad, el ensamblaje y la
preocupación sobre la importancia del estado
función de la proteína. En Escherichia coli (E. coli),
dimérico de Pfk-2 para la actividad de la enzima,
dos enzimas catalizan el paso clave del compromiso
mientras que la modificación de Cys-295 perjudicó la
en la vía glucolítica, la fosfofructoquinasa-1 (Pfk-1) y
actividad enzimática y el MgATP. inducida por
la fosfofructoquinasa-2 (Pfk-2), que son proteínas
tetramerización de la enzima. Los resultados
oligoméricas que dependen de sus interfaces de
presentados aquí demuestran que el estado dimérico
subunidad para la regulación de sus actividades. Pfk-
de Pfk-2 es crítico para la estabilidad y la actividad de
1 es un homotetrámero que presenta cinética
la enzima. La sustitución de Cys-238 por Ala o Phe no
sigmoi-dal con respecto a la fructosa-6-P y la
muestra ningún efecto sobre los parámetros
regulación alostérica por los activadores ADP o GDP y
cinéticos, la inhibición alostérica, la estabilidad del
por el inhibidor PEP [1-4]. Los sitios de enlace para
dímero y la estructura oligomérica de Pfk-2. Sin
estos efectos se encuentran en el interfaz de la
embargo, la mutación de Cys-295 por cualquiera
subunidad y están formados por residuos de
aminoácidos procedentes de diferentes cadenas
polipeptídicas [5]. Por lo tanto, la importancia de las
Ala o Phe provoca una disminución en el valor de
interacciones interfaciales para la regulación y la
kcat y un incremento en los valores de Km para
estabilidad de la actividad de Pfk-1 se ha abordado
ambos sustratos. Sugerimos que el
en varios estudios [6, 7].

El residuo Cys-295 participa en interacciones

Por otro lado, homodimeric Pfk-2 exhibe cinética
intersubunitarias en el tetrámero ya que el mutante
hiperbólica con respecto a ambos sustratos,
Cys-295-Phe exhibe una mayor estabilidad del
fructosa-6-P y MgATP, y no muestra sensibilidad
tetrámero, lo que a su vez da como resultado un
hacia los efectos alostéricos que regula Pfk-1 [4]. Sin
embargo, la actividad de Pfk-2 está regulada por la
unión de MgATP a un sitio alostérico que causa la
inhibición de la actividad de la enzima a bajas
concentraciones de fruc-tose-6-P [8,9]. Además, esta
inhibición está vinculada a un proceso de asociación
dímero-tetra-mer [10, 11]. Por lo tanto, las
propiedades estructurales de la interfaz dímero-
dímero deben contribuir al mecanismo molecular por
el cual la unión alostérica de MgATP está vinculada a
la inhibición de la enzima. Sin embargo, en ausencia
de una estructura tridimensional determinada
experimentalmente de la enzima, esta contribución
es difícil de evaluar. Por la misma razón, se sabe poco
sobre la importancia que pueden tener las
interacciones de monómeros en la actividad y
estabilidad de Pfk-2 nativo.
No obstante, se ha obtenido cierta información
estructural a partir de experimentos de modificación
química en estudios del papel de los residuos de
cisteína en la actividad y estructura oligomérica de
Pfk-2 [11,12]. La modificación química de Cys-238
con maleimida de pireno (PM) genera una enzima
monomérica inactiva, que se convierte en un estado
dimérico totalmente activo en presencia de los
sustratos. Como proteína nativa, la enzima
modificada muestra la capacidad de formar
tetrámeros en presencia de MgATP. Por otro lado, el
marcado específico de Cys-295 con eosina maleimida
(EM) da como resultado el deterioro de la
tetramerización inducida por MgATP, la ausencia de
unión alostérica de MgATP y la inactivación de la
enzima [12]. Estos resultados sugieren que mientras
que Cys-238 probablemente participa en las
interacciones de subunidades de Pfk-2 dimérica, Cys-
295 podría estar involucrado en la unión de MgATP,
la formación de tetrámeros y la actividad enzimática.
concentración requerida para revertir la inhibición de
MgATP de la actividad enzimática y de la formación
de tetrámeros.
2. Materiales y métodos
2.1. Mutagénesis dirigida al sitio
La mutagénesis dirigida al sitio se llevó a cabo
usando el sistema QuickChange (Stratagene) usando
plásmido pET21d (Novagen) que contenía el gen pfk-
2 como molde. Se usaron dos oligonucleótidos para
construir cada mutante, ambos complementarios a
hebras opuestas del molde. Las letras en negrita
indican las bases sustituidas, las bases subrayadas
indican el codón triplete para el aminoácido recién
introducido (solo se muestran los oli-gonucleótidos):
Cys-238-Ala, 50-GTT GAT AGT GAA AAC GCT ATT CAG
GTG GTG CCA-30 ; Cys-238-Phe, 50-GGT GTT GAT
AGT GAA AAC TTT ATT CAG GTG GTG CCA CC-30; Cys-
295-Ala, 50-CAG GGA ACA CGT CTG GCC TCC CAT
GAC GAT ACG-30; Cys-295-Phe, 50-CAG GGA ACA
CGT CTG TTC TCC CAT GAC GAT ACG-30.
2.2. Expresión y purificación de enzimas
Las enzimas mutantes Pfk-2 se produjeron en E. coli
DF1020 ya que esta cepa no expresa
fosfofructocinasas de tipo salvaje [13]. La cepa
DF1020 se transformó previamente con el plásmido
pGP1-2 [14] que permite la expresión de la ARN
polimerasa de T7 después de la inducción por calor.
Los cultivos se cultivaron a 30 LC en medio Luria
Broth suplementado con ampicilina y kanamicina
hasta una concentración final de 100 y 75 μg / ml,
respectivamente. La expresión de proteína se indujo
a una A600 = 0,5 por tratamiento térmico a 42 LC
durante 20 minutos; a continuación, el cultivo se
incubó a 37 LC durante 4 h antes de recoger las
células por centrifugación. El tipo silvestre y las
enzimas mutantes se purificaron esencialmente
como se describe en [4]. Las cepas de E. coli
transformadas produjeron un promedio de 10-15 mg
de proteína (tipo silvestre y mutante Pfk-2) por l de
cultivo.
2.3. La cinética de enzimas
La actividad de Pfk se determinó
espectrofotométricamente acoplando la producción
de fructosa-1,6-bisP a la oxidación de NADH como se
describió previamente [8]. En los experimentos de
desplegamiento inducido por hidrocloruro de
guanidina (GdnHCl) de mutantes de tipo silvestre
Pfk-2, Cys-238 y Cys-295, se midió la actividad
enzimática diluyendo 700 veces, en el medio como
se dice, las muestras de enzimas que tenían
previamente incubado en diferentes concentraciones
de GdnHCl. En estas condiciones, la concentración
máxima de agente desnaturalizante alcanzada en el
ensayo era inferior a 4 mM y, por lo tanto, puede
despreciarse. Además, la actividad de la enzima se
midió durante los primeros 5 minutos, donde el
proceso de renaturalización es negligible (M. Baez,
observaciones no publicadas).
2.4. Cromatografía de exclusión por tamaño
Se realizaron experimentos de cromatografía de
exclusión por tamaño con un sistema de bomba
binaria Waters 1525 HPLC, con una columna Bio-Sil
SEC-250 (7,8 mm · 30 cm) (BioRad, Hercules, CA, EE.
UU.) Equilibrada en un tampón que contiene Tris-HCl
40 mM , pH 7,6, MgCl _ {2} 5 mM, KCl 200 mM, DTT 2
mM en ausencia o en presencia de MgATP 0,5 mM, a
un caudal de 0,8 ml / min. La columna se calificó con
los siguientes marcadores de masa molecular:
anhidrasa carbónica (29 kDa), alcohol
deshidrogenasa (150 kDa), b-amilasa (200 kDa) y
tiroglobulina (669 kDa). La elución de proteína se
registró con el uso de un detector dual Waters 2487
UV en línea que mide la absorbancia a 280 nm.
2.5. Despliegue inducido por GdnHCl de enzimas de
tipo salvaje y mutantes Se realizó desnaturalización
de formas de tipo salvaje y mutantes de Pfk-2.
incubando soluciones de proteína (90 μg / ml) a 20
LC durante 48 h en tampón HEPES 25 mM, pH 8,0,
MgCl2 5 mM, DTT 5 mM, que contenía diversas
concentraciones de GdnHCl, en ausencia o en
presencia de ATP 1 mM , de modo que se logró el
equilibrio.
2.6. Mediciones dinámicas de dispersión de luz
Los experimentos se realizaron a 18 ± 0.1 LC
utilizando un DLS DynaPro MSTC014 (Protein
Solutions Inc. - Bucks, Inglaterra). Las muestras para
mediciones dinámicas de dispersión de luz contenían
0,5 mg / ml de proteína en tampón Tris-HCl 25 mM,
pH 8,2, MgCl2 5 mM y DTT 5 mM y
En este trabajo, presentamos evidencia sobre la
importancia de las interacciones entre subunidades
para la actividad y la estabilidad de Pfk-2 dimérica, y
sobre la contribución del residuo Cys-238 a esta
interacción. Además, se evaluó la participación de
Cys-295 en las interacciones dímero-dímero y en la
regulación alostérica por MgATP. Los resultados
informados aquí muestran que la actividad de Pfk-2
está asociada a su estado dimérico y que Cys-238 no
es crítica para el mantenimiento del estado
oligomérico o para la estabilidad del dímero Pfk-2.
Sin embargo, la introducción de fenilalanina en la
posición 295 aumenta la estabilidad del estado
tetramérico de la enzima y la fructosa-6-P.
0014-5793 / $ 30.00 2005 Federación de Sociedades
Europeas de Bioquímica. Publicado por Elsevier B.V.
Todos los derechos reservados. doi: 10.1016 /
j.febslet.2005.02.078
*Autor correspondiente. Fax: +56 2 2712983.
Correo electrónico: vguixe@uchile.cl (V. Guixe').
Abreviaturas: PM, pireno N- (1-pirenil) maleimida;
EM, eosina 5-maleimida; GdnHCl, hidrocloruro de
guanidina; Pfk, fosfofructo-quinasa; Fructosa-6-P,
fructosa-6-fosfato
A. Caniuguir et al. / FEBS Letters 579 (2005) 2313-
2318
se incubaron durante 36 h a las concentraciones de
GdnHCl indicadas. Los datos se recogieron para 15 ll
muestras después de la centrifugación a 10 000 rpm
durante 10 minutos en una microcentrífuga
Eppendorf para eliminar material particulado. La
intensidad dispersada por la proteína se determinó a
partir del histograma de regularización utilizado para
encontrar la contribución de especies individuales a
la dispersión total (mediante la transformación
inversa de Laplace) utilizando el programa
DYNAMICS suministrado con el instrumento.
2.7. Mediciones de fluorescencia
Los espectros de emisión de fluorescencia se
registraron a temperatura ambiente en un
fluorímetro Perkin Elmer LS 50. La longitud de onda
de excitación fue de 295 nm y la emisión se registró
de 305 a 500 nm. Las hendiduras de excitación y
emisión se ajustaron a 5 nm. Los experimentos se
realizaron con 200 μg / ml de proteína en tampón
Tris-HCl 25 mM, pH 8,2, MgCl2 5 mM y DTT 2 mM.
Los experimentos de titulación se realizaron
añadiendo alícuotas pequeñas de soluciones madre
de ligando a la solución de enzima. Se restaron las
lecturas de fondo y se realizaron correcciones para
compensar la dilución de proteína. El análisis de los
datos se llevó a cabo con Grams / 386 (Galactic
Industries Corp, Main Street Salem, NH, EE. UU.). La
unión de saturación fraccional se determinó a partir
del cambio de intensidad con concentración de
ligando usando la fórmula: (F0 F) / (F0 F1), donde F0
y F1 representan la intensidad de emisión en
ausencia y en presencia de concentraciones
saturantes de li-gand , respectivamente, y F es la
intensidad después de la adición de una
concentración dada de ligando.
dimérico de Pfk-2, y que Cys-295 está involucrado en
la actividad catalítica de la enzima [12]. Para tener
una información más detallada sobre el papel de
estos resíduos en la estructura oligomérica y la
actividad catalítica de Pfk-2, se usó mutagénesis
dirigida al sitio para reemplazarlos por Ala o Phe. La
sustitución de Cys-Ala tenía por objeto evaluar la
importancia de la presencia de un grupo tiol en la
cadena lateral, mientras que la sustitución de Cys-
Phe se llevó a cabo para imitar el tamaño y las
características hidrofóbicas de las sondas químicas
de PM y EM. De acuerdo con los experimentos de
modificación química, los parámetros cinéticos de las
enzimas mutantes Cys-238 son similares a los
exhibidos por el tipo silvestre Pfk-2 (Tabla 1). Sin
embargo, los valores de kcat de los mutantes Cys-
295-Ala y Cys-295-Phe son 2 y 7 veces menores que
los de la enzima natural, respectivamente, mientras
que los valores Km para MgATP y fructosa-6-P son
aproximadamente entre 3 y 6 veces más alto que los
encontrados para la enzima de tipo salvaje. Estos
resultados muestran que, aunque Cys 295 no es
necesario para la actividad enzimática, como se
sugirió anteriormente, su sustitución afecta las
propiedades del sitio activo. La ubicación de Cys-295
cerca del sitio activo en el dominio principal del
modelo molecular de
tabla 1
Parámetros cinéticos de los mutantes Pfk-2 y Cys-238
y Cys-295 de tipo salvaje
Table 1
Kinetic parameters of wild type Pfk-2 and Cys-
238 and Cys-295 mutants

Cys- Cys-
3. Resultados y discusión Wild type 238 295
substitu substitute
ted d
by by
3.1. Caracterización estructural y cinética de las
enzimas mutantes Cys-238 y Cys-295 Ph
Ala e Ala Phe

kcat, s 1 90 70 70 39 13
Como se informó anteriormente, la modificación Km fructose-6-
química de Pfk-2 con PM y EM sugiere que Cys-238 P, lM 31 31 47 88 81
10
es importante para el mantenimiento del estado Km MgATP, lM 17 17 21 61 7
A. Caniuguir et al. / FEBS Letters 579 (2005) 2313-2318

Dimeric Pfk-2 [15] apoya esta observación. Los experimentos de cromatografía de exclusión
por tamaño demuestran que las enzimas mutantes Cys-295 y Cys-238 eluyen como dímeros en
ausencia de ligandos, mientras que en presencia de MgATP el tetrámero es la especie
dominante para ambos mutantes, mostrando el mismo comportamiento de la enzima de tipo
salvaje bajo las mismas condiciones (Fig. 1). Además, los espectros de dicroísmo circular de los
mutantes fueron idénticos a los de la enzima de tipo salvaje, lo que indica que no hay
alteraciones significativas en la estructura secundaria de la enzima debido a la sustitución de
los residuos (no se muestra).

3.2. El estado dimérico de Pfk-2 es crítico para la estabilidad y la actividad enzimática

Hemos demostrado previamente que la modificación de Cys-238 con PM produce una enzima
activa con un volumen de elución similar al esperado para la forma monomérica globular de
Pfk-2, lo que indica que la sonda química está de alguna manera afectando las interacciones de
los monómeros. Sin embargo, la enzima modificada con PM eluye como el dímero nativo en
presencia de fructosa-6-P y ATP 4, lo que indica que interrumpir las interacciones monómero-
monómero no previene la dimerización y no puede usarse para la evaluación de la actividad
catalítica del monómero . La monomerización observada tras la modificación química sugiere
que la sonda PM puede inducir un cambio conformacional que afecta a la interfaz del dímero.
Se ha descrito una situación análoga para la enzima luciferasa de Vibrio harveyi, donde las
mutaciones en la interfaz de la subunidad del dímero alteran la estabilidad de una región en
una de las subunidades que está distante de la interfaz [16]. Se pueden extraer ideas sobre la
relación entre la forma dimérica y la actividad catalítica a partir del modelo de homología de
Pfk-2 dimérico. En cada monómero, el dominio de hoja doble está involucrado en la formación
de ambas, la interfaz de la subunidad y la hendidura que contiene el sitio activo [15]. Por lo
tanto, la interrupción de la interfaz monómero-monómero debería afectar la estructura del
sitio activo, y por lo tanto, la actividad catalítica. Con el fin de explorar la relevancia de las
interacciones de subunidades para la estabilidad y actividad catalítica de Pfk-2, y para evaluar
la contribución de Cys-238 y Cys-295 a estas interacciones, usamos GdnHCl y experimentos de
dilución de proteínas para inducir el despliegue de proteínas. y disociación de subunidades.
Para cada condición utilizada, se evaluaron los cambios resultantes en la actividad catalítica y
la estructura oligomérica.

Fig. 2. Despliegue inducido

por GdnHCl de las enzimas mutantes Pfk-2, Cys-238-Phe y Cys-295-Phe de tipo salvaje. (A)
Cambios relativos de la actividad enzimática de Pfk-2 (d) y cambios asociados en la (s)
dispersión (es) de la luz como una función de la concentración de GdnHCl. (B) Efecto de las
mutaciones en Cys-238-Phe (s) y Cys-295-Phe () sobre la pérdida de actividad inducida por
GdnHCl. Tipo salvaje (d). Las muestras (90 μg / ml) se incubaron durante 48 horas a 20 LC a
diferentes concentraciones de GdnHCl.

Fig. 1. Efecto de MgATP sobre el estado de agregación de las enzimas mutantes Pfk-2, Cys-238-
Phe y Cys-295-Phe de tipo salvaje. La cromatografía de exclusión por tamaño se realizó en una
columna Bio Rad Bio Sil SEC-250 en ausencia de ligandos (línea continua) y en presencia de
MgATP 0,5 mM (línea discontinua). Las muestras de proteína se preincubaron en las mismas
condiciones. Los paneles A, B y C representan mutantes de tipo salvaje, Cys-238-Phe y Cys-295-
Phe, respectivamente. T y D denotan tetrámero y dímero, respectivamente

La actividad de las muestras de Pfk-2 incubadas a diferentes concentraciones de GdnHCl se

muestra en la Fig. 2A. El perfil de inactivación muestra una transición única en un rango de
concentración de GndHCl de 0.2-0.5 M, por encima del cual no se detectó actividad
enzimática. Dado que la pérdida de actividad podría deberse a la disociación de la subunidad
junto con el despliegue, se midió la intensidad de la dispersión de la luz en función de la
concentración de GdnHCl para observar la disociación del dímero Pfk-2 (Fig. 2A). Dado que la
intensidad de dispersión (I) es proporcional a ambos, el peso molecular (m) y la concentración
de partículas (C), una disminución en la intensidad dispersada (I Q mC) podría estar asociada a
la disociación del dímero siempre que el la concentración de proteína se ha mantenido
constante. La intensidad dispersa se correlacionó bien con la pérdida de actividad enzimática,
cayendo a menos de la mitad del valor inicial en el mismo rango de concentración de GdnHCl
donde se observó la pérdida de actividad. Dado que el despliegue procede del estado dimérico
nativo, una interfaz menos estable inducida por la mutación de residuos de Cys-238 o Cys-295
debería requerir concentraciones más bajas de GdnHCl para provocar el despliegue de las
enzimas mutantes. Los experimentos de desplegamiento de equilibrio muestran que no hay
diferencias significativas entre el tipo salvaje y el mutante Cys-238-Phe (o Cys-238-Ala, datos
no mostrados) (figura 2B). Sin embargo, en el caso del mutante Cys-295-Phe, la pérdida de
actividad se produce a concentraciones de GdnHCl ligeramente inferiores en comparación con
Pfk-2 de tipo salvaje (figura 2B).

La correlación entre el estado de agregación de Pfk-2 y la actividad enzimática sugiere que el

dímero es la única especie activa (figura 2A). Si esto es correcto, la disociación de la subunidad
inducida por la dilución de proteínas debería causar una disminución de la actividad
enzimática. Para evaluar esta hipótesis, se incubaron enzimas mutantes y de tipo salvaje a
diferentes concentraciones de proteína (de

30 lM a 30 nM) y la actividad específica se determinó usando una cantidad constante de 3

pmol de proteína en la mezcla de reacción. La Fig. 3 muestra que la actividad específica de Pfk-
2 de tipo salvaje tiende a cero a medida que disminuye la concentración de proteína. Esto
significa que la fracción de enzima activa disminuye con la dilución pro-teína probablemente
porque la proteína disociada no es activa. Se observó el mismo comportamiento para las
enzimas mutantes, ya sea que Cys-238 se reemplazó por Phe (figura 3) o Ala (datos no
mostrados), lo que indica que este residuo no está implicado en las interacciones monómero-
monómero. Dado que la actividad del mutante Cys-295-Phe es más sensible a la dilución y
menos estable al despliegue inducido de GdnHCl que la enzima de tipo salvaje (Fig. 2),
sugerimos que este residuo puede contribuir a las interacciones monoméricas en el Pfk-2
Dimer. Al considerar la ubicación de Cys-295 en el modelo molecular de Pfk dimérica

2 [15] estos resultados no son fáciles de explicar, a menos que se reclamen los efectos
estructurales de largo alcance causados por la mutación. Por otro lado, los resultados de los
estudios cinéticos y estructurales obtenidos con los mutantes Cys-238 son compatibles con el
modelo molecular de Pfk-2, que predice una ubicación para este residuo lejos del sitio activo y
de la interfaz monómero-monómero .

3.3. La inhibición inducida por MgATP de la actividad de la enzima está modulada por la
estabilidad de las interacciones dímero-dímero
Se ha demostrado que la inhibición de la actividad de Pfk-2 mediante la unión de MgATP a un
sitio alostérico es una característica reguladora importante para el metabolismo de
carbohidratos in vivo de E. coli en condiciones gluconeogénicas [17]. La modificación química
de Cys-295 sugiere un papel de este residuo en la unión de MgATP al sitio alostérico y también
en la formación de tetrámero inducido por MgATP. Sin embargo, su importancia para la
inhibición inducida por MgATP de la actividad de la enzima no pudo ser evaluada porque la
enzima modificada químicamente estaba inactiva.

Para determinar el efecto de las mutaciones de este residuo por Ala o Phe sobre la regulación
de la actividad de Pfk-2, estudiamos la inhibición inducida por MgATP de la actividad
enzimática a baja (0.1 mM) y alta (1 mM) de fructosa-6- Concentraciones de P La Fig. 4B
muestra que la enzima mutante Cys-295-Ala mostró el mismo comportamiento que la enzima
de tipo salvaje (Fig. 4A) y los mutantes Cys-238 (no mostrados), es decir, la inhibición de la
actividad enzimática a baja fructosa-6 -P y la reversión de esta inhibición a mayores
concentraciones de fructosa-6-P. Sin embargo, aunque el mutante Cys-295-Phe se inhibe a 0.1
mM de fructosa-6-P, la reversión de la inhibición requiere mayores concentraciones de
fructosa-6-P (> 5 mM) en comparación con la enzima de tipo salvaje. Dado que la inhibición
alostérica de Pfk-2 por MgATP se ha relacionado con la asociación de dímeros para formar
tetrámeros [10,11] la rever-sal de esta inhibición por altas concentraciones de fructosa-6-P
podría explicarse por la disociación de tetrámeros en dímeros activos debido a la unión del
azúcar-fosfato al sitio activo. El resultado observado con Cys-295-Phe podría

Fig. 3. Cambios relativos en la actividad específica

en función de la concentración de proteína. Se incubaron muestras de mutantes Pfk-2 (d), Cys-
238-Phe (s) y Cys-295-Phe () de tipo salvaje a diferentes concentraciones de proteína, entre
0,0003 y 1,0 μg / l, correspondientes a 30 nM y

30 lM, respectivamente, durante 3 horas a 20 LC en tampón Tris-HCl 25 mM, pH 8,2, MgCl2 5

mM y DTT 10 mM. Luego, la actividad de la enzima se midió usando 3 pmol de cada muestra.
Fig. 4. Inhibición de MgATP de los mutantes Pfk-2 y Cys-295-Ala y Cys-295-Phe de tipo salvaje a
diferentes concentraciones de fructosa-6-P. (A) Efecto de la concentración de MgATP sobre la
actividad de Pfk-2 de tipo salvaje a 0,1 mM de fructosa-6-P (d) y a 1 mM de fructosa-6-P (n). (B)
Efecto de la concentración de MgATP sobre la actividad de Cys-295-Ala a 0,1 mM de fructosa-
6-P (s) y 1 mM de fructosa-6-P (h) y efecto de la concentración de MgATP sobre la actividad de
Cys-295 -Phe a 0.1 mM de fructosa-6-P (), 1 mM de fructosa-6-P () y 5 mM de fructosa-6-P ().

surgen de las diferencias en la efectividad de esta enzima para la fructosa-6-P en comparación

con la enzima de tipo salvaje. Para probar esta hipótesis, medimos la unión de fructosa-6-P al
tipo salvaje y a las enzimas mutantes Cys-295-Phe usando mediciones de fluorescencia
intrínseca (figura 5). En cada caso, las curvas ajustadas corresponden a una función hiperbólica
con un valor medio de Kd de 20 lM para los mutantes Cys-295-Ala y Cys-295-Phe. Estos
valores, aunque son superiores a los obtenidos para la enzima de tipo salvaje [9], no pueden
explicar por qué solo el mutante Cys-295-Phe requiere concentraciones más altas de fruc-tose-
6-P para la reversión de la inhibición de MgATP de la enzima actividad.

Una segunda posibilidad es que la sustitución de Cys por Phe podría afectar la fuerza de las
interacciones dímero-dímero en el tetrámero. Esta alternativa se probó comparando la
estabilidad de los tetrámeros de tipo salvaje y Cys-295-Phe con el despliegue inducido por
GdnHCl en presencia de MgATP. La Fig. 6 muestra que el mutante Cys-295-Phe requiere una
mayor concentración del agente desnaturalizante (Cm1 / 2 0.63 M) para desplegar la proteína,
en comparación con las enzimas de tipo salvaje y Cys-295-Ala (Cm1 / 2 0.42 y 0.40 M,
respectivamente). Por lo tanto, existe una correlación entre el grado de inhibición de MgATP
de la actividad de la enzima y la estabilidad de las interacciones entre los dímeros en el
tetrámero. Debido a que el dímero Cys-295-Phe es menos estable que el dímero de tipo
salvaje, la mayor estabilidad de la forma tetramérica mutante podría estar asociada a un
efecto sobre la interfaz dímero-dímero.

Si el residuo Cys-295 está directamente involucrado en la interfaz dímero-dímero, su

reemplazo por un residuo hidrófobo voluminoso como Phe podría aumentar la estabilidad del
tetrámero disminuyendo la energía de desolvatación alrededor de la interfaz, en ausencia de
otro alcance largo efectos estructurales. Sin embargo, los factores que determinan el papel de
los residuos de aminoácidos específicos en la interfaz de la subunidad no son fáciles de
establecer. Inlow y Baldwin estudiaron el papel de la interfaz de la subunidad en la estabilidad
conformacional de una luciferasa bacteriana que recoge datos de experimentos de
desplegamiento en equilibrio para mutantes diferentes [16]. Aunque, por cierto, se espera que
la amplia superficie hidrofóbica en la interfaz confiera una estabilidad significativa, ninguno de
 Fig. 5. Unión de fructosa-6-P a mutantes Pfk-2 y
Cys-295 naturales. La unión de la fructosa-6-P a
las enzimas Pfk-2 (d), Cys-295-Ala (s) y Cys-295-
Phe () de tipo salvaje fue seguida por el
aumento de la fluorescencia intrínseca en
función del azúcar -concentración de fosfato.
La longitud de onda de excitación fue de 295
nm. Las líneas representan el ajuste de los
puntos experimentales a una ecuación de
hipérbola. Las concentraciones de fructosa-6-P
se muestran en una escala logarítmica para una
presentación clara de los datos.

Fig. 6. Despliegue inducido por GdnHCl de las

enzimas mutantes Pfk-2 y Cys-295 de tipo salvaje en presencia de MgATP. Las muestras de
proteína (90 μg / ml) equilibradas en MgATP 1 mM se diluyeron en tampón que contenía las
concentraciones de GdnHCl indicadas y la misma concentración de MgATP. Las muestras se
incubaron durante 48 ha 20 LC antes de las mediciones de actividad enzimática. Tipo silvestre
Pfk-2 (d), Cys-295-Ala (s) y Cys-295-Phe ().

los mutantes de la interfaz afectan a la disociación de la luciferasa dimérica en condiciones no

desnaturalizantes. Además, cuando se estudió un mutante de deleción de bucle que no afecta
las partes hidrófobas de la interfaz, se encontró que hay un gran efecto sobre el equilibrio de
la subunidad, demostrando así que la afinidad entre subunidades no se debe solo a
interacciones de subunidades. Además, cuando se realizó un reemplazo de Phe-Tyr en la
subunidad de interacción de la glutatión S-transferasa, se encontró que la masa molecular
promedio en peso era característica de un dímero. Sin embargo, cuando Phe se cambió a un
pequeño residuo como Ala, la masa molecular media ponderal se redujo y el equilibrio se
desplazó hacia el monómero [18]. El modelo tridimensional de la forma tetrámera de Pfk-2,
construido mediante el uso de modelos de homología combinados con la dispersión de rayos X
de la solución en presencia de MgATP [15], muestra que aunque Cys-295 no se encuentra en la
interfaz dímero-dímero , ocupa un lugar cercano por lo que podría modular las interacciones
dímero-dímero.

4. Conclusión

Los resultados presentados aquí muestran que el estado dimérico de Pfk-2 es crítico para la
estabilidad y la actividad de la enzima, como se demuestra por la correlación entre la
disociación enzimática y la actividad enzimática en desplegamiento inducido por GdnHCl y
experimentos de dilución de proteínas. Cys-238 no tiene un papel aparente en las
interacciones monómero-monómero, como lo muestran la actividad enzimática, la inhibición
alostérica, la estabilidad del dímero y los experimentos de estructura oligomérica usando los
mutantes Ala y Phe. Por otro lado, la mutación del residuo Cys-295 produjo una disminución
en el valor de kcat y un incremento en los valores de Km para ambos sustratos, más
marcadamente en el caso de la sustitución de Phe. Esto probablemente ocurre a través de un
cambio condicional que afecta el sitio activo en lugar de un cambio directo

participación de este aminoácido en el mecanismo catalítico. La participación de Cys-295 en las

interacciones dímero-dímero fue respaldada por el hecho de que se requieren mayores
concentraciones de fructosa-6-P para la reversión de la inhibición alostérica de MgATP de la
actividad enzimática y también por un aumento en la estabilidad del tetrámero en relación con
el tipo salvaje forma tetramérica de Pfk-2. Se están realizando estudios para obtener más
información sobre el papel de las interacciones de subunidades en la estabilidad
conformacional de la proteína Pfk-2.

El siguiente esquema resume el papel de los estados oligoméricos en la actividad y el

comportamiento alostérico de Pfk-2.

Inhibition and
tetramer Catalytic process
formation (K2)
(K1)
D-fructose-6- Ternary
T-MgATP D P complex
T=
tetram
MgAT fructose- MgAT er
P 6-P P D=
(allosteric (active (active dimer
site) site) site)
El lado izquierdo del esquema muestra la formación de tetrámeros (unión alostérico de MgATP
y asociación del dímero) controlada por K1. El lado derecho muestra el proceso catalítico
(unión de fruc-tose-6-P y formación de complejo ternario sobre la unión de MgATP) controlado
por K2. Por lo tanto, el equilibrio entre K1 y K2 determinará la modulación de la inhibición de
Pfk-2. Aquí postulamos que la mutación Cys-295-Phe produce cambios estructurales que
favorecen la inhibición alostérica al aumentar la estabilidad de tet-ramer.

Agradecimientos: Las mediciones de dispersión de la luz se realizaron en el Laboratorio de

Cristalografía, Instituto de Física de Saño Carlos, Universidad de Sao Paulo, Brasil. MEGABYTE.
es beneficiario de una beca de doctorado de Conicyt (Comisión Nacional de Investigaciones
Científicas y Tecnológicas, Chile). Este trabajo fue apoyado por una donación del Fondo
Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt 1010645).

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