Metodología

a) Preparación de la muestra de pigmentos:

Pesa 1 g de hojas de espinaca cortadas en piezas pequeñas y colócalas en un mortero con media cucharadita
de arena y 3 mL de metanol.

Muele con la mano del mortero hasta obtener una papilla, añade 6 mL de hexano y muele otra vez.

Con una pipeta Beral pasa el líquido a un embudo de separación chico, a través de un embudo de vidrio con
un pedacito de algodón del tamaño de un chícharo. Trata de dejar el sólido en el mortero.

Repite la molienda con otros 6 mL de hexano y reúnelos con el primer extracto en el embudo de separación.

Añade 10 mL de agua de la llave a la solución de hexano, tapa el embudo y agita. Deja separar las fases y
remueve la capa acuosa inferior, poniéndola en un vaso de precipitados.

Repite el lavado del hexano con una segunda porción de 10 mL de agua de la llave. Tapa, agita y deja separar
muy bien las fases.

Remueve nuevamente la capa inferior, elimina lo más posible toda el agua.

Reúne esta segunda fase acuosa con la primera, para posteriormente deséchelas al drenaje.

A partir de este momento, todo el material debe de estar bien seco. Lávalo sólo si es necesario. Para
secarlo, escurre bien el agua, enjuaga con una cantidad pequeña de acetona, que puedes usar para varias
piezas, escurre nuevamente y termina de secar la pieza con vacío.

Transfiere la solución de hexano a un matraz Erlenmeyer de 25 mL. Añade a este matraz suficiente sulfato de
sodio anhidro para que se aclare la turbidez del hexano y quede un poco de polvo fino Deja reposar por 5
minutos agitando de vez en cuando. Si no queda polvo fino de sulfato anhidro, añade un poco más del sufato
y deja reposar otros 5 min.

Con una pipeta Pasteur pasa la solución colorida a otro matraz Erlenmeyer de 25 mL. Enjuaga el sulfato de

sodio con porciones de 0.2-0.3 mL de hexano. y con la pipeta reúnelas al matraz con la solución de los
pigmentos.

Marca el matraz con tu número de equipo, ponle unas tres piedras de ebullición y evapora la solución, en una
parrilla en la campana, a un volumen aproximado de 2-3 mL. Ten cuidado de no evaporar todo el solvente
para evitar la descomposición de los pigmentos.

b) Preparación de la columna de cromatografía:

Prepara la columna en una columna pequeña con llave. Si no dispones de estas columnas, puedes usar una
pipeta Pasteur corta, adáptale en la punta un tubo capilar de plástico obtenido de una pipeta Beral; esto te
permite tener un tamaño de gota muy pequeño y también, si es necesario, detener el flujo de la columna. En la
parte superior de la pipeta enrolla una liga, para poder sostener la pipeta con una pinza, sin que se resbale.

Con la ayuda de un alambre de cobre, coloca un pedacito de algodón, que no debe estar apretado, en la parte
donde la columna se angosta. Cubre el algodón con una capa de arena de 3-4 mm de altura. Golpea
ligeramente la columna para que la superficie de la arena esté bien horizontal.
Añade en seco el adsorbente para cromatografía a la columna, de preferencia sílica gel (también puede ser
alúmina pero no es tan conveniente). Deja caer el adsorbente dentro de la columna como un chorro muy fino.
La altura del adsorbente en la columna debe ser de unos 10-12 cm (si es un pipeta de 6 a 8 cm) dejando
espacio adicional en la columna para permitir que haya suficiente solvente arriba del adsorbente. Golpea muy
ligeramente la columna, para que el adsorbente quede uniforme y su superficie horizontal. Evita golpearla
mucho para que no se compacte demasiado.

Arriba del adsorbente coloca una pequeña capa de arena, de 3 a 4 mm de altura.

Sujeta con una pinza la columna ya preparada en un soporte, a una altura adecuada para que puedas recoger
las fracciones en tubos de ensaye sostenidos en una gradilla o un vaso y cambiar estos tubos con facilidad.

c) Cromatografía:

Numera consecutivamente 15 tubos de ensaye de 100 x 8 mm, marcándolos con “masking tape”. Acomódalos
en una gradilla.

Con una pipeta Pasteur añade a la columna de cromatografía parte del extracto en hexano de los pigmentos de
espinaca. Como la cantidad de adsorbente en la columna es pequeña, añade sólo una pipeta del extracto.

La muestra debe adsorberse en una zona de la columna lo más angosta posible, ya que las bandas se vuelven
más difusas a medida que la columna se desarrolla.

Al llevar a cabo una cromatografía es importante mantener siempre el nivel de solvente arriba de la columna
de adsorbente.

Con una pipeta Beral o Pasteur, enjuaga la parte superior de la columna con cantidades muy pequeñas de
hexano hasta que todo el pigmento haya entrado en la columna.

Continúa añadiendo porciones de 2-3 mL del hexano y anota todos los cambios en la apariencia de la
columna.

Conforme las bandas empiezan a bajar y a separarse en la columna, recolecta las fracciones de los pigmentos
separados en los tubos de ensaye numerados.

Cambia de tubo cuando esté lleno hasta dos terceras partes o antes, si notas un cambio de coloración en el
eluyente.

Mientras el movimiento de los pigmentos ocurra a una velocidad apreciable, continúa añadiendo porciones
del mismo solvente, no importa cual sea el volumen utilizado ni cuantos tubos se llenen con el mismo
eluyente.

Si ya no hay movimiento de los pigmentos, empieza a usar como eluyente el solvente puro o la mezcla de la
siguiente polaridad y continúa con el mismo solvente hasta que nuevamente ya no haya cambios.

Continúa eluyendo los pigmentos con solventes y mezclas de solventes de polaridad creciente. El orden de
solventes que debe seguirse, para esta práctica es el siguiente:

Hexano,
Hexano con 10% de cloruro de metileno, Cloruro de metileno puro,
Cloruro de metileno con 10% de acetato de etilo, acetato de etilo puro,
acetato de etilo con 10% de metanol,
metanol puro.
Número de la Color e intensidad del Volumen aproximado Clase y número del compuesto separado
Solvente
fracción color de la fracción de la fracción (clorofila 1, 2... o caroteno 1, 2...)

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MATERIALES
Tijeras
2 vasos
1 vaso de precipitado de 150ml
1 probeta de 100ml
2 botes
1 embudo de separación
1 matraz de fondo redondo
1 pipeta de 1ml 5ml y 10ml
1 pipeta Pasteur
papel filtro
1 mechero
1 tripe con tela de asbesto
1 columna cromatografía (2x20cm)
1 lana de vidrio
1 embudo de filtración
1 hielo
mortero