LABORATORIO! MRICROSCOPIA (primera parte) INTRODUCCION El microscapio es un instrumento dptico que produce una imagen aumentada de los objetos. En los Uitimos tres sigios ha permitido ampliar el campo de las investigaciones biolégicas y se ha convertido en el instrumento basico para establecer nuevas fronteras en la biclogia. La lupa es el microscopio mas simple y fue utiizada inicialmente por algunos investigadores para adquirr los primeros conosimientos det mundo microscbpico; posteriormente se perfeccioné y en ia actualidad hay varios tipos de microscopios, algunos de ellos altamente especificos, para una gran variedad de usos, tales como: microscopio simple, compuesto (invertido, de fluorescencia, de luz ultravioleta, de luz polarizada, de contraste de fase, de campo oscuro) y electrénico (de transmision y de barrido) En las practicas de este curso se utlizaran microscopios compuestes binoculares, en los que se combinan dos sistemas de lentes (el ocular y el objetivo) para obtener las imagenes. A, OBJETIVOS Con esta practica se pretende que el estudiante 1. Conozca las diferentes partes del microscopio compuesto binocular y sus respectivas funciones. 2. Aprenda a manejar correctamente el microscopio compuesto binocular. 3. Aprenda a preparar muestras en fresco. MATERIALES Microscopios compuestos binoculares Portaobjetos Cubreobjetos (laminillas) Goteros Beakers o frascos pequefios con agua Toallas de papel absorbente Hilos de color Flores de besito (Impatiens baisamina) Flores de lirio (Hemerocatis sp.) Hojes de guardaparques (Setcreasea purpurea) Cabellos Papel delgado con letras impresas por un solo lado Tieras Tela suave para limpiar el microscopioC, PROCEDIMIENTO 1. Las partes de! microscopio compuesto binocular y sus funciones a. Diagrama (figura 1) Anillo de ajuste de dioptrios Revolver Objetivo Platina Polanco del diofragma Condensador de aberturo Condensador de campo (3-7 Imerruptor + Carro we Qt revit reguladora | devottaje | — Perillo del carro [—Perilla macrométrica Perilla micrometrica Figura 1: Partes del microscopio compuesto binocularb. Descripcion y funciones La mayoria de los microscopios compuestos tienen los mismos componentes bésicos. Sin embargo, la disposicién de muchos de esos componentes varia segun el modelo yla maita, mientras que otras piezas son opcionales. En nuestro caso, nos referiremos al modelo que aparece en la figura 1, que es un Olympus CH30. Base: parte inferior del microscopio, que hace contacto con la mesa. ES su punto de apoyo. Columna: estructura rigida ubicada en la Sus diferentes partes, En su lat bombilio y, debajo de éste, una Para prolongar la vida util del este sistema (reéstato). Parte posterior de! microscopio, que sostiene ido derecho hay un inierruptor para prender y apagar el Perila reguladora dei voitaje, con una escala entre 1 y 5 bombillo, se recomienda no pasar de! punto 4 el voltaje de Porilla macrométrica: esté en la parte lateral inferior, tanto derecha como izquierda, de 'a columna y se utliza para acercar fa piatina al objetivo y para alejarla. Por media de estos movimientos se obtiene una imagen poco nitida de ia muestra, o sea el “enfoque grueso’ Perllla micrométrica: esta unida a la macrométrica, en la parte externa de ésta. Sirve para obtener el “enfoque fino’ 0 nitido de la imagen mediante movimientos suaves de acercamiento 0 alejamiento de la piatina. Palanca de freno del onfoque grueso: esta ubicada hacia el interior, en la parte lzquierda del sistema de perilas macrométrica y micrométrica. Cuando fa palanca se Mueve hacia abajo, la perilla macrométrica puede subir la platina tinicamente hasta un Punto determinado (preenfoque), y el enfoque se hace entonces utlizando s6io la perila (Atencién: El punto de preenfoque esta previamente calibrado por el profesor. Por tanto, no se debe liberar la palanca correspondiente.) Platina: lémina cuadrada, con un orificio central, en donde se coloca la muestra que se va a observar. i Carro: sistema de pinzas ubicado encima de la platina, que sirve para desplazar la muestra en el ele X (0 sea, izquierda-derecha) y en el eje Y (0 sea, adelante-atras), mediante las perilias que para tal efecto posee éste. Diafragma (iris): estructura con apariencia laminar que se emplea para regular ef cono de luz que pasa a través del condensador de abertura y lega a la muestra. El numero en Condensadores: hay dos. uno de ellos, el de abertura, esta debajo de la platina y es un sistema de lentes convergentes cuya funcién es concentrar los rayos de luz en el centro de la platina. Por tanto, sirve para enfocarlos hacia la muestra que se va a examinar. E} otro es el de campo, que esta en la base del microscopio y se utiliza para concentrar la luz que viene de la fuente y pare dirigirla hacia el condensador de aberturaPerilla de ta cremallera del condensador de abertura: se utiliza para acercar el condensador de abertura a la muestra, o para alejario de ella. De esta manera se enfoca el condensador, es decir, se hace converger el cono de luz en el plano de la muestra que se esta observando, Esta localizado a Ia izquierda y hacia atras de este condensador debajo de Ia platina, Revélver: sistema gitatorio en el que estén incorporados los objetivos. Objetivos: son sistemas de lentes que producen imagenes de la muestra, aumentadas 4, 10, 40 y 100 veces segtin se indique en los mismos. Al mover en forma circular ef revélver, se puede poner cualquier objetivo en posicion perpendicular a la platina, Al hacerlo, se nota un tope indicativo de la posicién correcta de la lente. Normalmente, los objetivos tienen informacién inscrita sobre diversas caracteristicas propias de cada uno de ellos. En los que usted esta utlizando, se tienen las siguientes (figura 2) Aumento Abertura numérica Grosor del cubreobjeto Longitud mecdnico del tubo Figura 2: Objetives A40 y A100 E- es la referencia de fAbrica que identifica a estos objetivos en particutar. A: significa que estos objetivos son acrométtcos, es decir, que vienen corregidos para ‘eras longitudes de onda (de les colores verde y rojo en este caso), con el fin de que corcidan en el mismo plano y que, de este modo, la imagen obtenida tenga mejor definic'Sn. Algunas lentes, de tos microscopios, vienen corregidas para mas de dos longitudes de onda.Abertura numérica (AN): es la capacidad que tiene el objetivo para recibir el cono de luz que pasa a través de la muestra, procedente de la fuente de luz. La abertura numérica @s directamente proporcional al Indice de reftaccién del medio en que se propaga la luz (aire, agua, vidrio, aceite de inmersién), pues mientras mayor sea el indice de refraccién, ‘mayor sera el cono de luz, lo cual origina un mayor poder de resolucion (aspecto que se explicara en la segunda practica de laboratorio) Longitud mecénica del tubo: es la distancia que hay entre la parte inferior del objetivo y los oculares Estd indicada en los objetivos y generaimente tiene un valor de 160 milimetios. Observe cémo al lado de este nimero, separados por una linea oblicua, aparecen un guién o fa cia 0.17. El quidn indica que esas lentes pueden usarse para observar muestras sin que sea estrictamente necesario utilizar cubreobjeto; y la cif 0.17, que s6lo esté en la lente A40, indica que es necesario utilizar un cubreobjeto oat) -C AF milimetros de espesor. Aumento: cada objetivo tiene un niimero especifico (4, 10, 40, 100) que indica cuantas veces se aumenta la imagen del objeto observado. En microscopia se utiliza la letra X para indicar "veces" y por eso se acostumbra, al referirse a un aumento particuiar, escribir 0 decir 4X, 10X, ete. Oculares: son sistemas de lentes cuya funcion es aumentar la imagen procedente del objetivo tantas veces como indique el nimero escrito en ellos, 10 en este caso. Los dos oculares pueden moverse hacia los lados y hacia el centro, de manera que se ajusten a la distancia interpupilar de quien esté utilizando el microscopic. Algunos microscopios poseen una sola lente ocular, y por eso se les llama monoculares. De igual manera que en los objetivos, en fos oculares también hay algunas indicaciones, En los microscopios de este laboratorio, por ejemplo, ambos oculares tienen inscrito lo siguiente: 10X/18L. La cifra de la izquierda (10X) indica el nimero de veces. que cada ocular aumenta la imagen procedente del objetivo; y la de la derecha (16L) es @! llamado nlimero de campo, que sirve para calcular e! tamatio del didmetro del campo visual, de acuerdo con el objetivo que se esté utilizando, tema que también se tratara en la segunda practica de laboratorio. Este niimero de campo puede variar segtin el microscopio de que se trate y normalmente estd entre 12 y 36. Anillo de dioptrias: en este microscopio esta en el ocular ‘zquierdo y sirve para ajustarla vision binocular, como se explicaré mas tarde. Fuente de luz: proporciona ia iluminacién necesaria para la observacién de la muestra. Algunes microscopios no tienen incorporada la fuente de luz y se valen de un espejo para Teflejar la que proviene de un bombil o de una lampara.2, Cuidados que se deben tener con el microscopio, a. Cuando transporte el microscopic céjalo siempre con las dos manos, como se indica en la figura 3, Figura 3: Manera correcta de transportar el microscopio b. Alponer el microscopio sobre la mesa, situelo a unos 10 centimetros de la orilla, . Para girar el revélver, utiice la rosca estriada de su parte superior. No lo haga tirando los objetivos hacia la izquierda o hacia la derecha, pues de esta manera se van desajustando los sistemas de lentes y la propiedad parafocal, que es la propiedad de mantener una muestra mas 0 menos enfocada y en el mismo campo focal al pasar de un objetivo a otro. . Alterminar la préctica de laboratorio, siga estas instrucciones: 1), Retire la placa, o preparacién, de la piatina 2), Ponga en el punto cero la perilla reguladcre $e! votmje y proceda a apagar el Interruptor (posicion “O'). Desconecte del toracormenses el cable de la luz y deje entriar el bombiio antes de mover el microscop.c. 3). Limpie muy bien todas las partes de! microscope, excepto las lentes. Estas slo deben limpiarse cuando han estado en contacto con aceite de inmersion, en la forma en que se explicard en la préxima préctica de ‘aboratorio. 4), Baje hasta el maximo la platina y defe & oogetive de aumento menor en posicion de enfogue. 5). Deje centrado el carro. 68). Cubra el microscopio con la bolsa z.asaca o de tela dispuesta para ello 7), Deje el microscopio encime de la “esa para que el monitor lo revise y lo guarde en su sito.3. Preparacién de una muestra en fresco (placa himeda) Lave el portaobjeto con jabén y abundante agua, secandolo preferiblemente con un pedazo de tela que no deje residuos encima del vidrio. Con un gotero eche una gota de agua en el centro del portaobjeto y después ponga en ella un pedazo de hilo de color de un centimetto Ge largo aproximadamente. Apoye luego el cubreobjeto en un angulo de 45 grados con relacién al portaobjeto y sosténgalo con un lapiz. de modo que haga contacto con el agua, Como se muestra en fa figura 4. Por titimo, déjelo caer lentamente. De esta manera se evita 'a formacién de burbujas que podrian difcultar le observacién. Si queda agua por fuera del Cubreobjeto, séquela con papel absorbente, Igualmente, seque el portaobjeto si éste queda ‘mojado por debajo, ya que la humedad lo pega a la plating y le impide desplazarse cuando el carro se mueve, (Nota: No siempre las muestras en fresco se preparan con agua. En algunos casos es ‘necesario utilizar otras sustancias, o soluciones adecuadas, segtin el tipo de material que se quiera observar.) na : j one, ae 7 b = Figura 4: Preparacién de una muestra ec “esco 4, Observacién de una muestra De la forma como usted utilice el microscopio depende el éxito motivo se recomienda seguir siempre el procedimiento que a ce’ us observaciones. Por tal -sacién se explica’ . Colocacién de la muestra Ponga sobre la platina la placa de hilo que acaba de hacer , ‘jela e ella utilizando las pirzas que para el efecto tiene el microscopic. Centre la muestra en el orificio de la ‘iatina con las perilias del carro. 2b, Muminacién de! campo visual Ponga en posicién de observacién el objetivo de 4X y abra lentamente el diafragma haciendo coincidir la abertura numérica del objetivo, que para el caso de 4X es 0.10, con el mismo valor (0.10) en la escala de abertura del diafragma. Suba hasta el tope la latina, sin forzar el sistema, con la perilla mactométrica, y luego, mirando por los culares, obtenga una iluminacion homogénea del campo visual con la perilla reguladora del voltaje. ©. Obtencién de la imagen Mirando por los oculares, aleje Ientamente Ia platina con la perila macrométrica hasta que aparezca la imagen. Si en este momento lo considera necesario, mejore la ilurinacién con la perila reguladora del voltaje y con la del condensador de abertura Moviendo los oculares, ajuste la vision a su distancia interpupltar. igualmente, ajuste la vision binocular con el anillo de dioptrias, de la siguiente manera: mire con el ojo derecho or el ocuiar respectivo (derecho), manteniendo cubierto el ccular izquierdo con una hoja ‘de papel 0 con algo similar, y enfoque con la perilla micrométrica lo mejor posible, Ahora procede a ajustar el izquierdo asi: cubra el ocular derecho, mire con el ojo izquierdo por e! respectivo ocular y enfoque con el anillo de dioptrias. Haga un esquema de lo observado, enmarcandolo con un circulo ¢ indicando a un lado el aumento con el que trabajé. Siempre que dibuje un objeto que esté viendo con un microscopio, cumpia esta instruccién. Ademds, indique con fechas y nombres las estructuras que pueda distinguir en &1 4, Uso de objetivos de aumento mayor Una preparacion siempre se observa primero con ¢' cbietiwo de aumento menor, 4X en este caso, para obtener un buen enfogue. La pare que se desea observar con objetivos de aumento mayor debe centrarse en el camoc vs.ai * Observacién con los objetivos de 10X y de 40X Siempre que vaya a cambiar de objet: apssie la fuminacién con la escala de abertura del diafragma, tal como se explicé ares Si es necesario, utiice también la perila reguiadora del volta. Gire lentamente el revolver por mace ae ma rosca estriada de su parte superior, con el fin de poner el objetivo de 10X 2 @ posicén adecuada, sin mirar por los oculares. A continuacién mire por ellos y. s © “equiere, déle nitidez a la imagen con ia perila micrométrica, Haga un esquema 2e ic observado y repita el procedimiento, pero utiizando el objetivo de 40X. C2—care estas imagenes entre si. Qué relacién encuentra entre sus tamafios? ZA qué se ssoer esas diferencias? 2 Haga lo mismo, es decir. 2~ica con 4X, 10X y 40X, y dibujar lo observado, con otros materiales que le suministre s. pre‘esor. cabellos, granos de polen, epidermis superior 0 inferior de hojas de guadepavsues. etc8. Caracteristicas de la imagen a. Como se ve la imagen Haga una preparacién en fresco de una letra asimétrica (No utilice las letras 0, x, s, ni las mayusculas |, H, N y Z). Péngala en fa piatina en. posicién normal de lectura y enfoque con el objetivo de 4X. Haga el esquema correspondiente, Cémo se ve la imagen con relaci6n a la posicién de la letra en el portaobjeto? @ Enfoque esa misma letra con el objetivo de 10X y dibijela. Qué proporcién ‘aproximada de ella puede ver con relacién a la obtenida con el objetivo de 4X? b. Cémo es el desplazamiento de la imagen Empleando la misma preparacién anterior en 10X, desplace el carro hacia la derecha, sin dejar de mirar por los oculares. LEn qué direccién se mueve la imagen? Desplécelo luego hacia la izquierda y fijese de nuevo en la direccién en que se mueve la imagen we Tome ahora la otra perilla del carro y muévalo hacia adelante y hacia atras. Al hacer cada uno de estos movimientos, Len qué direccién se desplaza la imagen? eLABORATORIO It MICROSCOPin (segunda parte) INTRODUCCION El microscopio, ademas de producir imagenes aumentadas de los objetos y mostrar que muchas veces algunas estructuras observables a simple vista son diferentes a como las vemos, sive, entie otras cosas, para hacer mediciones y para realizar estudios morfologicos y fisioldgicos de oéiulas y tejidos. A. OBJETIVOS Con esta practica se pretende que el estudiante: 1. Entienda algunos conceptos basicos de microscopla tales como poder de resolucion, poder de aumento y campo visual. 2, Conozea las unidades de medida de mayor uso en micrometria y las utlice para resolver algunos problemas comunes en este campo. 3, Adquiera destreza para hacer mediciones aproximadas de células y estructuras. 4, Aprenda a utilizar el objetivo de inmersién. B, MATERIALES Microscopios compuestos binoculares. Portaobjetos Cubreobjetos (laminillas) Goteros Beakers 0 frascos pequefios con agua Toallas de papel absorbente Papel delgado con letras impresas Aceite de inmersion Placas permanentes (de sangre, de microorganismos, etc.) Papel para limpiar lentes (Kleenex faciel blanco) Tela suave para limpiar el microscopio 1¢. PROCEDIMIENTO 4. Anal is de algunos conceptos bésicos de microscopia a. Poder de resolucién Es la capacidad que posee un instrumento éptico para diferenciar dos puntos que a simple vista parecen uno solo debido a la pequefa distancia que hay entre ellos. Es caracteristico de cada instrumento éptico y depende en gran parte de la luz y de las lentes utilzadas, Es asi como los paderes de resolucion maximos aproximados son: el del ojo humano, en condiciones ideales y a 25 centimetros (que es la distancia de lectura de un ojo humano normal, con buena ilurninacién), setenta y dos micrometros (72 jim). & del microscopic compuesto, dos décimas de micrémetro (0.2 um), y el del microscopio electronico, una milésima de micrémetto (0.001 ym). Lo anterior significa que para que el ojo humano pueda diferenciar claramente dos puntos, éstos deben estar separados entre si por una distancia igual, mayor, a 72 micrémetros. ¢Podria usted, por tanto, ver separados con el microscopio compuesto dos puntos que estén a 10 micrémetros entre Si? gY dos puntos que estan a 0.02 micrémetros? El poder de resolucion se calcula por medio de la formula R =2/2AN, en la que 2 es la longitud de onda de la luz con la cual se observa (que va de 400 a 700 nanémetros, o sea el rango de longitudes de onde de ia luz visible, y depende del fitro que se utilice en cada ‘observacion) y AN es la bertura numérica qué, como se dijo antes, es especifica para cada objetivo. Como puede deducirse, 2 es la misma para cada objetivo, a menos que con algunos de ellos se utilicen filros y con otros no. Ast por ejemplo, si la longitud de onda de la luz que usted esta utiizando es aproximadamente 640 nandmetros, los poderes de resolucion de los cuatro objetivos de su microscopio seran los siguientes (haga los célculos respectivos y llene el cuzdro que aparece a continuacién): Objetivos Poderes de resoiucion ax 40x “40x Yoox Para entender en forma practica lo que es el poder de resolucién, tome un papel delgado con letras impresas, haga un montaje en fresco y enfoque cualquier letra en 4X, ‘en 10X y en 40X. {Cémo puede relacionar los valores numéricos de los poderes de resolucion obtenidos para cada objetivo y las observaciones de las letras que acaba de hacer en 4X, 10X y 40X? {Como explica lo anterior? Guarde la preparacion, pues va a servirle para analizar el siguiente concepto. 12. Poder de aumento Es la capacidad que posee un instrumento éptico para producir una imagen aumentada de un objeto. Si, por ejemplo, un objeto mide un milimetro y una lente produce una imagen de 19 milimetros, se dice que el aumento es de 10 veces, es decir, que su poder de aumento es 10. Note que el poder de aumento es a relacién entre lo que mide la imagen y lo que mide el objeto. El poder de aumento depende, entre otros factores, de la forma en que se combinen las lentes, ya que una imagen, a su vez, también puede ser aumentada por una lente. Si en el caso anterior la imagen de 10 milimetros obtenida se observa por medio de otra lente y se produce una nueva de 50 milimetros, esta segunda seré cinco veces mayor que la primera, 0 $0 veces mayor que el objeto. Se puede deducir, por tanto, que el aumento total producido por las dos lentes es igual al aumento producido por la primera multiplicado por el aumento preducido por la segunda. En este ejemplo, el aumento total (A) es 10 x5, 0 sea 50 veces. EI microscopio que usted utiliza consta, como se dijo en la practica anterior, de dos sistemas de lentes, ocular y objetivo, cada uno de ellos con su respective poder de aumento, Esto significa que cuando se observa un objeto con ese microscopio, su ‘aumento total es el resultado de multiplicar el aumento del ocular (A,.) por el aumento de! objetivo (A..) A= AyXA, Por ejemplo Poder de aumento Poder de aumento “Aumento total Del objetivo | iO aX 40x 00x i *7000x . Campo visual Es el area circular que se observa al mirar por los oculares. Esta area varia segin las lentes utiizadas, Enfoque de nuevo la placa con letras impresas. Con cual de los tres objetivos (4X, 40X y 40X) ve un area mas grande de una de esas letras? {Con cual hay mayor poder de resolucion? + Dimetro (a) del campo visual Los diémetros de los campos.visuales de un microscopio se calculan dividiendo el valor del numero de campo por el aumento de! objetivo que se esté utilizando, es decir, d = ‘18U/A,,, relacion que viene dada en milimetros. Con esta relacion, calcul los diémetros, y las Areas respectivas, de los campos visuales para los diferentes objetivos de su mieroscopio. igualmente, la altura y el ancho aproximados de una de las letras que observs. 13,f Objetivo ——|_—_‘idmetro (en mm) Area (en mm) 4x : 70x = 40X I 00x Segun los resultados que acaba de obtener, {qué relacién hay entre los poderes de ‘aumento del microscapio compuesto’ y los valores de los diametros de los campos visuales? LY entre los poderes de aumento y las areas de los campos visuales? ,Esta de acuerdo esto con las observaciones que acaba de hacer al mirar las letras en 4X, 10X y 40x? 2. Unidades utilizadas en mediciones microscépicas La mayoria de los organismos o de las estructuras que se estudian a! microscopio tienen tamafios muy pequefios, Por tanto, para medirlos es necesario utilizar unidades como el angstrom (A°), el nanémetro (nm), el micrémetro (um)* y, en algunos casos, el milimetro (mmm). * Las relaciones que hay entre ellas, son: 1mm 1m nm = 104° Teniendo en cuenta los datos anteriores, resuelva los ejercicios siguientes: @. JA cuantos nanémetros equivale un milmetro? z¥ a cuantos nanometros equivale un ngstrom? b. Una célula tiene un diametro de 1.2 micrometros. ,Cuanto mediré ese didmetro en angstroms? zY en milimetros? ©. Siun mieroorganismo A tiene 120 micrémetros de largo y un microorganismo B tiene 1200 ngstroms, {cual de los dos tiene mayor longitud? Mire ahora los esquemas que hizo en la practica pasada y trate de calcular en forma aproximada las siguientes medidas: el groscr de un cabelio y el largo y el ancho de un grano de polen de besito o de tri. + Lami fs una medida de longitu equivalent 6 la rilésima parte del miimetro, Se abrevia con Ja llra gfiege py en el sistema intemacional de medias cortesponde a! mictémetro, Per su parte, al nanémetro se le denomina milimicra en algunos textos, y al éngstom se le conoce también con ef rombre de angstramo, Es conveniente acter. igualmente, que cn el tirmina mlarématio s@ conace el insrurnonto, aparate o artifice éptice y macdnico destinado @ medi caniidades lineales 0 angulares muy pequefis. 143. Observacién con el objetivo de inmersion Para esta observacion empiee las placas permanentes que le entregara su profesor y proceda de la siguiente manera: Enfoque en 4X, en 10X y en 40X, Después de obtener la imagen en 40X, gire el revélver ‘hacia la izquierda, ponga una gota de aceite de inmersion encima de la muestra que va a observar y complete el giro del revolver hasta que el objetivo de 100X, u objetivo de inmersion, esté en posicién correcta. Usted vera que la lente hace contacto con fa gota de aceite. Mire por los oculares y déle nitidez a la imagen por medio de la perilla micrométrica* Esquematice lo observado. {Qué funcién cumple el aceite de inmersién? JPor qué no utilize para este enfoque alguna de las preparaciones en fresco que hizo? (Nota: Cada vez que utlice aceite de inmersién y no necesite observar nada mas con él limpie el objetivo absorbiendo el aceite con papel "Kieenex’ blanco, sin frotario, y séquelo inmediatamente con otro pedazo de papel de la misma calidad; de esia manera se evita que 1 polvo que haya caido alli, deteriore las lentes). D. PREGUNTAS 4. Convierta: a, 0.0025 mm en um'y en AY b, 5x10%nm en mmy en AP ¢. 1300 A° en nm, en um y en mm 2. Escriba, de mayor a menor, los poderes de resolucién maximos aproximados del microscopio ‘compuesto, del microscopio electrénico y del ojo human. 3. ECudntas veces es mayor el poder de resolucién maximo de! microscopio compuesio. ‘comparado con el del ojo humano? “ E! procedimiento anterior se hace con fines practicos, para adaptario a las necesidades de este curso introductorio de ‘microscapta. Pero el procecimiento tgenicamento mas indicado es el siguiente: Después de oblener Ia Imagen en 40X, 22 ra el revélver hacia la iquierds, se desplaza el carto hacia atrés y se pone una gota de aceite de inmersién encima del Ccondensador de abertura. Luego se desplaza el carto hacie adelante y so sube el condensador hasta que el aceite se ponga en contacto con el portacbjeto, Posterionmente se baja el condensador dos milimetros aproximadamente, que es ras 0 menes la gistancia nacesaria pars que quede enfocado. Después ¢e pone una gota de aceite de Inmersién encima de la muestra que se va a observar, se completa el giro det revolver hasta que et objetvo de 100K este en posicion correcta, se mira por los oculares y sole da nitidez 2 la imagen por medio de le perila micromeéttica 15,4, Determine, segiin los poderes de resolucion maximos aproximados del ojo humano, del microscopio compuesto y del microscopio electrénico, con cua! 0 con cuales de éstos se pueden ver las siguientes estructuras: Estructuras Promedios de medidas Virus del polio 300 A de diametro Virus de la viruela 2500 AS de diametro Ribosomas de eucariotas 140 a 180 A° de diémetro Escherichia coli 20000 A” de largo Mitocondrias 0.2.25 um de largo Cloroplastos 5.8 umde diémetro Globulos rojos de mamiferos 7.5 wm de diémetro Paramecium caudatum 0.1.0.3 mmde largo ‘Ovulo humano 0.15 mm de diémetro 5. Suponga que usted mira un microorganismo con el objetivo de 10X de su microscopio. zCuantas veces mas (0 menos) se veria aumentado (o disminuido) ese microorganismo si lo mira con el objetivo de 40x? 8. Se tienen dos microorganismos A y B que miden de largo 60 y 100 micrometros, respectivamente, {Cual de los dos se vera aumentado mayor niimero de veces si se observan con el objetivo de 10X de su microscopio? 7. Al observar una célula en su microscopio con el objetivo de 10X se pudo determinar que tenia un diémetro aproximado de 0.5 milimetros. {Cual sera su didmetro si se observa con el objetivo de 40x? 8. Un estudiante observé en esta préctica de laboratorio una célula con el objetivo de 10X y determiné que su diametro media una cuarta parte del diametro de ese campo visual. a. ECuanto mide la célula? b. (Se observara completamente esa célula si se utliza el objetivo de 40x? 9. Al observar en su microscopio un microorganismo determinado, con el objetivo de 100X, un estudiante vio que ocupaba, a lo largo, dos veces e! diémetro del campo visual. 4Cuanto mide de largo ese microorganismo? 10. Un microorganismo mide 300 micrémetros de diémetro. {Cuantos de ellos se podrlan alinear en el diametro de cada uno de jos campos Visuales de su microscopic? a 4X b 10x. c 40x d. 100x lH 11. Consuite los principios fisicos correspondientes a la formacién de imagenes en el micrascapio ‘compuesto. Esquematice todo el proceso hasta la obtencién de la imagen. {Por qué una letra puesta en posicion normal de lectura se observa invertida con el microscopic? 16LABORATORIO Hil ‘CELULAS ANIMALES ¥ VEGETALES INTRODUCCION La célula es un microcosmos, con limites definidos, dentro de los cuales se desarrolla Continuamente una gran actividad quimica: constituye esencialmente un sistema complejo, ‘organizado, dinamico y autodirigida de moléculas y agregados moleculares, que toman y emplean energia del medio que los rodea para utiizarla en fendmenos de sintesis, crecimiento y reproduccion, La citologia estudia las diferentes clases de células para comprender su organizacién y su estructura en términos de su actividad y sus funciones, y ver la célula no solo como una entidad individuai, sino también como parte integrante de los érganos y sistemas de Organos mas complejos de las plantas y de los animales pluricelulares, pues el crecimiento, el desarrollo, la herencia, la evolucién, €l envejecimiento y la muerte no son mas que diversos aspectos de la actividad celular. En 1665 Robert Hook observé por primera vez las células en un corte de corcho y fue él mismo quien tes dio esta denominacién, Posteriormente, en 1838, Matthias Schieiden y Theodor Schwann enunciaron la Teoria Celular, basada en el concepto de que la célula es la unidad basica de los seres vivos, Esta teoria puede resumirse en tres conceptos principales: 1. La célula es la unidad estructural de fos organismos vivos; 2. Es la unidad funcional de los seres vivos; 3. Todas las élulas provienen de otras células preexistentes. A. OBJETIVOS, Con esta practica se pretende que el estudiante. 1. Observe algunos tipos de células, tanto de animales como de vegetales, 2. Observe estructures celulares como pared celular, cloroplastos, amiloplastos y niicleo. 3. Determine algunas semejanzas y diferencias entre las distintas células observadas 4, Se dé cuenta de la importancia de ciertos colorantes y soluciones en la identificacin de estructuras y sustancias celulares, B. MATERIALES Microscopios compuestos binoculares Portaobjetos Cubreobjetos (iaminilas) Goteros 7Beakers o frascos pequefios con ague Toallas de papel absorbente Beakers de 100 millitros Aceite de inmersion Palllos de dientes Cuchillas de afeitar nuevas Lugol al 1% Azul de metileno al 1% Bulbos de cebolla de huevo (Allium cepa), preferiblemente roja Elodea (Anacharis sp.) Papas (Solanum tuberosum) Tomates (Lycopersicon esculentum) Placas permanentes de sangre humana Papel para limpiar lentes (Kleenex facial blanco) Tela suave para limpiar e! microscopio PROCEDIMIENTO 1. Células vegetales Cebolla ‘Tome una cebolla de huevo y dividala en ocho partes. Note que consta de varias capas 0 escamas, Cada capa esta recubierta, en ambes superficies, por una membrana transparente formada por células epidérmicas 0 epiteliales, Separe una porcion pequefia de la membrana externa (que es mas coloreada 0 pigmentada que la interna), extiéndala sobre un portaobjeto, agregue una gota de agua y péngale un cubreobjeto tratando de eviter la formacién de burbujas. Dibuje varies célules en 10X y en 40X. .Qué forma tienen las céluias? 2 ‘Agregue una gota de solucién de lugol a un lado del cubreobjeto y al iado opuesto ponga un pedaze de papel absorbente para faciitar ia entrada del coiorante a la muestra, Observe nuevamente en 10X y en 40X. Qué diferencia encuentra en relacion con la observacion que hizo anteriormente? JEstas células son mononucleadas o polinucleadas? = Elodea Ponga una hoja de la planta acuatica elodea sobre un portaobjeto, agregue una gota del agua en la que se encuentra la planta y coléquele un cubreobjeto. Esquematice varies células en 10X y en 40X. ¢Se ve el nucleo celular? Observe detenidamente algunas células con el objetivo de 40X. zSe nota en ellas algun movimiento? ci €& asi, como se fas que permiten darse cuenta de ese movimiento? {Qué nombre 10? LA qué se-debera? 18c. Papa Con una cuchilla quitele la cascara a un pedazo de papa. A continuacién saque porciones en forma de ‘palitos” de aproximadamente madio centimetro de ancho. Luego haga un corte muy delgado, transparente, en uno de los extremos y depositelo sobre un portaobjeto, agregue una gota de agua y pongale un cubreobjeto. Observe que hay un gran niimero de estructuras transparentes, de tamafios variables y de formas mas 0 menos ovaladas. Estas estructuras también son plastidios, como los cloroplastos. Como ‘se llaman? ¢ Qué funcién tienen? {ademas de ellos, se ven células? 2Qué forma tienen éstas? i Coloree la preparacion con lugol. Qué coloracion toman los plastidios con la solucion de lugol? {Por qué? ZE! lugol seré especifico para la identificacién de almiden o se podra utilizar para reconocer cualquier carbohidrato? Haga un esquema de lo que se observa con el objetivo de 10X. Tomate ‘Coja un tomate maduro y quitele con una cuchilla una parte de la cascara. Con la misma cuchilla 0 con un palilo de dientes raspe, en forma horizontal, una pequefia porcién del \ejido contiguo (mesocarpio 0 pulpa), esparzalo sobre un portaobjeto seco, agréguele una gota de agua y péngale un cubreobjeto. Dibuje varias células en 10X y en 40X. Hay estructuras diferentes a las observadas en las células anteriores? Observe unas h pequefias estucturas de color rojo, que son otro tipo de plastidios. Como se aman? . eCuales sufuncion? {) Q () Coloree la preparacién con lugol. yHay algunas estructuras que se ven mejor que P antes de colorear? 7 Y 2 Céhuas animales a. Mucosa bucal Ponga una gota de agua sobre un portaobjeto. Enjudguese la boca y con un palillo de ientes haga un raspado suave sobre la pared interna de las mejilas 0 carrillos. Mezcle el raspado con la gota de agua, esparzalo sobre el portaobjeto, pongale un cubreobjeto y ‘observe con los objetivos de 10X y de 40X. zQué estructuras ve en estas células? U Coloree la preparacién con azul de metilend. Qué diferencias encuentra entre esta observacion y la inmediatamente anterior? Dibuje, en 40X. algunas de las células observadas, b, Sangre humana La sangre esta compuesta de diferentes tipos de células que $e encuentran suspendidas en un liquide llamado plasma. Cada centimetro cibico de sangre puede contener millones de estas células. Las tres formas de células sanguineas son los eritrocitos © gldbulos ‘ojos, los leucocitos © glébulos blancos (que son de distintos tipos) y 2s trombocitos 0 plaquetas. 19| __ Para observar estas oélulas tome una placa permanente de exterdido de sangre, que ha sido tratada con colorante de Wright, y enfoquela con fos objetivos de 40X y de 100X _Cuantas clases diferentes de células hay? {Cudles son las caracteristicas de cada una fen cuanto ala forma como se tifen? zPor qué algunas se tifen y otras no? 2Qué funcién tiene cada una de las distintas clases de células? Dibuje lo observado con el objetivo de 100X 0 con el de 40X. D. PREGUNTAS 1. Fuera de las estructuras u organelas que vio en las diferentes células, hay otras que no se pudieron observar; explique por qué, y qué se podria hacer para observarias. 2. Enuncie al menos tres diferencias generales entre células animaies y oélulas vegetales. 3. UDe qué factores puede depender el hecho de que las células tengan distintas formas? CTodas las células tienen nucleo? ¢Habra células con mas de un niicleo? Explique con ejemplos 4, LEn las células de cebolla, elodea, papa y tomate se observa la membrana celular? Explique 5, {Todas las células vegetales tlenen cloroplastos? Explique. 6 Puede dar algunas razones por las cuales ciertos colorantes son especificos para determinadas estructuras celulares? Cite algunos ejemplos. 20LABORATORIO V MITOSIS INTRODUCCION Cuando un tejido es fiado y preservado, las estructuras de las células permanecen tal como estaban en el momento de la fijact6n. Si ese telido, vegetal o animal, pertenece a una parte activa de crecimiento y divisién celular, es posible encontrar todas las elapas de la mitosis, es decir, profase, metafase, anafase y telofase. Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que tales etapas son sadas simplemente por razones didacticas para un mejor entendimiento del fendmeno, puesto que la mitosis es un proceso continuo a través del cual las células se dividen y su material genético, previamente duplicado, se distribuye por partes iguales en las oélulas hijas. La mitosis es un mecanismo universal de division celular que sigue un modelo general aplicable, con algunas pequefias variaciones, a las células somaticas eucariotas. Las principales caracteristicas de las etapas en las cuales se ha dividido dicho proceso son las siguientes: Profase: Los cromosomas se hacen visibles como hilos muy delgados, no hay ordenamiento entre ellos y la membrana nuclear aun no ha desaparecido. Se identifica porque los nticleos toman una apariencia granulosa, Metafase: Los cromosomas estén organizados y agrupados en la zona ecuatorial y la membrana nuclear ha desaparecido. No obstante, segiin la técnica utilizada y el tipo de célula, pueden verse en forma dispersa en el citoplasma, distinguiéndose esta etapa por el hecho de que los cromosomas se encuentran formados por dos crométidas, es decir, en diadas, en namero igual ‘al nimero diploide de las oflulas sométticas del organism, Anatase: Los cromosomas se encuentran migrando, en igual niimero, hacia cada uno de los polos de la célula y sus extremos estén orientados hacia el centro de ella. Sin embargo, por los mismos motives que en la etapa anterior, pueden verse en forma dispersa, pero los cromosomas en esta etapa se distinguen porque constan de un solo flamento y por tanto el numero de ellos es, 4n, 0 sea dos veces el ntimero diploide. Telofase: Se observa la formacién, en tejidos vegetales, de una placa ecuatorial o laminilla media muy tenue, que divide la célula en dos partes aproximadamente iguales. En cada una de elias se observan los ndcleos, y sus cromosomas, poco definidos. En los tejidos animales ocurre un estrangulamiento de la membrana citoplasmética que da como resultado la formacién de dos células aproximadamente iguales, cada una con el mismo niimero de cromosomas. Estas dos célules hijas entran en un estado llamado interfase, de intensa actividad metabdlica pero no de division celular, en e! cual no se ven ios cromosomas, y que se distingue porque los nticleos son muy definidos y no de apariencia granulosa. La mayoria de las células que se observan en un telido en crecimiento estan en esta etapa de interfase. Las anteriores etapas se representan, en su orden, en la figura 1 27Telofase toterta Figura +: Mitosis en células de cebolla (Allium copa) 28A, OBJETIVOS Con esta practica se pretende que el estudiante: 1. Aprenda una de las técnicas utilizadas para observar células vegetales en division. 2. Observe las diferentes etapas de ia mitosis, asi como nicieos en interfase. 3. Observe diferencias y semejanzas entre la mitosis en vegelales y la mitosis en animales, utilizando para ello placas de células humanas previamente preparadas. MATERIALES: Microscopios compuestos binoculares Portaobjetos Cubreobjetos (laminillas) Goteros Beakers o frascos pequefios con agua Toallas de papel absorbente Raices de cebolla de huevo (Allium cepa) Tubos de ensayo Pinzas de madera ‘Agujas de diseccién o estiletes Cuchitlas Beakers de 50 millitros 0 frascos de boca ancha Beakers de 1000 millitros Pariila eléctrica Placas permanentes de células animales en mitosis Solucién fjadora (una parte de acido acético glacial: tres partes de alcohol etllico al 95%) HCI 1M Acetoorceina 8-hidroxiquinolina 0.002M Papel para limpiar lentes (Kleenex facial blanco) Tela suave para limpiar el microscopio C, PROCEDIMIENTO 1, Técnica para obtener células de cebolla en division a. Se toman bulbos de cebolla, se les corta la raiz incluyendo parte del bulbo, y se les quita la epidermis més externa. b. Se sumergen en recipientes apropiados (por ejemplo, beakers de 50 milltros, frascos de boca ancha o vasos desechables de pldstico) con agua de tal manera que ésta cubra una porcién de la parte inferior de! bulbo (figura 2). Si es necesario, asegtirelos con paiillos de dientes a la boca del recipiente. ¢. Se ponen en Ia oscuridad durante 72 horas, tiempo en el cual las nuevas raices alcanzan ‘unos tres centimetros de longitud. Esto se debe @ que durante este tiempo y @ un promedio de temperatura de 22 °C se obtiene un indice mitético grande, ya que muchas de las células estan en mitosis, 29Figura 2: Manera de poner a crecer las raices de bulbos de cebolla de huevo 4. Se cortan las ralces y se ponen durante una o dos horas en un tubo de ensayo cue contenga el agente antimitético 8-hidroxiquinolina con el fin de obtener un buen nimero de células en metafase, ©. Se sacan las ralces y se ponen durante un minimo de 24 horas en tubos de ensayo que contengan solucién fiadora Los pasos anteriores deben haberse realizado previamente en el laboratorio. 2. Preparacién de las placas de células de cebolla @, Ponga una ralz en un tubo de ensayo que contenga HCI 1M y caliéntela al baio de Maria en un beaker de 1000 miltros durante 8 minutos. a 56 °C. Esta temperatura debe controlarse con un termémetro y por ningun motwe sebe pasar de 8 °C. Si aumenta, se debe adicionar agua fria al beaker. ». Coja fa ralz con un estilete y pongala sobre un portaobjeto. Cértele transversaimente el extremo mas blanco a una distancia de ap-oxmadamente 0.5 centimetros y descarte el otro extreme. Agregue una gota de acetooceina y macere el tejido durante dos o tres minutos con una cuctilla o con el extreme redondeado del mango de un estilete metalic. Deje actuar el colorante durante otros dos minutos, ponga el cubreobjeto, cubra la pleca ‘con un pedazo pequefio de papel absorbente 0 de ‘Kleenex” y haga presién vertical (‘squash’) sobre el cubreobjeto con ei sedo pulgar, sobre el mismo punto y en una sola direcci6n para evitar que se quieore et cubreodjeto”. Retire el papel, observe con los objetivos de 10X y de 40X cada una de las etapas de la mitosis y haga sus propios esquemas para ilustrarias. z Cua! es la.raz6n por la cual se calenté con HCI al bafo de Maria? ¢Para qué se macert e! tejido? * Ora manera de hacer esto itimo es coms sigue: 1, Tape el cubrestjeto cof el papel absorberte: 2. Sostenga presionado l cubreobjeto en uno de sus extremos can e pulgar de una mano; 3, Desplace la ua del otro pulgar sobre 8! cubrenbjoto os 0 tres veces desde el extreme que esta sestenido hasta ieccién, haciendo la debida presion vertical en cada racoride 303. Observacién de mitosis en células animales Observe las placas permanentes* que le dé el profesor. Localice diferentes etapas de la mitosis y haga esquemas de ellas en 40X. Cuente los cromosomas y constate con su profesor el numero correcto para cada preparacién PREGUNTAS 1. {Cual es la accién de la solucién fijadora sobre las estructuras celulares? 2. EQué acci6n sobre el mecanismo de Ia mitosis ejercen los agentes antimitéticos, como la 8 hidroxiquinolina? Consulte qué otros agentes antimitéticos pueden utlizarse en este procedimiento para obtener un alto nimero de metafases. 3. ¢Por qué se utiliza el meristema de la raiz y no otra parte de elle? 4. LA qué se debe que unas células en interfase tienen un niicleo mayor que otras que también estan en interfase?. 5. Cual es la importancia biolégica de la mitosis? Explique con varios ejempios. 6. Haga un paralelo entre la mitosis y la meiosis. 7. ECual 0 cuales de las siguientes cétulas utlizaria usted para estudiar los cromosomas bumanos? Expiique. 2. Giébulos rojos b. Giobulos blancos cc. Neuronas 4d. Epiteliales, como las de la piel y ka mucosa intestinal * La técnica para Ia preparacion de estas placas os muy diferente ala emploada en la preperacién anterior. En resumen, procedemiento més comin es coma sigue: se toma una muestra de sangre venosa, se le echa anticoagulante, se pone en lun frasco que contenga medio de cultvo, se le agrega un agente antimitétice y ee incuba varios dias. Al cabo de ess tiempo se centrifuga para separar las células del plasma, se adiciona una solucién hipotonica, se centituga nuevamente y se Aagrega fiador (estos titines pasos se repiten varias veces). Finalmente, se gotea la muestra sabre un portaobjeto, se ‘observa al microscepio para evaiuar la calidad del extendido cromosémico y 88 colorean con glemsa ins placas de buena calidad 31LABORATORIO Vil ACCION DE UNA ENZIMA DE TEIIDOS VEGETALES ¥ ANIMALES INTRODUCCION Las enzimas son proteinas especificas que actuan como catalizadores en muchas reacciones quimicas en los seres vivos y su actividad puede comprobarse experimentaimente mediante la identificacién y cuantificacion de los productos formados en la reaccién que ellas regulan. La accién de estos compuestos proteicos en una reaccién se afecta por la variacién de factores fisicos y quimices tales como la temperatura, el pH y la concentracion de la enzima y del sustrato, En esta practica se realizaran experimentos con un catalizador inorgénico (MnO2) y otro ‘organico (peroxidasa). Esta Ultima se encuentra tanto en tejidos vegetales como animales y actia sobre el peroxide de hidrogeno 0 agua oxigenada (H.02). Este perdxido es un producto de la ‘activided celular que al acumularse en exceso intoxica la célula, por lo cual debe ser degradado Por una enzima especifica. La reaccion en la cual interviene la peroxidasa se representa de la Siguiente manera: peroxidasa 2H,02 ——_» 2H,0+ 0; Al observar esta reaccion en el laboratorio se ven burbujas, que se producen debido al desprendimiento de oxigeno. La cantidad de burbujas es directamente proporcional a la intensidad de ia reaccién y puede utilizarse como una medida aproximada de ella A. OBJETIVOS, Con esta préctica se pretende que el estudiante: 1. Observe el efecto de la enzima peroxidasa, que se halla presente en tejides animales y vegetales, sobre el agua oxigenada. 2. Compare la accion de la peroxidase (catalizador orgénico) y det bidxido de manganeso {cataizador inorgénico) sobre un mismo sustrato (agua oxigenada), 3. Compruebe el efecto de la variacién de la temperatura en la actividad enzimatica. B. MATERIALES “Tubos de ensayo de 17 x 150 milimetros Gracias apes de cera Pareas eléctricas Seas de 1000 mililitros 39Pinzas de madera Morteros, Navajas Cucharas cafeteras Pipetas de 5 mililitros Cuchillas Hielo Bidxido de manganeso (MnO2) ‘Agua oxigenada (H.02) Higado fresco Papas C, PROCEDIMIENTO 4. Accién de un catalizador inorgénico sobre el agua oxigenada Marque tres tubos de ensayo con los niimeros 1 2 y 3. Echew a cada uno una pequefia cantidad de biéxido de manganeso aproximadamerte gua ic que pueda tomar con la punta de una navaja) y proceda de la siguiente manera (Nota: conserve en una gradilla todos los tubos sue cace en esta practica. para efectuar comparaciones.) a. Tome el tubo por su parte inferior y agréguse os Twiwus de agua oxigenada. Observe la intensidad de la reaccion para que comzar sor es dos tubos siguientes, 1 Qué papel desempefia el bidxido de manganeso en j@ reacciin? ZY el agua oxigenada? ¢Hubo desprendimiento de calor? b. Con unas pinzas ponga el tubo 2 a’ catc de Maria durante 10 minutos. Retirelo e inmediatamente agréguele dos miltitr>s 22 agua oxigenada. Observe la reaccién y comparela con la anterior. ,Ocurrié cor —ayor 9 menor intensidad? (1 aumento de fa temperatura afects el catalizador? c. Ponga el tubo 3 en un recipiente cor ~e0 durante 10 minutos. Retirelo e inmediatamente agréguele dos miliitros de agua sxgerada. Compare la teaccién con las anteriores. {Como afectd [a disminucion de 3 s7weratwra la accién del bidxido de manganeso? Explique. 2. Acci6n de un catalizador de origen animal sobre el agua oxigenada Marque cuatro tubos de ensayo sor ios niimeros 1, 2, 3 y 4 y proceda de la siguiente manera: ‘a, Tome el tubo 1 por la parte sestor. échele un pequefto pedazo de higado y luego dos millitlos de agua oxigerace Observe la intensidad de la reaccion. LQué papel desemperia el higado en ‘a "eaccxin? ,Cudl es la natureleza quimica de la sustancia que cataliza esta reaccion? ,H..bo desovendimiento de calor? 40