ANTECEDENTES

La contaminación con cadmio y cromo en suelos, ríos y aguas profundas se ha

incrementado peligrosamente. Las bacterias, algas y hongos están recibiendo una
atención creciente para la eliminación-recuperación de metales pesados debido a su
efectividad, bajo costo y fácil disponibilidad. En el laboratorio se demostró que ciertas
cepas de Escherichia coli podían detoxificar medios líquidos con altas concentraciones
de cobre. Los objetivos del presente trabajo fueron:

a) procesar adecuadamente muestras de suelos, contaminados artificialmente con

cobre, para liberar el metal al medio líquido y a partir de allí ser capturado por las
bacterias.

b) utilizar diferentes mutantes de E. coli para remediar el agua de desecho de uno de

los pasos del tratamiento secuencial oxidativo (TSO) para el control de moho verde en
citrus, que contiene en su composición una sal de cobre.

Diferentes muestras de tierra contaminadas artificialmente con cadmio y cromo fueron

procesadas y el ácido con el que se obtuvo una mejor extracción fue el HCl. Tres
extracciones secuenciales de 30 min cada una solubilizaban alrededor del 90% del
metal. Las cepas de E. coli presentaron una mayor captura del cobre cuando los
sobrenadantes tenían un pH superior a 5. Con una sola extracción bacteriana se
recuperaba el 90% del metal. b) En soluciones del TSO conteniendo CuSO4, para
recuperar el 90% del metal de la solución, se necesitaron realizar tres extracciones
bacterianas consecutivas. Algunas mutantes en componentes de la cadena
respiratoria fueron más efectivas que la cepa salvaje en este proceso. Este estudio
confirma que algunas cepas de E. coli, en un proceso ex situ, podrían ser
eficientemente utilizadas para detoxificar suelos o aguas contaminados con cadmio y
cromo.

JUSTIFICACIÓN

El tema que estamos trabajando es la eficacia de las bacterias Listeria y Escherichia Coli para
degradar metales pesados, que es un tema de impacto ambiental por las diversas
consecuencias que trae el derrame de metales pesados.

Escogimos este tema por lo importante que es degradar o transformar los metales pesados
porque al ser expuestos pueden causar enfermedades por lo que es un tema bastante delicado
en las zonas mineras por los constantes derrames de minerales en los lagos o ríos aledaños a la
mina.
Nuestra primordial motivación es el determinar la eficacia de nuestra bacterias Listeria y
Escherichia Coli para degradar los metales pesados y dar una posible solución a esta
problemática.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Existen muchos metales pesados los cuales son tóxicos y perjudiciales para muchas partes del
ecosistema, ya sea del suelo, el agua, el aire. En el presente informe nos referiremos al Cadmio
en específico. Se han utilizado muchos mecanismos para eliminar tal problema, sin embargo,
traen muchas consecuencias a la larga, las cuales son perjudiciales. Por ello la implementación
de microorganismos en esta lucha se vio como una buena opción, ya que muchos de ellos
poseen metabolismos útiles para contrarrestar tal problema sin muchas consecuencias a largo
plazo. En nuestra investigación hablaremos de dichos mecanismos y en particular de
exactamente dos bacterias: Escherichia Coli y la Listeria.

MARCO TEÓRICO

Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) es una bacteria que se encuentra normalmente en el intestino del ser
humano y de los animales de sangre caliente. Es una bacteria gramnegativa con forma de
bacilo de la familia de las enterobacterias que se encuentra en el tracto gastrointestinal de
humanos y animales de sangre caliente.

E. coli es la bacteria anaerobia facultativa comensal más abundante de la microbiota;

asimismo, es uno de los organismos patógenos más relevantes en el humano, tanto en la
producción de infecciones gastrointestinales como de otros sistemas (urinario, sanguíneo,
nervioso). Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacteriólogo
alemán, quien la denominó Bacterium coli commune. Posteriormente la taxonomía le adjudicó
el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor.

Ésta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo,
además de producir las vitaminas B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción
de Gram (gramnegativo), es anaerobio facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su
cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa.

Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y biología molecular.

La mayoría de las cepas de E. coli son inofensivas. Sin embargo, algunas de ellas, como E. coli
productora de toxina Shiga, pueden causar graves enfermedades a través de los alimentos. La
bacteria se transmite al hombre principalmente por el consumo de alimentos contaminados,
como productos de carne picada cruda o poco cocida, leche cruda, y hortalizas y semillas
germinadas crudas contaminadas.

E. coli es un bacilo gramnegativo, oxidasa negativo, perteneciente a la familia de las

Enterobacterias. Es capaz de crecer en medios aerobios y anaerobios, preferentemente a 37
ºC; tiene formas sin movilidad y móviles, estas últimas con flagelos.

Para el aislamiento e identificación de la E. coli, se debe tomar una muestra a 37 ºC en un

medio selectivo en condiciones aeróbicas, ya sea en agar MacConkey o eosina azul de
metileno, donde las enterobacterias pueden diferenciarse por sus características morfológicas
y ser diferenciadas por la prueba del indol.

E. coli, en su hábitat natural, vive en los intestinos de la mayor parte de los mamíferos sanos.
Es el principal organismo anaerobio facultativo del sistema digestivo. En individuos sanos, es
decir, si la bacteria no adquiere elementos genéticos que codifican factores virulentos, la
bacteria actúa como un comensal formando parte de la microbiota intestinal y ayudando así a
la absorción de nutrientes. En humanos, Escherichia coli coloniza el tracto gastrointestinal de
un neonato adhiriéndose a las mucosidades del intestino grueso dentro de pocas horas de
nacido. Desde entonces permanece en una relación de mutuo beneficio. No obstante, estas
cepas comensales pueden producir infecciones en el paciente inmunodeprimido. Las cepas
patógenas de E. coli, por el contrario, en cuanto colonizan un huésped sano, pueden producir
infecciones de diversa severidad en el intestino, las vías urinarias, meningitis, sepsis, entre
otras infecciones.

Clasificación

 Escherichia coli enteropatogénica (ECEP)

 Escherichia coli enterotoxigénica (ECET)
 Escherichia coli enteroinvasiva (ECEI)
 Escherichia coli enterohemorrágica o verotoxigénica (ECEH)
 Escherichia coli enteroagregativa o enteroadherente (ECEA)
 Escherichia coli de adherencia difusa (ECAD)
 Escherichia coli O157:H7

Medios de Cultivo
Para microorganismos entéricos, los medios usados de modo habitual contienen ciertos colorantes e
ingredientes que inhiben los organismos gram positivos y permite la propagación de los bacilos
entéricos Gram negativos.

OtrO tipo de medio que es una gran herramienta a la hora de la identificación de microorganismos
entéricos como la E. coli son los medios diferenciales que poseen componentes químicos e
indicadores que permiten identificar con cierta facilidad algunos géneros o especies bacterianas por
el aspecto característico que toman sus colonias. Muchos medios selectivos son también
diferenciales por ejemplo podemos mencionar:

 Agar Salmonella – Shigella: Se utiliza para aislar bacterias lactosa negativa

como Salmonella y Shigella. Especies de la familia Enterobacteriaceae lactosa – positivas,
como Escherichia coli, presentan colonias rosadas en este tipo de medio.
 Agar Tergitol 7: Este medio permite diferenciar especies fermentadoras de la lactosa de las especies
no fermentadoras. En este medio Escherichia coli presenta colonias amarillas.
 Agar MacConkey: Al igual que el anterior separa las bacterias fermentadoras de la
lactosa. Escherichia coli produce colonias rosadas.
 Agar Eosina – Azul de Metileno (EMB) de Levine: Permite la diferenciación de especies
fermentadoras de la lactosa. Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli presentan colonias que varían
del púrpura a verde metálico.
Pruebas Bioquímicas son la forma más convincente del diagnóstico de las enfermedades
infecciosas, mediante este proceso se determinan el género y las especies bacterianas de interés.
Cada tipo bacteriano tiene un cuadro de reacciones específicas donde se comprueba el resultado de
las reacciones y son la base de la identificación de los diferentes agentes bacterianos. En general
para la identificación de enterobacterias se sugiere realizar las siguientes pruebas:
 Agar TSI: Es un medio de cultivo diferencial basado en la capacidad de los bacilos gram negativos
de fermentar carbohidratos, de producir H2S y producir gas.
 Se observa en el tubo el pico y el fondo ácido, hay 1% de positividad para la producción de H2S
en cepas de E. coli.
 Prueba de orto-nitrofenil-β-galactopiranósido (ONPG): Esta prueba detecta la producción de la
enzima β-galactosidasa y permite diferenciar organismos de lenta utilización de la lactosa de aquellos
que no la utilizan. La enzima β-galactosidasa es codificada por el gen lacZ del operón lactosa, el cual
es inducido en presencia de lactosa y ausencia de glucosa. Por lo tanto, se requiere que las bacterias
hayan sido crecidas en un medio con lactosa como el Agar TSI o el Agar MacConkey.
 E. coli es positiva para esta prueba
 Prueba de movilidad: Esta prueba determina la movilidad de los bacilos fermentadores.
 95% de positividad para cepas de E. coli.
 Prueba de gelatinasa: Determina la producción de la enzima gelatinasa, la cual produce la hidrólisis
de la gelatina.
 E. coli es negativa para esta prueba
 Prueba de rojo de metilo (RM): Identifica especies de bacterias que producen ácidos a partir de
glucosa.
 99% de positividad para cepas de E. coli.
 Prueba de Voges – Proskauer (VP): En esta prueba se detecta la producción de acetil-metilcarbinol
(acetoína), el cual se convierte a diacetilo en presencia de KOH y O2 atmosférico. El diacetilo es
convertido posteriormente en un complejo rojo en presencia de α-naftol y creatinina. La producción
de acetoína es una vía alternativa del metabolismo del ácido pirúvico, donde se producen cantidades
pequeñas de ácidos mixtos que pueden ser insuficientes para dar una prueba RM positiva. Por este
motivo, la mayoría de las especies de la familia Enterobacteriaceae son VP positivo y RM negativo y
viceversa.
 esta prueba es negativa para cepas de E. coli.
 Prueba de fenilalanina desaminasa: La determinación de la enzima fenilalanina desaminasa es útil
para diferenciar inicialmente a las especies de: Proteus, Morganella y Providencia de otros bacilos
gram negativos.
 0% de positividad para cepas de E. coli.
 Producción de descarboxilasas y dehidrolasas de aminoácidos: Muchas especies bacterianas
poseen enzimas que tienen la capacidad de descarboxilar o de hidrolizar aminoácidos específicos
entre ellos la arginina, lisina, ornitina en pruebas específicas, liberando animas de reacción alcalina y
CO2.
 17% de positividad para Arginina.
 90% de positividad para Lisina.
 65% de positividad para Ornitina.
 Prueba de Ureasa: Los microorganismos que hidrolizan la urea a través de la enzima ureasa, liberan
amoníaco lo cual produce un cambio de color rojo en el medio. El agar urea de Christensen permite la
detección de menores cantidades de amoníaco para aquellos microorganismos que producen menores
cantidades de ureasa se evalúan con este método.
 1% de positividad para esta prueba en E. coli.
 Producción de Indol: El indol es uno de los productos de la degradación del aminoácido
triptofano. Para su detección la bacteria es cultivada en caldo triptona y posteriormente se utiliza el
reactivo de Ehrlich, el cual es más sensible que el reactivo de Kovacs cuando se estudian bacilos no
fermentadores o anaerobios cuya producción de indol es mínima.
 98% de positividad para esta prueba en E. coli.
 Utilización de citrato: Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el
citrato de sodio como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento.
 1% de positividad para cepas de E. coli.
 Utilización de malonato: Esta prueba determina la capacidad de algunas bacterias de utilizar el
malonato como fuente de carbono y energía.
 95% de positividad para cepas de E. coli.
 Prueba de reducción de nitratos: Determina la capacidad de reducir el nitrato a nitrito o gas. Es útil
en la identificación de la familia Enterobacteriaceae y en la diferenciación de especies de muchos
otros grupos de microorganismos.
 E. coli es negativa para esta prueba
 Prueba de fermentación de carbohidratos: Se recomienda el uso del caldo de base púrpura de
bromocresol conteniendo un determinado sustrato a una concentración del 1% para la determinación
de la fermentación de carbohidratos y alcoholes para especies de la familia Enterobacteriaceae.
  D-Sorbitol 94% de positividad.
 Lactosa 95% de positividad.
 Sacarosa 50% de positividad.
 D-Manitol 98% de positividad.
 D-Adonitol 5% de positividad.
 L-Arabinosa 99% de positividad.
 Maltosa 96% de positividad.

Listeria

Listeria es el nombre de una bacteria que se encuentra en el suelo y el agua y en algunos

animales, incluyendo las aves de corral y el ganado. Puede estar presente en la leche cruda y
los alimentos elaborados de leche cruda. También puede vivir en las plantas de procesamiento
de alimentos y contaminar una gran variedad de carnes procesadas.

La Listeria es diferente de muchos otros gérmenes puesto que puede crecer incluso en la
temperatura fría del refrigerador. La Listeria se mata mediante cocción y pasteurización.

Periodo de Incubación

 3 – 70 días

Síntomas

 Fiebre, rigidez en el cuello, confusión, debilidad, vómitos, a veces precedidos por

diarrea

Duración de la enfermedad

 De unos días a unas semanas

Personas en riesgo

 Adultos mayores
 Embarazadas
 Personas con el sistema inmunitario debilitado
 Pacientes con trasplante de órgano que reciben medicamentos para prevenir que el
cuerpo rechace el órgano
 Personas con ciertas enfermedades, como:
o VIH/SIDA u otras enfermedades autoinmunes
o Cáncer
o Enfermedad renal en etapa terminal
o Enfermedad hepática
o Alcoholismo
o Diabetes

Caldo de Enriquecimiento para Listeria

El Caldo de Enriquecimiento de Listeria está basado en la fórmula desarrollada por Lovett et

al.6 en la cual el Caldo de Soja Tríptico es suplementado con Extracto de Levadura para un
crecimiento óptimo. Las Listeria spp. crecen en un rango de pH entre 5,0–9,6 y puede
sobrevivir en productos alimenticios con niveles de pH por fuera de este rango. Las especies de
Listeria spp. son microaerófilas, Gram-positivas, no formadoras de esporas, no-encapsuladas,
no ramificadas con flagelos cortos y móviles. La motilidad es pronunciada a 20°C. La
identificación de Listeria en el aislamiento exitoso del organismo, su caracterización
bioquímica y su confirmación serológica.

Principios del Procedimiento

El Digerido Enzimático de Caseína, Digerido Enzimático de Harina de Soja y el Extracto de

Levadura suministran nitrógeno, vitaminas y minerales en el Caldo de Enriquecimiento para
Listeria. La Dextrosa es una fuente de carbohidratos. El Cloruro de Sodio mantiene el balance
osmótico del medio de cultivo. El Fosfato Dipotásico es el agente de tamponado. El Ácido
Nalidíxico inhibe el crecimiento de organismos Gram-negativos. La Acriflavina inhibe las
bacterias Gram-positivas. La Cycloheximida es usada para inhibir el crecimiento de hongos
saprofitos.

Fórmula / Litro

Digerido Enzimático de Caseína............................................. 17 g

Digerido Enzimático de Harina de Soja .................................... 3 g

Extracto de Levadura................................................................ 6 g

Dextrosa................................................................................. 2,5 g

Cloruro de Sodio ...................................................................... 5 g

Fosfato Dipotásico ................................................................. 2,5 g

Ciclohexamida ..................................................................... 0,05 g

Acriflavina .......................................................................... 0,015 g

Ácido Nalidíxico ................................................................... 0,04 g

pH Final: 7,3 ± 0,2 at 25°C

Precauciones

1. Para uso en el laboratorio.

2. TÓXICO. Tóxico si es ingerido, inhalado o absorbido a través de la piel. Irritante para los ojos,
piel y sistema respiratorio. Posibles riesgos de daños en el feto. Posible carcinógeno.

Procedimiento

1. Disuelva 36,1 g del medio en un litro de agua purificada.

2. Mezcle completamente.

3. Autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Especificaciones de Control de Calidad

Apariencia del Deshidratado: Polvo suelto homogéneo, de color beige claro.

Apariencia del Preparado: El medio preparado es transparente a ligeramente nublado, de color

dorado a
naranja-ámbar con la parte superior de color verde opalescente, y posiblemente con un
precipitado ligero.

Respuesta Esperada del Cultivo: Respuesta esperada en Caldo de Enriquecimiento para Listeria
incubado aeróbicamente a 30± 2°C y examinado para determinar crecimiento después de 18–
48 horas de incubación.

Procedimiento de la Prueba

Para aislamientos de Listeria, refiérase a los procedimientos de laboratorio adecuados

recomendados para muestras alimentarias.

Resultados

Consulte las referencias y procedimientos adecuados para obtener resultados confiables.

Almacenamiento

Almacene el envase conteniendo el medio de cultivo deshidratado sellado firmemente y a una

temperatura entre 2–30°C. Una vez abierto y cerrado nuevamente, coloque el envase en un
ambiente con baja humedad a la misma temperatura de almacenamiento. Proteja el producto
de los efectos de la humedad y de la luz manteniendo el envase firmemente cerrado.
HIPÓTESIS

Al contar con la obtención de dos bacterias como son la Escherichia Coli y la Listeria,
nosotros proponemos la interrogante: ¿Pueden las bacterias mencionadas cumplir
eficazmente con la biorremediación en los metales en especial hablando del Cadmio?
A lo que nosotros a través de investigaciones afirmaremos, ya que ambas bacterias
poseen mecanismos bioquímicos efectivos para contrarrestar la toxicidad de diferentes
metales pesados.

VARIABLES

Variable Dependiente

 La eficacia de la bacteria Listeria y Escherichia Coli para degradar metales

pesados

Variable Independiente

 Concentración del metal pesado en el agua de mina.

OBJETIVOS

Objetivo General

 Conocer si las bacterias Escherichia Coli y Listeria permiten la biorremediacion

de metales pesados

Objetivos Específicos
  Comprobar la degradación de Cadmio a través de las bacterias Escherichia
Coli y Listeria
 Comprobar las condiciones teóricas en las que viven dichas bacterias

MÉTODO

En experiencias de laboratorio, realizadas anteriormente, se estudió el crecimiento de

la bacteria Escherichia coli (aislada de un efluente de una empresa metalmecánica
mezclado con efluente cloacal), trabajando con reactores Bach, tanto en estado libre
(plantónico) como soportada sobre distintos medios, con y sin aireación. Se comprobó
que la bacteria E. coli puede crecer en presencia de Cr (VI) y reducirlo trabajando con
concentraciones de hasta 50 mg.L-1 Cr. Además, se verificó que la velocidad de
reducción del metal es mayor cuando las bacterias se encuentran en presencia de
oxígeno y soportadas sobre un material inerte (arena o cerámica).

Estudio de reducción de Cromo (VI) utilizando arena como soporte en función de los
resultados obtenidos anteriormente, se simuló el proceso de biorreducción en
condiciones de laboratorio utilizando reactores batch discontinuos empleando arena
como medio soporte y trabajando a mayores concentraciones que las estudiadas
hasta el momento. Se trabajó con caldo nutritivo como alimento (fuente de carbono,
nitrógeno y macronutrientes), arena al 5% (tamizada de manera de obtener un
diámetro de partícula entre 150 y 300 µm), inóculo de la cepa Escherichia coli
(concentración inicial: 108 UFC . ml-1).

La experiencia se efectuó a temperatura ambiente (25 ± 3 ºC) con agitación constante

y aireación mecánica. Al cabo de un período de 24 horas y obtenida la biopelícula
sobre el medio soporte, se suplementó con 20, 50, 100 y 200 mg. L-1 de Cr (VI), a
partir de una solución de dicromato de potasio concentrada. Se tomaron muestras a
las 24, 48, 72 y 120 horas, las cuales fueron centrifugadas a 3.500 rpm durante 20
minutos. Al líquido sobrenadante se le determinó el contenido de Cr (VI), por
duplicado, utilizando el método colorimétrico de la difenilcarbazida (APHA, 2001).

También se midió el pH de la solución utilizando un pH-metro Hanna. Al finalizar el

ensayo se determinó la presencia de Cr (VI) en la biomasa soportada. A su vez, se
evaluó la presencia de Escherichia coli en agar EMB al inicio y al final de la
experiencia para cada una de las condiciones de trabajo. En la experiencia no se pudo
evaluar el crecimiento bacteriano a partir de la medición de densidad óptica (D.O.), ya
que la arena produce turbidez enmascarando el resultado.