Estrategias

 de  clonación  molecular  

Para  manipular  el  DNA  es  necesario  disponer  de  

un  gran  número  de  moléculas  

Clonación:  
Génica  
o  
Por  PCR  
¿Qué  es  una  Genoteca?  

Biblioteca  de  genes  

 Genoteca  Genómica  

La   información   guardada   en   estas  

genotecas   incluye   tanto   las  
regiones   codificantes   como   las   no  
codificantes,   por   lo   que   la   mayor  
p a r t e   d e   e s t o s   f r a g m e n t o s  
contendrán  intrones.  
 Genoteca  de  cDNA  

ConJene  los  “genes”  que  se  

están  expresando  en  el  
momento  de  obtener  el  RNA  a  
parJr  del  que  se  sinteJza  el  
cDNA  por  transcripción  inversa.  
 Preparación  de  la  Genoteca  
v Aislar  el  DNA  
v Cortar   en   segmentos   con   enzimas   de  
restricción   para   obtener   los   insertos:   si   es  
mRNA  sinteJzar  cDNA  
v Ligación  al  vector  
v Introducir  en  la  célula  huésped  
v Análisis  y  almacenamiento  
¿Cómo  idenJficamos  un  clon  que  
conJene  un  gen  de  interés  en  una  
genoteca?  
 Genoteca  
Genoma  

¿Qué  plásmido  conJene  el  gen  de  interés  y  cómo  podemos  verlo?  
Genoteca  
Cada   clon   ocupa   un   lugar  
específico  en  la  placa  
  La  lógica  de  cribar  una  genoteca  
El  cribado  es  un  compromiso  entre:  
§  Tamaño  del  genoma  (cuanto  mayor  es  el  
tamaño  más  colonias  hay  que  cribar)  

§  Tamaño  del  inserto  (cuanto  mayor  es  el  

tamaño  del  inserto  menor  numero  de  colonias  
hay  que  cribar)  
 ln  (1-­‐P)  
N=  
ln  (1-­‐   I   )  
TG  

N=  número  de  clones  que  hay  que  cribar  

P=  Probabilidad  
I=  tamaño  del  inserto  
TG=  Tamaño  del  genoma  
TIPO  DE  LIBRERÍA                          VECTOR                              INSERTO  MÁXIMO  
 
                                                                                       plásmido                                                  <  10  Kb  
cDNA    
                                                                                             fago                                                                    23  Kb  
 
                                                                                         cósmido                                                          45  Kb  
 
Genómica                                                            BAC                                                                350  Kb  
 
                                                                                               YAC                                                            1000  Kb      
 
Hibridación  
Concepto  de  Hibridación    
Principios  básicos  
¿Qué  podemos  u,lizar  como  sonda?  
 
Normalmente:  
 
u Un  oligonucleóJdo  (una  cadena  corta  de  DNA  
monocatenario,  sinteJzada  por  nosotros  que  
hibrida  con  nuestro  objeJvo)  
u Una  sonda  de  cDNA  (fragmento  de  DNA  
mayor,  bicatenario)  
u Un  anJcuerpo  (la  genoteca  debe  ser  de  
expresión)  
Ejemplo:  

Estamos  interesados  en  una  proteína  (P450)  que  metaboliza  

drogas  anJ-­‐HIV  
 
Hemos  purificado  una  proteína  de  50  kDa  que  posee  la  acJvidad  
de  metabolizar  la  droga  (y..  Estamos  bastantes  seguros  que  es  la  
proteína  correcta)  
 
Secuenciamos  el  extremo  amino  terminal  Nt  de  la  proteína  
La  secuencia  que  obtenemos  es:  
MALIPDLAEWQ  ????      Ilegible……  
 
Queremos  saber  la  secuencia  completa  de  la  proteína  y  obtener  el  
cDNA  para  manipularlo  
No  secuenciamos  proteínas  porque  técnicamente  es  algo  mucho  
mas  complejo  que  secuenciar  ácidos  nucleicos  
 
Deducimos  la  secuencia  de  aas  a  parJr  de  la  secuencia  de  cDNA  
 
Necesitamos  clonar  el  cDNA  de  P450  
 
¿qué  hacemos?  
 
1.  Una  genoteca  de  cDNA  de  un  tejido  donde  se  exprese  mucho  
P450  (si  la  canJdad  de  proteína  es  alta  parece  lógico  pensar  
que  la  canJdad  del  mRNA  correspondiente  también  lo  será)  
2.   Cribamos  la  genoteca  con  -­‐un  oligonucleóJdo  
                   -­‐un  anJcuerpo  
Usamos  el  código  genéJco  para  diseñar  
oligonucleóJdos  para  el  cribado  
Autorradiograoa  con  
clones  posiJvos  
 Aplicaciones  de  la  hibridación  de  ácidos  
nucleicos  El  Blot  

La   transferencia   (blot)   e  
hibridación   usando   la   técnica  
d e   S o u t h e r n   p e r m i t e  
i d e n J fi c a r   s e c u e n c i a s  
específicas.    
Si   lo   que   se   detectan   son  
RNAs  se  llama  Northern  blot  
Si  el  blot  es  de  proteínas  y  se  
detecta   con   anJcuerpos   se  
llama  Western  blot  
Aplicaciones  de  la  hibridación  de  ácidos  
nucleicos  Northern  blot  
Hibridación  in  situ  
 Clonaje  direccional  
Evita  la  autoligación  y  permite  colocar  el  inserto  
en  una  orientación  determinada  
•  Se   puede   hacer   usando   dos   enzimas   de  
restricción  disJntas  en  el  vector  
•  El   DNA   a   clonar   hay   que   cortarlo   con   las   dos  
mismas  enzimas  de  restricción  
•  El  DNA  así  sólo  se  puede  insertar  en  una  sóla  
dirección  
  PCR  como  alternaJva  a  las  genotecas  
 ¿Qué  es  la  PCR?  
 
La   reacción   en   cadena   de   la   polimerasa   (PCR:  
polymerase   chain   reac6on)   es   una   técnica   de  
amplificación  de  secuencias  de  DNA  in  vitro  
Reacción  en  cadena  de  la  Polimerasa  
 Pasos  en  la  PCR  
Klenow   Taq  polimerasa  
•  Desnaturalización   •  Desnaturalización  
100ºC   95ºC  
•  Unión  cebadores  y   •  Unión  cebadores  
polimerización   •  (45-­‐55ºC)  Tm  
•  37ºC   •  P o l i m e r i z a c i ó n  
72ºC  
Comparación  entre  Klenow  y  Taq  polimerasa  
Saiki  et  al.  Science  (1988)  239:  487  
Nuevas  DNA  polimerasas  termoestables  
Plásmidos  usados  en  clonación  de  
productos  de  PCR  
 Aplicaciones  

•  En  Biología  Molecular  (site-­‐directed  mutagenesis,  differenJal  

display,  genotecas  sustracJvas)  
•  En   Biotecnología   (detección   rápida   de   animales   y   plantas  
transgénicos)  
•  En  GenéJca  de  poblaciones  y  evoluJva  (cartograoa  de  genes,  
detección  de  genoJpos  y  evolución)  
•  Detección  de  mutaciones  y  translocaciones  cromosómicas  
•  Salud  pública  y  veterinaria  
•  Microbiología  
•  Medicina  forense  
•  Antropología  y  Geología  
 Variantes  de  la  PCR  
•  Hot  Start  
•  Time-­‐release  PCR  
•  Touch  down  
•  RT-­‐PCR  
•  Amplificación  asimétrica  (con  un  solo  primer)  
•  Amplificaciones  múlJples  (MulJplex)  
•  Amplificación  cuanJtaJva  
•  Amplificación  in  situ  
•  Amplificación  fiel  
•  Amplificación  de  varias  kilobases  
•  Amplificación  de  regiones  diociles  (Tª,  DMSO)  
Tª    de  fusión  de  oligonucleóJdos  (tm)  
La  ecuación  más  simple  es  la  regla  de  Wallace  
 
Tm=  2  (A+T)  +  4  (G+C)  
 
 
Para  oligos  mayores  de  50  nucleóJdos    
 
Tm=  81,5  +  16,6  log  M  +  41  (XG+  XC)-­‐500/L-­‐0,62  F  
 
M  fracción  molar  de  caJones  monovalentes  
XG  y  XC  fracciones  molares  de  Gy  C    
L  longitud  de  la  cadena  mas  corta  en  el  duplex  
F  concentración  de  formamida  
 
  AutomaJzación  del  ciclado  de  las  
temperaturas  

30 ciclos

95
Temperatura

72
1 min.
55
(ºC)

1 min.
1 min.
OpJmización  de  la  PCR  
 Factores  que  afectan  el  rendimiento  de  la  
PCR  
•  Termociclador  
•  Pureza  del  DNA  
•  Diseño  de  oligos  
•  Almacenamiento  de  oligos  
•  DNA  polimerasa  
•  Cloruro  de  magnesio  
•  Perfil  de  los  ciclos  de  amplificación  
•  Contaminaciones  cruzadas  
 Rendimiento  extracción  DNA  en  
tejidos  humanos  

Fuente  de  DNA   Can,dad  de  par,da   Rendimiento  

Sangre   30  µl   0.5-­‐1  µg  
Suspensiones  celulares   5  105  células   2-­‐5  µg  
Células  bucales   Lavado  bucal   0.1-­‐1  µg  
semen   30  µl   5-­‐10  µg  
Raíz  de  pelo   1  raiz   10-­‐200  ng  
Bloque  de  tejido   50  mg   0.1-­‐10  µg  
CaracterísJcas  de  un  buen  primer  
•  Una   temperatura   de   fusión   Tm   en   el   rango  
entre  52ºC  y  65  ºC  
•  Que  no  Jenda  a  la  formación  de  dímeros  
•  Que  no  forme  horquillas  (>  3pb)  
•  Que  no  se  una  en  siJos  secundarios  
•  Baja   afinidad   específica   en   el   extremo   3´(bajo  
contenido   en   GC   para   evitar   exceso   de  
afinidad  no  complementaria)  
 Longitud  del  oligonucleóJdo    

La   longitud   de   un   oligonucleóJdo   influye   en   su  

especificidad   y   temperatura   de   hibridación.   Cuanto  
más   largo   sea   mayor   será   su   especificidad   pero  
también  su  temperatura  de  hibridación.  
El  primer  tendrá  como  mínimo  15  bases  para  asegurar  
su   especificidad.   Normalmente   están   en   el   rango   de  
17-­‐28  bases  de  longitud  
 Composición  de  bases  
La   composición   de   bases   afecta   a   la   especificidad   de   la  
hibridación  así  como  a  la  temperatura  
La   composición   aleatoria   de   bases   es   lo   mejor.   Evita   primers   con  
secuencias  como:  GCGCGC  o  ATATAA  
Un   contenido   de   (G+C)   en   el   rango   de   50-­‐60%,   nos  
proporcionará   una   buena   temperatura   de   hibridación   que  
proporcionará  la  suficiente  estabilidad  a  la  hibridación  
 Estructura  interna  
Si  los  primers  son  complementarios  entre  sí,  y  se  hibridan  entre  
ellos  en  lugar  de  hibridarse  con  el  DNA  muestra,  la  eficiencia  de  
la  PCR  se  verá  afectada  drásJcamente  
Hairpin  

Dímeros  (intra  o  inter  primer)  

 ¿Cúando  un  oligonucleóJdo  es  un  
buen  primer?  
5´   3´  
ü     
5´   3´  

ü     

5´   3´  

ü     
5´   3´  

X  
 Criterios  para  diseñar  un  primer  
1.  Especificidad:  asegurar  que  la  secuencia  complementaria  
sea  única  
2.  Longitud:  17-­‐25  bases  
3.  Composición  de  bases:  contenido  promedio  (G+C)  en  el  
rango  50-­‐60%.  Evitar  regiones  ricas  en  A+T  y  en  G+C  
4.  OpJmizar  el  emparejamiento  de  bases  
5.  Tm  en  el  rango  55-­‐70ºC  
6.  La  Tm  de  los  dos  primers  no  debe  diferenciarse  más  de  
2-­‐3ºC  entre  sí  
7.  Minimizar  la  posible  formación  de  estructuras  secundarias:  
horquillas  y  dímeros    
 Diseño  de  primers  usando  plataformas  

Algunas  plataformas  disponibles:  

•  Oligo:  Life  Science  So~ware  
•  GCG:  Accelrys  
•  Primer3:  aplicación  web  
•  BioTools  
•  Otros.  GeneFisher,  Primer1,  Web  Primer,  NCBI  
oligo  program  
OpJmización  de  la  técnica  
PCR  anidada  (nested  PCR)  
 Aplicaciones  
•  Clonaje  de  genes  
•  DiagnósJco  
•  Evolución  molecular  
•  CuanJficación  de  mRNAs  
•  Secuenciación  
•  Localización  de  RNA  in  situ  
•  Forense  
•  Otras