FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO BIOQUÍMICA

Alumno: ___________________________________________ Código: _________________

Alumno: ___________________________________________ Código: _________________

Práctica 7: VALORACIÓN DE GLUCOSA Y ACIDO LACTICO EN SUERO Y/O PLASMA

OBJETIVOS:

• Determinar por espectrofotometría el contenido de la glucosa en suero y/o en plasma

sanguíneo humano y/o de cordero.

• Determinar por espectrofotometría el contenido de lactato en suero y/o en plasma

sanguíneo humano y/o de cordero.

1. FUNDAMENTO TEÓRICO

Experimento 1A: Valoración de glucosa en suero o plasma por el método GOD/POD.

La glucosa es la principal fuente de energía en los seres vivos. Por tal razón es un metabolito
fundamental en los procesos biológicos.

La determinación cuantitativa de este bio-compuesto, ha sido objeto de muchos estudios y la

literatura ofrece diversas técnicas de análisis que varían de acuerdo con diferentes factores
como la naturaleza de la muestra, los contenidos de glucosa y la viabilidad experimental.

Uno de los métodos, utilizado actualmente a nivel clínico y de investigación, para valorar
glucosa en el plasma y/o suero sanguíneos es el enzimático colorimétrico desarrollado por
®
Bayer, conocido como SERA-PAK PLUS para glucosa, en el que la glucosa presente en el
suero o plasma sanguíneo, es transformada por la glucosa oxidasa (GOD) en ácido glucónico y
peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ), el cual en presencia de peroxidasa (POD) oxida el cromógeno
4-aminoantipirina/fenol convirtiéndolo en un compuesto de color rojo que absorbe entre 492 y
550 nm, con un pico de máxima absorbancia a 500 nm.

Experimento 1B: Valoración de Lactato en suero y/o plasma por el método

enzimático colorimétrico.

El L-Lactato es uno de resultados netos de la glucolisis anaerobia producida en el músculo

esquelético activo. El L_Lactato és metabolizado en el hígado. El NADH és producido en la
glucólisis en los tejidos por oxidación aeróbica. Si no hay presencia suficiente de oxígeno para
que se produzca esta oxidación, se regenera NAD+ a partir de NADH en la
reducción de piruvato a lactato Una concentración incrementada de lactato en la sangre es así
un indicador de metabolismo anaeróbico hecho que se da, por ejemplo, si disminuye el flujo de
sangre a los tejidos y el suministro de oxígeno es insuficiente. En casos de reducciones de
oxígeno severas, podría darse la “Acidosis Láctica”. El L-Lactato
por lo tanto se puede utilizar como un indicador de fallo circulatorio severo.
La concentración de L-Lactato en la muestra se determina de acuerdo a la siguiente reacción.

Lactato Oxidasa

L-Lactato + O2 piruvato + H2O2

 Peroxidasa

H2O2 + 4-aminoantipirina + TOOS Producto púrpura + 4H2O

TOOS = N-etil-N-(2 hidroxi-3-sulfopropil) m-toluidina

El producto purpura se puede monitorear a 550 nm y su concentración va a ser proporcional a

la concentración de lactato en la muestra.

2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA

2.1 Normas de seguridad

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.

2.2 Equipos de protección personal

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

• Bata de laboratorio
• Guantes de nitrilo
• Gafas de seguridad
Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su
intercambio con los demás compañeros de laboratorio.

2.3 Manejo de Residuos químicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por ello el
estudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los
cuales están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.

2. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no

controladas y potencialmente peligrosas.

No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la
práctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le
indicará la forma correcta de hacerlo

3. TRABAJO INTEGRADO DE LABORATORIO

Consultas previas.

Consulte:

1 Composición promedio de la sangre humana.

2 Niveles normales de glucosa y lactato en sangre humana.

3 Niveles de riesgo de glucosa y lactato en sangre humana.

4 Enfermedades asociadas a los niveles altos de glucosa y lactato en sangre.

5 Enfermedades asociadas a los niveles bajos de glucosa en sangre.

6 Fuentes endógenas de glucosa y lactato.

7 Fuentes de exógenas de glucosa y lactato.

8 El estudiante debe elaborar las tablas de datos con base en los procedimientos, para
su uso durante la práctica.

4. METODOLOGIA

4.1 MATERIALES

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

ITEM Cantidad
Termostato 8
Micropipetas de 100 y 1000 μL 1 c/u
Gradilla 1
tubos de ensayo (16 x 125 mm) 16
Pipeta graduada de 5 mL 2
Gotero de vidrio 1
Propipeta 1
Vaso de precipitados 25 mL 2
Celdas de para espectrofotómetro (plásticas) “de 4
microlitro” y con paso de luz hasta el fondo
Jeringas de 5 mL 2 por grupo

4.2 REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

Reactivos Cantidad
Estándar de Glucosa 0,14 mL
Estándar de Lactato 0,14 mL
SERA PAK para glucosa 14,4 mL
SERA PAK para lactato 14,4 mL

4.3 EQUIPOS

Tabla 3. Listado de Equipos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

Equipos Cantidad
Espectrofotómetro 2 por grupo
Centrifuga 1 por grupo

4.4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Método 1: Valoración de glucosa en suero o plasma por el método GOD/POD.

Sacar el kit de la nevera y dejarlo a temperatura ambiente por lo menos 30 minutos antes de
utilizarlo.

En cuatro tubos de ensayo, limpios y secos, marcados como blanco, estándar, suero y plasma,
proceder según la secuencia de la siguiente tabla.
Tabla de procedimiento: Determinación de glucosa

TUBO
BLANCO ESTÁNDAR SUERO PLASMA
SECUENCIA – SOLUCIÓN
O ®
1 Reactivo SERA-PAK PLUS,para 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
glucosa
O
2 Agua destilada 10 uL - - -
O
3 Estándar - 10 uL - -
O
4 Muestra - - 10 uL 10 uL
O o
5 Mezclar bien e incubar a 37 C por 10 minutos
O
6 Leer absorbancia a 500nm en celda de 1 cm de paso de luz, el color es estable mínimo
1hora

Método 2: Valoración de lactato en suero y/o plasma por el método enzimático

colorimétrico.

En cuatro tubos de ensayo, limpios y secos, marcados como blanco, estándar, suero y plasma,
proceder según la secuencia de la siguiente tabla.

Tabala de procedimiento: Determinación de lactato

TUBO
BLANCO ESTÁNDAR SUERO PLASMA
SECUENCIA – SOLUCIÓN
O ®
1 Reactivo SERA-PAK PLUS 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
O
2 Agua destilada 10 uL - - -
O
3 Estándar - 10 uL - -
O
4 Muestra - - 10 uL 10 uL
O o
5 Mezclar bien e incubar a 37 C por 5 minutos
O
6 Leer absorbancia a 550nm en celda de 1 cm de paso de luz, el color es estable mínimo
1hora

5. RESULTADOS Y ANÁLISIS PRELIMINAR DE RESULTADOS.

Experimento 1: Valoración de glucosa y lactato en plasma y suero.

Método 1: Valoración de glucosa en suero o plasma por el método GOD/POD.

1 Realizar los cálculos correspondientes, según:

1.1 Glucosa en mg/dL = ABSORBANCIA DE LA MUESTRA x 100 mg/dL

ABSORBANCIA DEL ESTÁNDAR

1.2 Glucosa en mmol/dL= ABSORBANCIA DE LA MUESTRA x 5.56 mmol/L

ABSORBANCIA DEL ESTÁNDAR

1.3 Glucosa en g/dL = ABSORBANCIA DE LA MUESTRA x 1 g/L

ABSORBANCIA DEL ESTÁNDAR

1.4 Analizar los resultados obtenidos, por comparación con los niveles promedio de
glucosa consultados para el preinforme, y establecer si hay alguna condición de enfermedad y
de que clase.
1.5 Plantear todas las ecuaciones químicas de las reacciones en las que se fundamenta el
análisis.

1.6 Consultar sobre las familias de enzimas a las que pertenecen las enzimas empleadas
por este método.

1.7 Complementar según las instrucciones adicionales del docente.

Método 2: Valoración de lactato en suero y/o plasma por el método enzimático

colorimétrico.

2.1 Calcular el contenido de colesterol, según las siguientes ecuaciones:

Lactato en mg/dL = ABSORBANCIA DE LA MUESTRA x 40mg/dL

ABSORBANCIA DEL ESTÁNDAR
Lactato en mmol/dL = ABSORBANCIA DE LA MUESTRA x4.4 mmol/L
ABSORBANCIA DEL ESTÁNDAR

Lactato en g/dL = ABSORBANCIA DE LA MUESTRA x 0,4 g/L

ABSORBANCIA DEL ESTÁNDAR

2.2 Analizar los resultados obtenidos, por comparación con los niveles promedio de Lactato
consultados previamente, y establecer si hay alguna condición de enfermedad y de que clase.

2.3 Plantear todas las ecuaciones químicas de las reacciones en las que se fundamenta el
análisis.

2.4 Consultar sobre las clases y subclases de enzimas a las que pertenecen las enzimas
empleadas por este método.

2.5 Complementar según las instrucciones adicionales del docente.

PRECAUCIONES:
 Sólo para diagnóstico in vitro. No pipetear con la boca.
 Ejecutar las precauciones normales requeridas para el manejode reactivos de
laboratorio.
 La solución R1a contiene Azida Sódica. Evitar su ingestión o elcontacto con la piel o las
membranes mucosas. En caso de contacto con la piel, lavar la zona afectada con
abundante agua. En caso de contacto con los ojos o ingestión, buscar atención médica
inmediatamente.
 La Azida Sódica reacciona con el plomo y cobre de las cañerías, formando ácidos
potencialmente explosivos. Asi que utilizar un frasco de desechis para eliminar las
sustancias, NO VERTER LAS SOLUCIONES DE DESECHO POR LAS CAÑERIAS.

 UTILIZAR GUANTES.

6.REFERENCIAS
1. Shimojo N et al, CLIN CHEM 1989; 35(9): 1992 - 1994.
2. Shimojo N, Fujino K et al, CLIN CHEM 1991; 37(11) 1978
- 1980.
3. Lehninger Al: Principles of Biochemistry, Worth Publishers,
New York, 2010, p 416.
4. Mascini M et al, CLIN CHEM. 1987; 34(4) 591 - 593.
5. Jacobs DS, Kasten BL, Demott WR and Wolfson WL:Laboratory Test Handbook, LEXI
COMP INC, OHIO,1990, p. 245.