MODELOS METABÓLICOS A ESCALA GENÓMICA COMO HERRAMIENTAS PARA DISEÑO DE MEDICAMENTOS Y

MEDICINA PERSONALIZADA

Abstracto
En este trabajo nuestro objetivo es mostrar cómo Genome Scale Metabolic Models (GSMMs) se pueden utilizar como
herramientas para el diseño de fármacos. Al comparar las estructuras químicas de los metabolitos humanos (obtenidos
usando sus índices KEGG) y los compuestos contenidos en la base de datos de DrugBank, hemos observado que los
compuestos que muestran puntuaciones de Tanimoto superiores a 0,9 con un metabolito tienen 29,5 veces más
probabilidades de unirse a las enzimas que metabolizan el se considera metabolito, que los ligandos elegidos al azar.
Mediante el uso de datos RNA-seq para restringir un GSMM humano es posible obtener una estimación de su distribución
de flujos metabólicos y cuantificar los efectos de restringir la tasa de reacciones metabólicas elegidas (por ejemplo,
utilizando un fármaco que inhibe las enzimas que catalizan las mencionadas reacciones). Este método nos permitió
predecir los efectos diferenciales de los análogos de la lipoamida en la proliferación de células MCF7 (una línea celular de
cáncer de mama) y ASM (músculo liso de las vías respiratorias), respectivamente. Estos efectos diferenciales se
confirmaron experimentalmente, lo que proporciona una prueba de concepto de cómo se podrían utilizar los GSMM
humanos para encontrar ventanas terapéuticas contra el cáncer. Mediante el uso de datos RNA-seq de 34 líneas celulares
de cáncer diferentes y 26 tejidos sanos, se evaluaron los efectos putativos contra el cáncer de los compuestos en DrugBank
que son estructuralmente similares a los metabolitos humanos. Entre otros resultados, se predijo que la vía del
mevalonato podría constituir una buena ventana terapéutica contra la proliferación del cáncer, debido a que la mayoría
de las líneas celulares cancerosas no expresan el transportador de colesterol NPC1L1 y la lipoproteína lipasa LPL, lo que
los hace depender de la vía del mevalonato para obtener colesterol.

Introducción
Predecir qué ligandos se unen a una proteína en particular y modificar su actividad es un paso fundamental en el diseño
de fármacos, que generalmente se resuelve mediante el acoplamiento molecular [1]. La estructura de los ligandos ya
conocidos se puede utilizar como plantilla para mejorar la predicción de las interacciones fármaco-diana [2, 3]. Las enzimas
son dianas farmacológicas importantes [4] para las cuales ya se conocen algunos ligandos (sus sustratos naturales) y, por
lo tanto, son particularmente adecuados para el diseño de fármacos basados en estructuras. La suposición de que las
moléculas con estructura similar al sustrato natural de una enzima encajan en el mismo sitio de unión que el sustrato, lo
que lleva a una inhibición competitiva de la enzima, también puede usarse para inferir posibles efectos inhibidores de
fármacos ya existentes sobre enzimas diferente de sus objetivos originales, lo que permitiría el llamado reposicionamiento
o reutilización de drogas [5]. Esto es particularmente útil cuando se trata del uso de medicamentos aprobados para tratar
nuevas enfermedades, evitando muchos de los ensayos clínicos y preclínicos necesarios para un nuevo compuesto. Aquí
mostramos (como era razonable esperar) que los fármacos con un puntaje de Tanimoto superior a 0,9 con respecto a un
determinado metabolito humano tienen 29,5 veces más probabilidades de unirse a enzimas que tienen este metabolito
como sustrato que un fármaco elegido al azar. Algunos medicamentos que imitan metabolitos naturales (conocidos como
antimetabolitos) se han usado durante mucho tiempo como medicamentos contra el cáncer (por ejemplo, los
medicamentos que imitan la estructura de los folatos interfieren con la síntesis de ADN y perjudican el crecimiento
celular). El análisis realizado aquí reveló los supuestos efectos anticancerígenos de los compuestos que actualmente no se
usan como fármacos contra el cáncer.
Los efectos de un medicamento sobre un paciente y una enfermedad en particular no solo se reducen a su interacción
con sus objetivos, sino que deben verse en el contexto de la célula completa. El efecto de inhibir la actividad de una enzima
particular sobre un determinado fenotipo de enfermedad depende de las actividades de muchas otras enzimas que
forman una red compleja de reacciones metabólicas en la que los productos de una reacción son los sustratos de otros.
Por lo tanto, la respuesta a un determinado fármaco puede ser muy diferente en diferentes pacientes (o en diferentes
tipos de células), lo que conduce al campo emergente de la medicina personalizada y la elección personalizada de fármacos
[6]. Los diferentes efectos de un medicamento sobre diferentes tipos de células, dependiendo de la actividad de toda la
red metabólica, también están relacionados con la existencia de las llamadas ventanas terapéuticas, que es la posibilidad
de causar daño en un tipo de célula particular (como células tumorales) mientras minimizando los efectos negativos en
las células sanas. La búsqueda de ventanas terapéuticas adecuadas es un problema particularmente importante en el
cáncer y el interés en las enzimas metabólicas como ventanas terapéuticas está aumentando rápidamente [7]. Las
herramientas especialmente adecuadas para tratar los problemas mencionados (diseño de fármacos, reutilización de
medicamentos, medicina personalizada y búsqueda de ventanas terapéuticas) son los Modelos Metabólicos de Escala del
Genoma (GSMM).
Los GSMM [8, 9] son compilaciones exhaustivas de todas las reacciones metabólicas que tienen lugar en un organismo.
Cada una de las reacciones está asociada con una o más enzimas que están codificadas por genes específicos. Por lo tanto,
se establece una conexión directa de reacción gen-proteína, que es una característica importante de los GSMM. Teniendo
en cuenta los coeficientes estequiométricos de las diferentes reacciones en la red, es posible establecer una matriz
estequiométrica, que es una representación matemática que proporciona información cuantitativa sobre cómo los
diferentes metabolitos están vinculados a cada reacción en la red. Si se supone que las concentraciones de todos los
metabolitos internos están en estado estable, lo que es una suposición razonable debido a la rápida renovación de los
metabolitos intracelulares, es posible restringir los flujos a un espacio de distribuciones de flujo factibles y evaluar las
capacidades metabólicas de la célula (por ejemplo, su capacidad para sintetizar bloques de construcción de biomasa).
GSMM se han aplicado al estudio del cáncer y otros aspectos del metabolismo humano siguiendo diferentes enfoques [10
- 12]. Muchos de esos enfoques consisten en la generación de modelos específicos de tejido mediante la integración de
expresión génica, proteómica, metabolómica y otros datos de alto rendimiento [11, 13]. Los modelos específicos de células
o tejidos generalmente se presentan como un subconjunto del metabolismo humano total, que está activo en el tejido o
célula de interés. Cada reacción metabólica humana se presenta como presente o ausente, y no se incorpora información
cuantitativa sobre las velocidades de reacción en los modelos. Otro enfoque (el método PRIME) consiste en establecer
límites máximos para un conjunto de velocidades de reacción, basado en microarrays de expresión génica [14]. Aquí
usamos los datos RNA-seq para imponer límites de velocidad máxima en todas las reacciones en el modelo. Una vez que
el modelo está restringido según los datos de RNA-seq de un tipo de célula particular, cuantificamos los efectos de la
disminución del flujo a través de las reacciones dirigidas por un determinado fármaco en una función objetivo, que en
este caso es la capacidad de producir biomasa. bloques para la proliferación celular (la proliferación celular descontrolada
es una de las principales características del cáncer). Este enfoque se ha utilizado para identificar los medicamentos que
figuran en la base de datos de DrugBank [15] que supuestamente son capaces de alterar el crecimiento de las líneas
celulares cancerosas mientras mantienen sus efectos en los tejidos sanos lo más limitados posible. También hemos
demostrado experimentalmente que los análogos de lipoamida tienen un efecto diferencial sobre la línea celular de cáncer
de mama MCF7, en comparación con las células ASM (músculo liso de las vías respiratorias) sanas, que se predijo in silico
a partir de los perfiles RNA-seq.

Resultados
Similitud de estructura como una guía para predecir la unión de drogas y enzimas
Se utilizó un GSMM humano actualizado [16] para obtener una lista de metabolitos humanos con identificadores KEGG
[17]. En base a sus identificadores KEGG, se obtuvieron 1475 estructuras químicas diferentes de metabolitos humanos.
También se obtuvieron estructuras químicas para cada fármaco en DrugBank [15] y se calcularon las puntuaciones de
Tanimoto utilizando huellas dactilares FP4 para cada par de metabolitos usando el software OpenBabel [18]. Se extrajo
un conjunto de 4231 pares de fármaco-metabolito con puntuaciones de Tanimoto superiores a 0,9 para un análisis
posterior (excluyendo los casos triviales en los que el compuesto de DrugBank y el metabolito eran idénticos). Los números
EC para los objetivos de cada fármaco y para las enzimas asociadas a cada metabolito se extrajeron de DrugBank y KEGG
respectivamente. En 2817 casos, tanto el fármaco como el metabolito tenían al menos un objetivo informado. Para 644
pares, al menos uno de los objetivos se compartió entre el fármaco y el metabolito, que es el 23% del total de pares con
puntuaciones de Tanimoto superiores a 0,9. Como control, extrajimos 4000 pares aleatorios de fármaco-metabolito sin
ninguna restricción en sus puntajes de Tanimoto y arrancamos este procedimiento 1000 veces (S1 Fig). En promedio, en
el 1% de los casos, tanto el fármaco como el metabolito habían informado objetivos compartidos. Una prueba exacta de
Fisher resultó en un valor p de 2.2e-16 y una razón de probabilidad de 29.5. Por ejemplo, la 7,8-dihidrobiopterina se
describe en DrugBank como un inhibidor de la enzima dihidroneopterin aldolasa, que cataliza la conversión de su análogo
7,8-dihidroneopterina en 6-hidroximetil-7,8 dihidropterina y glicolaldehído (Fig. 1).

Integración de datos de RNA-seq con GSMM para predecir fenotipos

Los GSMM pueden usarse para predecir cualquier fenotipo que pueda estar relacionado con la velocidad de producción o
consumo de uno o varios metabolitos. En particular, el crecimiento celular se puede describir como la tasa de ensamblaje
de bloques de construcción de biomasa en macromoléculas (aminoácidos en proteínas, por ejemplo). Esto se describe en
los modelos mediante la llamada "ecuación de biomasa", que refleja las proporciones relativas en las que se agregan
diferentes bloques de construcción de biomasa a la biomasa. La predicción de las distribuciones del flujo metabólico real
requeriría conocer la cinética de cada reacción metabólica y otros parámetros fuera del metabolismo, como las
concentraciones de ribosomas, las tasas de síntesis de proteínas, etc. El número de parámetros que se ajustarán de los
datos experimentales es demasiado grande para cualquier intento realista describir las distribuciones de flujo metabólico
cinéticamente de células enteras, lo que hace necesarias algunas suposiciones aproximadas. Suponemos que la velocidad
máxima de reacción de una reacción metabólica es proporcional a la abundancia de la enzima que cataliza esta reacción,
que a su vez es proporcional a la abundancia del transcrito que codifica la enzima. Las constantes de proporcionalidad
pueden ser muy diferentes para cada reacción, sin embargo, las consideraremos iguales. Esta suposición está lejos de la
realidad, pero todavía es capaz de captar el hecho de que los aumentos en la expresión de un gen pueden dar como
resultado un mayor flujo máximo a través de las reacciones catalizadas por sus productos genéticos. La constante de
proporcionalidad se ajustó a 0.027 mmol g-DW-1h-1 para un nivel de expresión de 10 RPKM. Esta constante se eligió para
ajustarse a la tasa de crecimiento experimental de la línea celular A549. Antes de configurar cada restricción, los niveles
de expresión (en RPKM) se redondearon al siguiente múltiplo de 10. Esta resultó ser una forma eficiente de evitar
problemas numéricos al realizar la optimización lineal. Para reacciones con varias enzimas, se eligió el nivel de expresión
como el de la enzima más abundante. Después de restringir cada reacción en el modelo basado en la expresión génica de
sus enzimas asociadas, el valor máximo de la reacción de producción de biomasa (o cualquier otra reacción asociada a un
cierto fenotipo) se puede calcular por optimización lineal (ver Materiales y métodos). Para realizar los cálculos
mencionados, hemos escrito una biblioteca de Python (pyTARG), que está disponible en
https://github.com/SergioBordel/pytarG. Definimos como inhibición relativa la fracción por la cual disminuyen las tasas
originales de las reacciones afectadas por el medicamento (una inhibición relativa de 0.9 significa que la tasa es 0.1 veces
su valor original). La tasa de crecimiento relativo es la relación entre la tasa máxima de crecimiento con inhibición y la tasa
máxima de crecimiento sin inhibición. Un valor de 1 significa que la célula puede compensar completamente los efectos
de la droga mediante el uso de vías metabólicas alternativas para producir todos sus componentes de biomasa. Un
crecimiento relativo igual a uno menos la inhibición relativa significa que la célula no puede usar ninguna vía alternativa
para compensar los efectos del fármaco. Los valores intermedios significan que hay rutas metabólicas alternativas que la
célula puede usar, pero no son tan eficientes como las rutas a las que se dirige la droga. La inhibición relativa real de un
fármaco en un objetivo determinado dependería tanto de la concentración del fármaco como de su fuerza de unión al
objetivo. El problema de predecir esta inhibición relativa está fuera del alcance de este artículo. Aquí se modela solo el
impacto que una cierta inhibición relativa tendría sobre el metabolismo celular global.

Fig 1. Análisis del emparejamiento fármaco-metabolito. El panel superior muestra

los porcentajes de pares de fármaco-metabolito que comparten 1, 2, 3 o más
enzimas respectivamente para parejas con puntuaciones de Tanimoto superiores a
0,9 (izquierda) y pares aleatorios (derecha). El panel inferior ilustra el acoplamiento
de dihidroneopterin aldolasa (2DHN) con su metabolito natural 7,8-
dihidroneopterina (C04874, cian sticks) y su análogo estructural 7,8
dihydrobiopterin (DB04400, pink sticks).