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BlOMEDlCA

Vol. 6. NOS.1 y 2 - 1986

MEDIO SELECTIVO PARA EL AISLAMIENTO


DE MICOBACTERIAS
ZULMA YOLANDA ORJUELA*, LUIS CARLOS OROZCO VARGASY*

Se investigaron diferentes mezclas de antibiticos para producir un medio selectivo para aislar micobacterias, utilizando como base el medio
de Ogawa-Kudoh (O-K).
Se encontr que la mezcla penicilina-cido nalidixico-cicloheximida y
cristal violeta inhibian el mayor porcentaje de contaminantes.
La mayora de las especies de micobacterias tambin fueron inhibidas
parcial o totalmente a excepcin del M, tuberculosis.
INTRODUCCION
La contaminacin de los cultivos que se utilizan
para el aislamiento de micobacterias es un problema
frecuente, a pesar de que las muestras sufren un proceso de decontaminacin con soda y los medios de
cultivo contienen verde de malaquita (1).

MATERIALES Y METODOS

Medios Selectivos
Para la preparacin de los medios selectivos se tuvo
como base el medio de O-K ( 5 ) al cual se le agregaron
diferentes agentes selectivos (ver tabla 1).
TABLA No I

Debido a esta contaminacin, Lorian-Maddock (2),


Petran-Vera (3), Mitchison, Allen y Larnbert (4) entre
otros, han trabajado con medios selectivos, que son
medios de cultivo a los cuales se les agregan sustancias
que inhiben microorganismos diferentes al grmen que
se desea aislar. Con base en sus experiencias, hicimos
un estudio para determinar gn medio selectivo que
inhibiera los grmenes contaminantes ms comunes
encontrados en nuestro laboratorio, sin que se afectara
el desarrollo de las micobacterias.

CONCENTRAC~ON DE LOS AGENTES SELECT 1 VOS


EN LOS DIFERENTES MEDIOS

agentes selectivos

Se prepararon tres medios selectivos utilizando


como base el Ogawa-Kudoh (O-K) ( 5 ) y se sembraron
65 cepas de microorganismos aislados de cultivos contaminados y se compar el efecto inhibitorio de los
tres medios selectivos. Adems, se sembraron tambin
diferentes micobacterias para observar la inhibicin
que dichos medios podran ejercer sobre su crecimiento.

Inhibicin de los Grmenes Contaminantes en los Diferentes Medios Selectivos


Se tomaron cultivos contaminados provenientes de
muestras de pacientes y de medio ambiente se hicieron
aislamientos de los grmenes contaminantes en agar
chocolate y Sabouraud segn correspondiera.

* Bacteriloga rural Grupo de Micobacterias, Instituto Nacional de Salud.


**Jefe Gmpo de Micobacterias, Instituto Nacional de Salud.
Solicitud reimpresos: Luis Carlos Orozco Vargas, Apartado Areo No. 80334 INS. Bogot.

Z.Y. ORJUELA, L.C. OROZCO

TABLA No 2

M I CROORGAN I SMOS CONTAM I NANTES


ESTUD I ADOS SEGUN PROCEDENC I A
M I CROORGAN I SMOS CONTAM I NANTES
MUESTRAS

PACl ENTES
N = 52

Baci los
Cocos
Baci los
Esporul.
Grarn (t) Gram (t)Gram (-1

Bacilos
Gram ()'

17

12

15

19

12

13

18

MED l O AMB I ENTE M


N = 13
TOTAL

Mohos
Levad.

3C

= Orinas, iavados qa'stricos,

esputos,

etc.

3CW = Heces de cabra, peces & agua dulce.

TABLA

CONTAMI NANTES

No 3

ESTUD l ADOS Y SU INH I B I C I ON

POR LOS TRES MEDIOS SELECTIVOS

GERMENES
ESTUDIADOS
B.G. ( t )

1 B.G. ( t )E.

B. = Bacilos

I N H I B I D O S POR
OK A

19
1

12

C. = Cocos

11
5

OKg 1

(57.9)
(41.7)

E. = Esporulados
22

11
9

(57.9)
(75.0)

G. = Gram

OKs2
1

13

(68.4)

( 7 5 . O)

MEDIO SELECTIVO PARA EL AISLAMIENTO DE MICOBACTERIAS

De un total de 65 cepas, 52 correspondan a muestras de pacientes y 13 a muestras de medio ambiente


(ver tabla 2).
Una vez aislados, se sembraron por estrias en los
medios selectivos. Se incubaron a 37C y se hicieron
lecturas a las 24, 48, 72 horas y a los 8 y 15 das.

Inhibicin de las Micobacterias en los Medios Selectivos


Despus de conocer los resultados de la inhibicin
de los contaminantes, se seleccionaron los dos medios
que dieron mayor inhibicin para investigar su poder
inhibitorio sobre varias micobacterias cuya lista aparece en la tabla 4.

TABLA

N2

La tabla 3 muestra los porcentajes de inhibicin de


los tres medios selectivos sobre los diferentesmicroorganismo~contaminantes.
Las diferentes bacterias fueron inhibidas entre un
38.5% y un 83.3%, por los tres medios selectivos.
Las bacterias menos inhibidas fueron los cocos
Gram (+), las de mayor inhibicin, los bacilos Grarn

(-1.
Los tres medios inhibieron las tres cepas de mohos
y levaduras. El mayor porcentaje de inhibicin fue
dado por el OKB2, 73.8%, seguido por el OKB1,
70.7%.

Lo anterior llev a evaluar los medios OKBl y


OKB2 con relacin a las micobacterias.

M l COBACTER lAS ESTUD I ADAS Y SU


I N H l B l C l O N POR LOS MEDIOS
O K B i Y OKB2

NO

M ICOBACTERI A

M. bovis, var. BCG


M tuberculosis
!&. tuberculosis (H37 Rv)
M. simiae
M. kansasii
M . marinum
-M scrofulaceum
M: gordonae
Mais
M. g m
M intracelu l lare
M. ovium
M. fortuitum-chelonoe
M. vaccae
M. p w
M. aurum
M . dierhnoferi

RESULTADOS

3
3
I
I

3
3
I

2
I
I

1
I
10

2
2
l
1

6
-

INHIBIMS
90 o/'
( 100 %)

I
O
O
O
I
O
I

2
I

(1)
l
I
1 (3)
l (1)
2
I

En la tabla 4 se aprecian las cepas de micobactenas


que fueron investigadas para evaluar su posible inhibicin por los medios selectivos. Las nicas cepas que
no fueron inhibidas por los medios fueron M. tuberculosis, M. simiae, M. marinum y 6 cepas de M. fortuiium-chelonae.
Las dems fueron inhibidas en ms de un 90%.
Una cepa de M. gastri, 3 de M. foruitum-chelonae,
una de M. vaccae, una de M. dierhnofen' y dos M.
sp. fueron inhibidas totalmente.
Las micobacterias que fueron parcialmente inhibidas mostraron este fenmeno en una mayor proporcin
en el OKB2.
DISCUSION
En el aislamiento de micobacterias, la contaminacin de los cultivos ha preocupado a los investigadores. Es as, como a travs de los aos han venido
trabajando con sustancias selectivas que se agregan a
los medios de cultivo para inhibir rnicroorganismos
diferentes a las micobacterias. El verde de malaquita
ha sido el ms utilizado y est incluido en los medios
a base de huevo, Lowenstein Jensen (L-J), Petragnani
y Ogawa-Kudoh (O-M) (5).

Z.Y. ORJUELA, L.C. OROZCO

Rhines, en 1935 (6) utiliz cristal violeta a una


concentracin de 1.5 pglml. en medios slidos para
inhibir flora Gram (+) de muestras donde buscaba
aislar M. avium.
Ungar-Mugleton en 1946 (7) utilizaron penicilina
en diferentes medios de cultivo y encontraron que no
era txica para el M. tuberculosis.
Kirby-Dubos, en 1947 (8) comentaron que no se
debera agregar penicilina a medios que contengan
tween 80, pues segn sus experiencias el polisorbato
incrementa la sensibilidad delM. tuberculosis a la penicilina.
Gruft, en 1965 (9) realiz un estudio agregando
cido nalidixico a diferentes concentracionesa medios
de cultivo y encontr que a 35 pglml. no se afectaba
el crecimiento de las micobacterias y causaba una
buena inhibicin de los grmenes Gram (-).

el segundo, la diferencia observada est dada exclusivamente en el porcentaje de inhibicin de bacilos Gram
(+).

Al ser estos dos medios OKBl y OKB2 los que


dieron una mayor inhibicin de contaminantes, fueron
seleccionados para evaluar el efecto que tendran sobre
las micobacterias.
Aunque algunas de las posibles patgenas fueron
parcialamente inhibidas, slo 3 cepas de M. fortuitumchelonae lo fueron totalmente. Sin embargo, la inhibicin parcial fue ms evidente en el OKB2 que contena
mayor concentracin de penicilina (500 pglml.), lo
que sugiere que algunas especies de micobacterias
sean sensibles "in vitro" a concentraciones de penicilina de 500 pglml. en presencia de tween 80 o actuando
en forma sinrgica con las otras sustancias.

Aunque varios investigadores han utilizado mezcla


de sustancias inhibidoras, la mayorfa 10 han hecho en
medios que tienen como base el agar.

La cicloheximida utilizada en los tres medios selectivos inhibi las cepas de levadura y la cepa de mohos.
por Petran y Vera
Esta es la s ~ S t a n ~ ~ ~
(3), aunque algunos autores no encontraron dicha sustancia til (10).

Solamente Petran y Vera (3) utilizaron L-J como


base de su mezcla de agentes selectivos 10s cuales
incluan cido nalidixico, lincomicina y cicloheximida
a las mismas concentraciones utilizadas en el presente
estudio.

PO' lo anterior, creemos que 10s medios selectivos


pueden ser tiles cuando se intenta aislar M. tuberculosis, Pero no Parecen recomendables.cuando se Pretende aislar otras micobacterias.

Nuestro medio selectivo OKA, era similar al Micobactosel8 de Petran y Vera y contena cristal violeta
adems del verde de malaquita usual en el medio O-K.
A pesar de lo anterior, este medio di el menor
ndice de inhibicin de gCrmenes contaminantes. Esta
menor inhibicin fue ms aparente en los cocos Gram
(+) y bacilos Gram (+)E, lo que sugiere que la penicilina es ms activa que la lincomicina en la inhibicin
de los grmenes Gram (+) frecuentes como contaminantes, sin descartar la posibilidad de un fenmeno
de sinergismo con las otras sustancias porque el fenmeno, aunque en menor proporcin, tambin se observa con los bacilos Gram (-).
Al comparar la inhibicin en los medios OKBl y
OKB2, cuya nica diferencia es la concentracin de
penicilina 200 pglml. en el,primero y 500 pglml. en

Existe tambin la posibilidad de que la mezcla de


sustancias inhibitorias permita diferenciar entre algunas especies similares, en especial el grupo de fotogromgenos y el complejo fortuitum-chelonae.

Different mixtures of antibiotics were investigated


to produce a selective medium fqr the isolation of
mycobacteria, using Ogawa-Kudoh as the base medium.
It was founded that the mixture: penicillin-nalidixic
acid-cicloheximide and cristal polet inhibited the highest percentage of contaminants. Most of the species
of mycobacteria were also parcial or totally inhibited
except M. tuberculosis.

MEDIO SELECTIVO PARA EL AISLAMIENTO DE MICOBACTERIAS

l.

Orozco, L.C., et al. El cultivo de esputo para el diagnstico


de tuberculosis pulmonar, Biomdica 1985; 5 : 24-25.

2.

Lorian, V., Maddock. Tbe effect of anticontamination agents


in media for the isolation of mycobacteria. Dis. Ches. 1966;
50 : 630-632.

3.

Petran, E.I., Vera, H.D. Media for selective isolation of


mycobacteria, Health Lab. Sci. 1971; 8 : 225-230.

4.

Mitchison, DA, Allen, BW, Lambert, R.A. Selective media


in the isolation of tubercle bacilli from tissues. J. Clin Pathol,
1973; 26 : 250-252.

5.

Orozco, LC, et al. Tuberculosis - Manual de Procedimientos.


Pub. Cient. No. 1 1985.

6. Rhines, C. The persistente of avian tubercle bacilli in soil


and in association with soil microorganisms, J. Bacteriol,
1935; 29 : 299-3 11.
7.

Ungar, J., Muggleton, P. The effect of penicillin on the growth


of human type M. tuberculosis. J. Pathol Bacteriol, 1946; 58
: 501-504.

8.

Kirby, W.M.M., Dubos, R.J. Effect of penicillin on the tubercle bacillus in vitro. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1947; 6 6
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Gruft, H. Nalidixic acid as a decontaminant in L-J medium.


J. Bactenol, 1965; 9 : 829.

10. Corper, H.J., Cohn, M.L. Cycloheximide as a fungicide in


solid media for growing tubercle bacilli from sputum, Antibiot
Chemother (Basel), 1952; 2 : 12-15.

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