Microscopía óptica y preparación de muestras

Objetivos
Al completar este paquete de enseñanza y aprendizaje, debe:
 Apreciar las diferencias entre los microscopios de luz reflejada y de luz transmitida.
 Comprenda el uso de luz polarizada en un microscopio de transmisión.
 Ser capaz de configurar y usar un microscopio para estudiar una variedad de
especímenes.
 Comprenda los pasos necesarios para preparar especímenes metalográficos, cerámicos y
de polímeros.

Introducción
 Los microscopios ópticos tienen una amplia variedad de aplicaciones; son herramientas
muy poderosas para inspeccionar la microestructura de una gran variedad de
materiales. Es importante usar el modo apropiado para la muestra, eligiendo entre los
modos de luz reflejada o luz transmitida.
 La microscopía de luz reflejada se utiliza para una variedad de materiales, incluidos
metales, cerámicas y materiales compuestos. El contraste entre las diferentes regiones
cuando se ve con luz reflejada puede surgir de las variaciones en la topografía de la
superficie y las diferencias en la reflectividad (por ejemplo, de diferentes fases,
diferentes orientaciones del grano o regiones límite). Estas características se revelan
mediante una serie de técnicas de preparación de muestras que, cuando se llevan a
cabo con cuidado, pueden producir imágenes útiles de alta calidad.
 El modo de transmisión se puede usar cuando la muestra es transparente. El espécimen
usualmente tiene la forma de una rebanada delgada (por ejemplo, decenas de micras de
espesor). El contraste surge de las diferencias en la absorción de la luz a través de
diferentes regiones. Este método se utiliza para el examen de minerales y rocas, así
como gafas, cerámicas y polímeros. Además, el modo de transmisión a menudo se puede
mejorar aún más con el uso de luz polarizada.
 La microscopía de luz polarizada es un uso especializado del modo de transmisión, y el
contraste se debe a las diferencias en la birrefringencia y el grosor de la muestra. Esto
puede permitir la observación de los granos, la orientación del grano y el grosor.
 Preparación de la muestra

 Para metales
 Al preparar muestras para microscopía, es importante producir algo que sea
representativo de todo el espécimen. No siempre es posible lograr esto con una sola
muestra. De hecho, siempre es una buena práctica montar muestras de un material en
estudio en más de una orientación. La variación en las propiedades del material afectará
la forma en que se debe manipular la preparación, por ejemplo, los materiales muy
blandos o dúctiles pueden ser difíciles de pulir mecánicamente.

 Cortando una muestra

 Es importante estar alerta al hecho de que la preparación de una muestra puede cambiar
la microestructura del material, por ejemplo a través de calentamiento, ataque químico o
daño mecánico. La cantidad de daño depende del método por el cual se corta la muestra
y del material en sí.

 Cortar con abrasivos puede causar una gran cantidad de daños, mientras que el uso de
una sierra de diamante de baja velocidad puede causar menos problemas. Hay muchos
métodos de corte diferentes, aunque algunos se usan solo para tipos de especímenes
específicos.
 Montaje
 El montaje de especímenes suele ser necesario para permitir que se manipulen con
facilidad. También minimiza la cantidad de daño que probablemente cause la muestra en
sí.

 El material de montaje utilizado no debe influir en la muestra como resultado de una

reacción química o tensiones mecánicas. Debe adherirse bien a la muestra y, si la
muestra debe ser electropulida (un proceso electrolítico ) o examinarse bajo
un microscopio electrónico de barrido , entonces el material de montaje también debe
ser eléctricamente conductor.

 Las muestras pueden montarse en caliente (a alrededor de 200 ° C) utilizando una

prensa de montaje, ya sea en un plástico termoestable ( por ejemplo, resina fenólica)
o en un plástico termoestable ( por ejemplo , resina acrílica). Si el montaje en caliente
alterará la estructura de la muestra, se puede usar una resina de fraguado en
frío, p . Ej . resina epoxi, acrílica o de poliéster. Los materiales porosos deben
impregnarse con resina antes del montaje o pulido, para evitar que la arena, el medio de
pulido o el grabador se vean atrapados en los poros, y para preservar la estructura
abierta del material.

 Una muestra montada generalmente tiene un grosor de aproximadamente la mitad de su

diámetro, para evitar el balanceo durante la molienda y el pulido. Los bordes de la
muestra montada deben redondearse para minimizar el daño a los discos de pulido y
rectificado.

 Un diagrama de una muestra montada

 Molienda
 Las capas superficiales dañadas por el corte deben eliminarse mediante molienda. Las
muestras montadas se muelen con discos giratorios de papel abrasivo lavados con un
refrigerante adecuado para eliminar la suciedad y el calor, por ejemplo papel de carburo
de silicio húmedo. La tosquedad del papel está indicada por un número: la cantidad de
granos de carburo de silicio por pulgada cuadrada. Entonces, por ejemplo, el papel de
grano 180 es más grueso que 1200.

 El proceso de molienda involucra varias etapas, usando un papel más fino (un número
más alto) para cada etapa sucesiva. Cada etapa de molienda elimina los arañazos del
papel grueso anterior. Esto se logra más fácilmente al orientar el espécimen
perpendicularmente a los arañazos previos, y observar que estos rasguños previamente
orientados sean borrados. Entre cada grado, la muestra se lava a fondo con agua
 jabonosa para evitar la contaminación por granos gruesos presentes en la superficie de
la muestra. Típicamente, el mejor grado de papel utilizado es el 1200, y una vez que los
únicos arañazos que quedan en la muestra son de este grado, la muestra se lava a fondo
con agua, luego con alcohol y luego se deja secar.

 Es posible determinar el punto de inicio de la molienda utilizando la siguiente relación

empírica, en la que se mide el ancho del arañazo más grande con un microscopio:

 Esto evita poner más daño en la muestra que ya existe; los grados más groseros de
papel a menudo no son útiles.

 Limpiar las muestras en un baño ultrasónico también puede ser útil, pero no es esencial.

 La serie de fotos a continuación muestra la progresión de la muestra cuando se muele

con papel progresivamente más fino.

Muestreo de cobre molido con papel de grano 180 Molécula de cobre molida con papel de grano 400

Molécula de cobre molida con papel de grano 800 Muestreo de cobre molido con papel de grano 1200

 Pulido
  Los discos de pulido están cubiertos con un paño suave impregnado de partículas
abrasivas de diamante y un lubricante oleoso. Se utilizan partículas de dos grados
diferentes: un pulido más grueso, típicamente con partículas de diamante de 6 micras de
diámetro que deben eliminar los arañazos producidos en la etapa de molienda más fina y
un pulido más fino, típicamente con partículas de diamante de 1 micra de diámetro, para
producir un superficie. Antes de usar una rueda de pulido más fina, la muestra debe
lavarse a fondo con agua jabonosa tibia y luego con alcohol para evitar la contaminación
del disco.

Espécimen de cobre pulido a nivel de 6 micras Espécimen de cobre pulido a nivel de 1 micra. Lo ideal es
que no haya escamas después del pulido, pero a menudo
es difícil eliminarlos por completo.

 El pulido mecánico siempre dejará una capa de material alterado en la superficie de la

muestra, si la muestra es particularmente susceptible a daños mecánicos (o si se usa
una fuerza excesiva en las etapas de rectificado y pulido) los desechos pueden
incrustarse en la superficie y la deformación plástica puede existir debajo de la
superficie. El electropulido o el pulido químico se pueden utilizar para eliminar esto,
dejando una superficie no perturbada.

 Aguafuerte
 El grabado se usa para revelar la microestructura del metal a través de un ataque
químico selectivo. También elimina la capa delgada y altamente deformada que se
introduce durante la molienda y el pulido.

 En las aleaciones con más de una fase, el grabado crea contraste entre diferentes
regiones a través de diferencias en la topografía o la reflectividad. La tasa de grabado se
ve afectada por la orientación cristalográfica, la fase presente y la estabilidad de la
región. Esto significa que el contraste puede surgir a través de diferentes mecanismos, lo
que revela diferentes características de la muestra.

 En todas las muestras, los atacantes atacarán preferentemente los sitios de alta energía,
como los límites y los defectos.


 La muestra se graba usando un reactivo. Por ejemplo, para grabar acero inoxidable o
cobre y sus aleaciones, se usa una solución acuosa saturada de cloruro férrico, que
contiene unas pocas gotas de ácido clorhídrico. Esto se aplica con un bastoncillo de
algodón frotado sobre la superficie unas cuantas veces (se debe tener cuidado de no
sobregrabar; esto es difícil de determinar, sin embargo, las siguientes fotos pueden ser
de alguna ayuda). La muestra debe lavarse inmediatamente en alcohol y secarse.

 Después del proceso de grabado, pueden existir numerosos hoyos pequeños en la

superficie. Estos son agujeros de grabado causados por ataques químicos localizados y,
en la mayoría de los casos, no representan características de la microestructura. Pueden
ocurrir preferentemente en regiones de alto desorden local, por ejemplo, donde hay una
alta concentración de dislocaciones.

 Si el espécimen está sobre grabado, es decir. grabados durante demasiado tiempo, estos
hoyos tienden a crecer y oscurecen las características principales que deben
observarse. Si esto ocurre, puede ser mejor quitar la superficie pobremente grabada y
volver a pulir y grabar, aunque es importante recordar qué características está tratando
de observar: es posible que al triturar repetidamente una muestra muy delgada no
quede nada que ver.
 Cerámica y polímeros
 Cerámica
 Secciones delgadas
 Para preparar muestras de cerámica para microscopía de luz transmitida, se corta una
rebanada fina, de aproximadamente 5 mm de grosor, utilizando una sierra de diamante o
una rueda de corte. A continuación, se realiza un solapado de una superficie usando
suspensiones líquidas de polvos de carburo de silicio sucesivamente más finos. Entre las
etapas del proceso, la muestra debe limpiarse a fondo. Después del lavado y secado
final, la superficie del suelo se une a un portaobjetos de microscopio con resina. Se usa
 una sierra de corte en la cara expuesta para reducir el espesor a aproximadamente 0,7
mm. Luego, la muestra se traslapa para llevarla al grosor requerido, normalmente
alrededor de 30 μm , aunque algunas muestras cerámicas se adelgazan a tan solo
10 μ.m, debido a su tamaño de grano más fino. La diapositiva se verifica por el grosor
bajo el microscopio y luego se termina a mano. El tobogán se cubre con un cubreobjetos
protector.
 Lapeado
 El proceso de pulido es una alternativa a la molienda, en la que las partículas abrasivas
no se fijan firmemente al papel. En cambio, se aplica una pasta y lubricante a la
superficie de un disco. La rugosidad de la superficie de los pasos de preparación más
gruesos se elimina mediante el micro impacto de partículas abrasivas rodantes.
 Secciones pulidas
 Estos difieren de las secciones delgadas ordinarias en que la superficie superior de la
muestra no está cubierta con un cubreobjetos, sino que está pulida. Se debe tener
cuidado para evitar que la muestra se rompa. Las secciones pueden examinarse usando
microscopía de luz transmitida y reflejada, que es particularmente útil si algunos
constituyentes son opacos.
 Polímeros
 Secciones finas
 Las secciones delgadas de polímeros orgánicos se preparan a partir de material sólido
cortando rebanadas usando un microtomo, un instrumento mecánico usado para cortar
secciones delgadas. Deben cortarse a una temperatura inferior a la temperatura de
transición vítrea del polímero. Una sección cortada se curva durante el corte y debe
desenrollarse y montarse en un portaobjetos de microscopio y cubrirse con un
cubreobjetos. Se usan unas gotas de adhesivo de montaje y deben ser compatibles con
la muestra. Como siempre, la temperatura de montaje no debe afectar la
microestructura de la muestra.
 El espesor de las láminas cortadas de polímero tiende a estar en el rango de 2 a 30 μ m,
dependiendo del tipo de material.
 Los polímeros más duros se pueden preparar de la misma manera que las muestras de
cerámica delgada.
 Secciones pulidas
 Estos se preparan de la misma manera que las muestras metalográficas. Los elastómeros
son más difíciles de pulir que los polímeros termoendurecibles y requieren tiempos de
pulido más largos. Los lubricantes usados durante el pulido no deben ser absorbidos por
la muestra.
 Como las regiones cristalinas son atacadas más lentamente que las amorfas, el grabado
de las muestras de polímeros puede producir un contraste que revela la estructura del
polímero.
Muestra de cobre grabada Sobre muestra de cobre grabada

 Idealmente, la superficie a examinar ópticamente debe ser plana y nivelada. Si no lo es,

la imagen pasará desapercibida a medida que el área de visualización se mueva por la
superficie. Además, hará que sea difícil tener todo el campo de visión en foco, mientras
que el centro está enfocado, los lados estarán fuera de foco. Al usar una prensa
niveladora de muestras (como se muestra a continuación), se puede evitar este
problema, ya que presiona la muestra montada en plasticene en un portaobjetos de
microscopio, haciéndolo nivelado. Un pequeño trozo de papel o tela cubre la superficie
de la muestra para evitar rasguños.

 Prensa de nivelación de muestras

Usando microscopios
Ambos tipos de microscopios se utilizan de maneras muy similares, aquí hay algunas pautas
sobre cómo configurar una muestra para ser observada:
 La muestra se monta y se coloca en el escenario; comience aumentando lentamente la
potencia de la fuente de luz hasta que haya una mancha brillante visible en la muestra (sin
mirar hacia abajo)
 Con la lente de aumento más bajo en su lugar, use la perilla de enfoque grueso: sin mirar
hacia abajo, baje la lente objetivo cerca de la superficie de la muestra y luego use la perilla
de enfoque grueso para subirla lentamente hasta que aparezca el círculo de luz en la
muestra razonablemente fuerte. Ahora, mirando a través del ocular, ajuste el control de
enfoque aproximado. Cuando mire hacia abajo del ocular, siempre use el enfoque grueso
para alejar la muestra del objetivo.
 La distancia de la pieza ocular (para microscopios binoculares) debe ajustarse a una
separación cómoda y, mirando a través de los ocular, utilice la perilla de enfoque fino para
enfocar bien la imagen.
 La imagen debe enfocarse al ocular no ajustable y luego la otra debe cambiar para que
también esté enfocada.
 Para aumentar la ampliación, deslice la pieza giratoria alrededor (asegurándose de que
la lente no toque la muestra) y luego vuelva a enfocar usando el enfoque fino (¡debe tomar
muy poco ajuste!).
Una vez que se encuentra un área representativa y enfocada, se puede usar una cámara digital
para tomar una foto y hacer un boceto. Es importante, incluso en casos donde hay acceso a
cámaras de microscopio, hacer bocetos etiquetados de aspectos importantes del campo de
visión. Recuerde que un boceto no tiene que ser una copia de lo que ve, sino que debe incluir los
aspectos clave de la microestructura.
Barras de escala
Las observaciones bajo el microscopio no tienen ningún valor si no hay una escala que las
acompañe, por lo que es muy importante comprender la escala. Todos los bocetos deben tener
barras de escala y el software de la cámara del microscopio a menudo permite que se agregue
una barra de escala antes de guardar la imagen (dada la información correcta sobre la
ampliación).
La manera más fácil de medir el tamaño de una característica bajo un microscopio es
relacionarla con el tamaño del campo de visión. La forma más simple de lograr esto es medir el
tamaño del campo de visión con un aumento reducido, y luego escalar el tamaño de manera
apropiada a medida que aumenta la ampliación. El campo de visión se puede medir
aproximadamente mirando una regla debajo del lente de aumento más bajo.
La precisión se puede mejorar usando una retícula. Una retícula es una diapositiva con una rejilla
muy fina que, si es métrica, generalmente mide 1 mm de ancho, y se divide en 100
segmentos, es decir , cada segmento tiene 10 μ m de ancho. Esto permite una precisión mucho
mayor en la medición del campo de visión, y por lo tanto una mayor precisión en las
características de medición.

Retícula métrica en luz polarizada

En algunos microscopios, se superpone una barra de escala en uno de los oculares, que se puede
utilizar para mejorar aún más la precisión de los tamaños de las funciones de medición. La barra
de escala se puede calibrar observando una cuadrícula o una regla con un bajo aumento. Por
ejemplo, si 1 división es equivalente a 20 mm con una lente de aumento × 5, cada división
equivale a 2 mm con una lente de aumento × 50. Al medir una característica usando la escala en
el ocular, el tamaño real de la característica puede calcularse conociendo el ancho de las
divisiones en el ocular. La barra de escala en el ocular es particularmente útil porque se puede
girar, por lo que se pueden medir anchos y longitudes sin girar la muestra.
Resolución e imágenes
El límite de resolución (o poder de resolución ) es una medida de la capacidad de la lente
objetivo para separar en la imagen los detalles adyacentes que están presentes en el objeto. Es
la distancia entre dos puntos en el objeto que acaba de resolverse en la imagen. El poder de
resolución de un sistema óptico está limitado en última instancia por la difracción de la
abertura. Por lo tanto, un sistema óptico no puede formar una imagen perfecta de un punto.
Para que ocurra una resolución, al menos el haz directo y el haz difractado de primer orden
deben ser recolectados por el objetivo. Si la apertura del objetivo es demasiado pequeña, solo se
recoge el haz directo y se pierde la resolución.

Considere una rejilla de espaciado d iluminada por la luz de la longitud de onda λ , con un
ángulo de incidencia i .

La diferencia de trayectoria entre el haz directo y el haz difractado de primer orden es

exactamente una longitud de onda, λ . Asi que,
d sin i + d sin α = λ
donde 2 α es el ángulo a través del cual se difracta el haz de primer orden. Dado que los dos
haces son simplemente recopilados por el objetivo, i = α , por lo tanto, el límite de resolución
es,
dmin=λ2sinα
La longitud de onda de la luz es un factor importante en la resolución de un microscopio. Las
longitudes de onda más cortas producen una resolución más alta. El mayor poder de resolución
en microscopía óptica requiere luz casi ultravioleta, la longitud de onda de imagen visible
efectiva más corta.
Apertura numérica
La apertura numérica de un objetivo de microscopio es una medida de su capacidad para
resolver detalles finos de muestras. El valor para la apertura numérica está dado por,
Abertura numérica (NA) = n sin α
donde n es el índice de refracción e igual a 1 para el aire y α es el medio ángulo subtendido por
los rayos que entran en la lente del objetivo.
La apertura numérica determina la potencia de resolución de un objetivo, cuanto mayor es la
apertura numérica del sistema, mejor es la resolución.

Baja apertura numérica Alta apertura numérica

Baja relación para Alto valor para una
baja resolución alta resolución
Discos Airy
Cuando la luz de los distintos puntos de una muestra pasa por el objetivo y se crea una imagen,
los diversos puntos de la muestra aparecen como pequeños patrones en la imagen. Estos son
conocidos como discos Airy. El fenómeno es causado por la difracción de la luz cuando pasa a
través de la apertura circular del objetivo.
Los discos Airy consisten en luz pequeña concéntrica y círculos oscuros. Cuanto más pequeños
sean los discos de Airy proyectados por un objetivo en la formación de la imagen, más detalles
del espécimen se pueden discernir. Las lentes objetivas de mayor apertura numérica son
capaces de producir discos Airy más pequeños y, por lo tanto, pueden distinguir detalles más
finos en la muestra.
El límite en el cual dos discos de Airy se pueden resolver en entidades separadas a menudo se
llama el criterio de Rayleigh. Aquí es cuando el primer mínimo de difracción de la imagen de un
punto de origen coincide con el máximo de otro.

Irresoluble Criterio de Rayleigh Soluble

Las aberturas circulares producen patrones de difracción con simetría circular. El análisis
matemático da la ecuación,
dmin=λ2sinα
θ es la posición angular del mínimo de difracción de primer orden (el primer anillo oscuro)
R

λ es la longitud de onda de la luz incidente

d es el diámetro de la apertura
De la ecuación se puede ver que el radio del máximo central es directamente proporcional
a λ / d . Por lo tanto, el máximo está más extendido para longitudes de onda más largas y / o
aperturas más pequeñas.
El mínimo primario establece un límite para la ampliación útil de la lente objetivo. Una fuente de
luz puntual producida por la lente siempre se ve como una mancha central, y como una segunda
y más alta, que solo se evita si la lente tiene un diámetro infinito. Dos objetos separados por una
distancia menor que θ R no se pueden resolver.
Resumen
 El microscopio óptico es una herramienta muy útil para la observación de materiales y se
puede utilizar para obtener información valiosa sobre una gran variedad de
especímenes. Algún conocimiento del material y la información que se requiere es esencial
para determinar las mejores técnicas para emplear al preparar y examinar especímenes.
 La preparación de la muestra es una parte crítica de la microscopía, ya que esto
determina la calidad de las imágenes producidas. Muchas técnicas, cuando se aplican
correctamente a una muestra, pueden mejorar la información presente.
 Una de las limitaciones del microscopio óptico es la resolución. Las imágenes de alta
resolución se realizan más comúnmente en un microscopio electrónico de barrido (SEM).
 Además, para las muestras "transparentes", en particular las de materiales
anisotrópicos, la microscopía de luz polarizada puede ofrecer grandes beneficios, con un
alto contraste posible.
Resumen
 El microscopio óptico es una herramienta muy útil para la observación de materiales y se
puede utilizar para obtener información valiosa sobre una gran variedad de
especímenes. Algún conocimiento del material y la información que se requiere es esencial
para determinar las mejores técnicas para emplear al preparar y examinar especímenes.
 La preparación de la muestra es una parte crítica de la microscopía, ya que esto
determina la calidad de las imágenes producidas. Muchas técnicas, cuando se aplican
correctamente a una muestra, pueden mejorar la información presente.
 Una de las limitaciones del microscopio óptico es la resolución. Las imágenes de alta
resolución se realizan más comúnmente en un microscopio electrónico de barrido (SEM).
 Además, para las muestras "transparentes", en particular las de materiales
anisotrópicos, la microscopía de luz polarizada puede ofrecer grandes beneficios, con un
alto contraste posible.