Prueba de Control de Calidad del Agua

Universidad Latina de Panamá

Jean Carlos Delgado
jeancarlosd23@hotmail.com

Resumen
El agua potable, definida como “adecuada para el consumo humano y para todo uso doméstico habitual, incluida
la higiene personal”, es libre de microorganismos causantes de enfermedades. Las posibles consecuencias de la
contaminación microbiana para la salud son tales que su control debe ser objetivo primordial y nunca debe
comprometerse.
La presencia de microorganismos patógenos en el agua de bebida es un riesgo que se incrementa en las áreas
marginales de mayor densidad poblacional o en zonas sin disponibilidad de agua potable. La seguridad que un
agua contaminada puede ser causal de enfermedades ha conducido a la necesidad de controlar rutinariamente la
calidad microbiológica de muestras de diversos orígenes.
En este laboratorio se dio una serie de cultivos y pruebas de muestras aleatorias de agua de distintos lugares, para
encontrar la posible presencia de bacterias coliformes o E. coli la cual se logró encontrar en dos muestras,
específicamente hablando. Con la tira API20E de una forma fácil es posible determinar el microorganismo en
específico presente en la muestra, el cual no se logró confirmar por falta de incubación
Palabras clave: Contaminación, coliformes, calidad del agua, bioindicadores, E. coli
Abstract
Drinking water, defined as "adequate for human consumption and for all habitual domestic use, personal hygiene",
is free of microorganisms that cause diseases. The possible consequences of microbial contamination for health
are stories that their control should be a primary objective and should never be compromised.
The presence of pathogenic microorganisms in drinking water is a risk that increases in the marginal areas of
greater population density or in areas without drinking water availability. The assurance that contaminated water
can be a cause of disease has led to the need to routinely control the microbiological quality of samples from
various sources.
In this laboratory there is a series of cultures and tests of samples of bacteria from different places, to find the
possible presence of coliform bacteria or E. coli, which was found in two samples, specifically speaking. With
the API20E strip in an easy way to determine the specific microorganism present in the sample, which has not
been confirmed due to lack of incubation.
Key words: Pollution, coliforms, water quality, bioindicators, E. coli
Introducción
El agua, además de ser una sustancia
imprescindible para la vida, por sus múltiples
propiedades, es ampliamente utilizada en
actividades diarias tales como la agricultura (70%
al 80%), la industria (20%), el uso doméstico (6%),
entre otras, convirtiéndose en uno de los recursos
más apreciados en el planeta. De ahí la importancia
de conservar y mantener la calidad de las fuentes
naturales, de manera que se garantice su
sostenibilidad y aprovechamiento para las futuras
generaciones.(Arcos Pulido, Ávila De Navia,
Estupiñán Torres, & Gómez Prieto, 2005)
El agua potable, definida como “adecuada para el
consumo humano y para todo uso doméstico
habitual, incluida la higiene personal”, es libre de
microorganismos causantes de enfermedades. Las
posibles consecuencias de la contaminación
microbiana para la salud son tales que su control
debe ser objetivo primordial y nunca debe
comprometerse.(Ríos-Tobón, Agudelo-Cadavid, &
Gutiérrez-Builes, 2016)
La presencia de microorganismos patógenos en el
agua de bebida es un riesgo que se incrementa en
las áreas marginales de mayor densidad poblacional
o en zonas sin disponibilidad de agua potable. La
seguridad que un agua contaminada puede ser
causal de enfermedades ha conducido a la
necesidad de controlar rutinariamente la calidad
microbiológica de muestras de diversos
orígenes.(OMS, 2006)
Ellos transmiten enfermedades tales como
salmonelosis (Salmonella), shigelosis (Shigella),
colera (Vibrio Cholerae), amebiasis (Entamoeba
histolytica), alteraciones gastrointestinales
(Aeromonas mesófilas, Helicobacter pylori,
Campylobacter); giardiasis (Giardia lamblia),
cristosporidiosis (Crystosporidium),
esquistosomiasis (Schistosoma), desórdenes
hepáticos (virus de hepatitis), etc.(Bergey & Holt,
1994)
Los análisis bacteriológicos apuntan a la búsqueda
de microorganismos indicadores de contaminación
fecal y se centralizan en la cuantificación de
coliformes. Este grupo está integrado por
enterobacterias, siendo Escherichia coli el
indicador universal de contaminación
fecal(Ehrlich, 1995). Los microorganismos
indicadores de contaminación deben cumplir los
siguientes requisitos: fáciles de aislar y crecer en el
laboratorio; ser relativamente inocuos para el
hombre y animales; y presencia en agua
relacionada, cuali y cuantitativamente con la de
otros microorganismos patógenos de aislamiento
más difícil. Tres tipos de bacterias califican a tal fin:
 Coliformes fecales: indican contaminación
fecal.
 Aerobias mesófilas: determinan efectividad del
tratamiento de aguas.
 Pseudomonas: señalan deterioro en la calidad
del agua o una recontaminación.(Schlegel &
Zaborosch, 1993)
Los sistemas miniaturizados API® son métodos
rápidos que permiten la identificación de
microorganismos a través de la realización de
diferentes pruebas bioquímicas. Estos sistemas
consisten en un dispositivo de plástico con varios
microtubos que contienen diferentes medios de
cultivo deshidratados o diferentes sustratos de
enzimas de acuerdo con el tipo de prueba que se
requiere montar (Cuaderno de Prácticas,
Microbiología Clínica, 2012). Entre algunas de las
pruebas bioquímicas que pueden realizarse con
estos sistemas están las pruebas de fermentación de
carbohidratos, la determinación de la producción de
H2S, la determinación de la hidrólisis de la gelatina,
entre otras.
API® 20E: Permite la identificación de
microorganismos pertenecientes al grupo de las
enterobacterias y de otros bacilos gram negativos.
Es una galería conformada por 20 microtubos.
(“SISTEMAS MINIATURIZADOS API ®,” 2010)
Colilert* detecta simultáneamente los coliformes
totales y E. coli en el agua. Se basa en Defined
Substrate Technology* (Tecnología de substrato
definido [DST*]), patentada por IDEXX. Cuando
los coliformes totales metabolizan el indicador
ONPG de nutrientes de Colilert, la muestra toma
una coloración amarilla. Cuando E. coli metaboliza
el indicador MUG de nutrientes de Colilert, la
muestra además fluoresce. Colilert puede detectar
simultáneamente estas bacterias a una
concentración de 1 ufc/100 ml dentro de las 24
horas, hasta en presencia de 2 millones de bacterias
heterotróficas por cada 100 ml.(“SISTEMAS
MINIATURIZADOS API ®,” 2010)
Objetivos
Generales:
 Realizar pruebas de control de calidad para
verificar la presencia o ausencia de
microorganismos.
 Identificar microorganismos presentes en el
agua.
Específicos:
 Realizar tinción de gram
 Realizar prueba Api®20E
 En tubos de ensayo, se realizó diluciones
 Realizar prueba de coliformes totales y E. Coli
utilizando la muestra de agua con agua
Materiales destilada, en concentraciones de 10-5 y 10-
10
.
 Muestra de agua
 Se procedió a sembrar en Agar Nutritivo.
 Tubos de ensayo
 Agua destilada  De las diluciones realizadas, se tomó cierta
 Plato petri con Agar Nutritivo cantidad con un gotero y sobre el agar
 Asa nutritivo se colocó 10 gotas que
 Mechero posteriormente fueron extendidas con un
 Portaobjetos asa en L.
 Microscopio
 Aceite de inmersión
 Cristal Violeta
 Yodo de gram
 Alcohol acetona
 Safranina
 Asa en L
 Incubadora
 Agua Salina
 Jeringa
 Gotero
 Api® 20 E
 Se realizaron cultivos en 2 platos con las
 Vaso Químico
 Colilert diferentes concentraciones.
 Parafilm  Se llevó a la incubadora por 24 horas.
 Reactivo TDA Dia 2
 Reactivo de James
 Reactivo VP1  Parte I. Tinción de Gram
 Reactivo VP2  Se observó el crecimiento bacteriano de los
 Lámpara de UV platos realizando una descripción
Métodos morfológica de las colonias bacterianas.
 A cada estudiante, dependiendo de sus
Día 1 resultados, se le asignó una colonia a la cual
 Se tomó una muestra de agua, que en este se le debía realizar una tinción de gram.
caso, fue tomada del grifo de casa (sin  En este caso se asignó, el análisis de la
filtro). colonia blanca.

 Se realizó la tinción de gram, tomando una
asada de la colonia a analizar y
distribuyéndola en un portaobjetos.
 Se fijó la muestra flameándola, rápidamente
en el mechero 3 veces.
 Se procedió a teñir agregándole primero,
cristal violeta durante 1 minuto y lavando
con agua.
 Se le añadió yodo de gram durante 1
minutos y se lavó con agua.
 Se le añadió alcohol acetona durante 5
segundos y lavó con agua.
 Finalmente, se le añadió safranina durante 1
minuto y se lavó con agua.
 Dejar secar la muestra y observar al
microscopio.
 Resultados, de lo cuál dependerá para pasar
a la segunda parte.
 Parte II. Análisis Api®20E
 Tras la tinción de gram y dependiendo si se
obtenían la prueba que corroborara, que
eran las bacterias requeridas, se procedió a
hacer un Api® 20 E.
 Se prepara una solución donde se extrae 5
ml de agua salina con una jeringa y se
colocó en un tubo de ensayo.
 Se tomó una asada de las colonias
correspondiente y se diluyó en los 5ml de
agua salina, revolviendo hasta eliminar
cualquier posible grumo.
 Con un gotero se toma de la solución
preparada y se llena cada pocillo del API
con dos o tres gotas de la solución cuidando
se llenarlos estrictamente hasta la línea.
 A los microtubos: CIT, VP y GEL, se llena
totalmente con la suspensión de bacterias.
 Los microtubos: ADH, LCD, ODC, URE,
H2S se le agrega parafina.
 Finalmente, el API será almacenado en una
cajilla de plástico, el cual también tiene
unos “mini-pocillos” que deberán ser
llenados con dos o tres gotas de agua para
darle al API durante la incubación, las
condiciones de humedad requerida.
 Incubar a 37°C durante 18-24 horas.
Parte III. Prueba de Coliformes
 Finalmente, se tomó de la muestra de agua
inicialmente recolectada, 150 ml, y se
colocó en un vaso químico.
 Se añade el contenido de una dosis de
Colilert en la muestra de agua.
 El vaso químico con la mezcla se tapa con
parafilm y se agita hasta disolver el
contenido.
 Se lleva a incubar durante 24 horas.
 Resultados.
Día 3
Parte I
 Se leen los resultados obtenidos del
API®20E.
 Dependiendo del resultado obtenido en el
pocillo GLU, siendo positivo, se realizaron
otra serie de pasos adicionales.
 Se le agregó 1 gota de reactivo de TDA en
el pocillo de TDA.
 Resultado.
 Luego, se le añadió 1 gota de reactivo de
James en el pocillo para IND.
 Resultado.
 Finalmente, se le agregó una gota del
reactivo VP1 y una gota del reactivo VP2 en
el pocillo VP.
 Se esperó durante 10 minutos.
 Resultado
Parte II ONPG +
 Tras la incubación, se procede a leer el ADH -
resultado obtenido, en este caso, siendo 2 las LCD +
características buscadas: coloración y ODC -
fluorescencia.
CIT +
 Basados en la coloración de la muestra, se
observó si la mezcla se mantuvo H2S +
transparente o adquirió una coloración URE +
amarilla.
TDA -
 Resultado
 En un ambiente oscuro, se observa la IND -
presencia o ausencia de fluorescencia VP -
utilizando una lámpara de UV a unos 12cm GEL +
de la muestra, aproximadamente.
GLU +
 Resultado
MAN +
Resultados
INO +
 Cultivos Bacterianos y Tinción de Gram
SOR +
RHA +
SAC +
MEL +
AMY +
ARA +

 Api®20E (Parte II)

Tras la tinción de gram, se pudo observar que

las colonias correspondían a bacterias gram
negativas, con morfología: bacilos.
 Api®20E (Parte I)
Los Resultados para esta prueba fueron:
Los resultados obtenidos fueron:
Microtubos Coloración
TDA Marrón +
IND Rosado +
VP Rosa +
 VP1 mas VP2/lectura 10 min
VP piruvato producción de acetoína después de agregar los reactivos
sódico VP1 y VP2 (5)
incoloro rosado/rojo

GEL gelatina de gelatinasa no ha difusión de difusión de

Kohn pigmento negro pigmento
negro
GLU glucosa fermentación/oxidación azul/azul- amarillo
(4) verdoso

MAN manitol fermentación/oxidación azul/azul- amarillo

(4) verdoso

El perfil numérico obtenido finalmente fue: INO inositol fermentación/oxidación azul/azul- amarillo
(4) verdoso
5677773
SOR sorbitol fermentación/oxidación azul/azul- amarillo
 Prueba de Coliformes (4) verdoso

RHA ramnosa fermentación/oxidación azul/azul- amarillo

(4) verdoso

SAC sacarosa fermentación/oxidación azul/azul- amarillo

(4) verdoso

MEL melibiosa fermentación/oxidación azul/azul- amarillo

(4) verdoso

AMY amigdalina fermentación/oxidación azul/azul- amarillo

(4) verdoso

ARA arabinosa fermentación/oxidación azul/azul- amarillo

(4) verdoso

1. Un amarillo muy pálido debe considerarse como positivo.

2. Un color naranja después de 24 h de incubación debe considerarse
Respecto a la prueba personal: negativo.
 La coloración obtenida fue: transparente. 3. La lectura debe hacerse en la cúpula (aerobiosis).
4. La fermentación empieza en la parte inferior de los tubos, la oxidación
 En la prueba con UV, no hubo en la cúpula.
fluorescencia. 5. TDA:cloruro férrico; IND: reactivo de Kovac’s; VP1: hidróxido de
potasio 40%; VP2: α-naftol
Discusión
 Api®20E El perfil numérico obtenido tras la prueba
Pasado el tiempo de incubación se consultó el Api®20E fue: 5677773.
siguiente cuadro, para la adición de reactivos en Al presentarse más de tres veces el número 7 en los
los tubos respectivos y para la interpretación de valores, esto implicaba darse una segunda
resultados. incubación por 24 horas, procedimiento el cual no
Pruebas Sustratos Reacciones/Enzimas Resultados fue realizado por lo que no se pudo determinar el
Negativo Positivo microorganismo presente en la prueba.
β-galactosidasa
ONPG ortonitrofenol-
βgalactósido
incoloro amarillo (1)
 Prueba de Colilert
ADH arginina arginina dehidrolasa amarillo rojo/naranja
Aunque en la prueba personal no se obtuvieron
(2) resultados positivos, en el general se obtuvieron
LDC lisina lisina descarboxilasa amarillo naranja
dos resultados positivos a cambio de color, siendo
ODC ornitina ornitina descarboxilasa amarillo rojo/naranja(2)
positivo para presencia de coliformes y dos con
CIT citrato sódico utilización de citrato verde azul-
pálido/amarillo verde/verde florescencia, siendo positivo para una presencia de
(3) E. coli.
H2S tiosulfato producción de H2S incoloro/grisáceo depósito negro
sódico
El nutriente indicador que contiene el reactivo
URE urea ureasa amarillo rojo/naranja
Colilert®, corresponde al microbio que se desea
TDA triptofano triptofano deaminasa
TDR/lectura inmediata después de
agregar el reactivo TDA (5)
analizar (microbio objetivo). Los microbios
objetivos tienen afinidad por el nutriente indicador
Amarillo marrón oscuro
que se corresponde con su metabolismo, y que
IND/lectura 2 min después de
IND triptofano producción de indol agregar el reactivo IND (5)
puede usar como una fuente importante de carbono.
Los nutrientes indicadores específicos de Colilert:
amarillo anillo rojo
orto-nitrofenil-(-d-galactopiranoside (ONPG) y el
4-metril-umbeliferil-(-d-glucuronido (MUG),
mismos que se corresponden con las enzimas
constitutivas, que están siempre presentes en la
bacteria y que solo existen en las bacterias del grupo
coliformes y en E. coli. Las bacterias coliformes
contienen la enzima constitutiva (3-galactosidasa.
Si existe una bacteria coliforme en la muestra,
metabolizará al ONPG partiendo la porción
indicadora, la enzima cromogénica indicadora de
los coliformes (orto-nitrofenol); la cual, una vez
partida, se torna amarilla. La bacteria E. coli
contiene la enzima constitutiva (3-glucuronidasa. Si
está presente en la muestra, E. coli metaboliza al
MUG, liberando así a la porción indicadora, enzima
cromogénica indicadora de E. coli (4-metil-
umbeliferona) la cual, al partirse, produce
fluorescencia.(Salas Sosa & Martínez Morales,
2004)
Conclusión
El monitoreo de todos los organismos presentes en
el agua para consumo humano es poco realista
debido a la gran diversidad de patógenos que se
sabe están presentes en las fuentes de
abastecimiento (incluyendo virus, bacterias y
protozoos) y a los diversos métodos requeridos para
la concentración y el análisis de ellos. Sin embargo,
el monitoreo para uno o un grupo de patógenos
pueden dar una falsa impresión de seguridad, si
otros patógenos no identificados están presentes.
Por otra parte, muchos patógenos son difíciles y
costosos de cultivar e identificar y tienen una
distribución irregular o bajas concentraciones en el
medio ambiente. Durante más de un siglo el
enfoque de este problema ha sido monitorear bio-
indicadores de calidad del agua que se seleccionan
debido a su bajo potencial patógeno, altos niveles
en aguas y en materia fecal y a la relación con la
presencia de organismos patógenos.
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