1024201792.química Biológica PDF

Capítulo III
Consideraciones teóricas y prácticas

de Química Biológica
Manual teórico práctico de Química Orgánica y Biológica
PROTEÍNAS
Funciones de las proteínas. Niveles de organización en las proteínas. Propiedades de
las proteínas. Extracción de proteínas. Cuantificación de proteínas.
Los aminoácidos son compuestos nitrogenados que tienen un papel

primordial en la formación de los seres vivos, puesto que constituyen los
bloques fundamentales con los que se forman las proteínas, en las cuales los
aminoácidos se unen mediante enlaces peptídicos. Las proteínas tienen un
peso molecular elevado y son específicas de la especie y del órgano.
Funciones de las proteínas

La gran mayoría de los procesos biológicos depende de la presencia y/o
actividad de alguna proteína. Éstas pueden presentar diferentes actividades
biológicas tales como: enzimática, hormonal, de transporte (hemoglobina),
inmunológica o de defensa (anticuerpos), de receptor celular (a los cuales se
fijan moléculas capaces de desencadenar una respuesta determinada),
contráctil (actina y miosina, responsables de la contracción muscular), de
reserva (ovoalbúmina del huevo, caseína de la leche y gliadina del trigo),
estructural (el colágeno, que integra fibras altamente resistentes en tejidos de
sostén), entre otras. Por todo esto, su estudio representa un enorme interés
para múltiples disciplinas biológicas como genética, biología molecular,
biología celular, bioquímica, fisiología, medicina humana, veterinaria,
agronomía, zootecnia, botánica y zoología, entre muchas otras.
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1. Niveles de organización en las proteínas

Estructura primaria: Incluye a todos los enlaces covalentes entre los
aminoácidos y se define por la secuencia de los aminoácidos unidos por
enlaces peptídicos y la localización de los puentes disulfuro.
Estructura secundaria: ordenamiento espacial de la cadena de
aminoácidos de la estructura primaria sin considerar las conformaciones de
sus cadenas laterales. Plegamiento básico de la cadena debido a enlaces de
hidrógeno entre grupos -CO- y -NH- del enlace peptídico: hélices, láminas y
giros
Estructura terciaria: Describe el plegamiento tridimensional de un
polipéptido, incluidas sus cadenas laterales. Las estructuras estabilizantes
entre las cadenas laterales de los aminoácidos, son: enlaces hidrógeno,
interacción hidrofóbica, electrostática, puentes disulfuros, y enlaces ester
(entre aminoácidos alejados).
Estructura cuaternaria: Asociación de distintas subunidades, siendo
cada una un polipéptido. Es el arreglo tridimensional de las subunidades que
forman las proteínas. Esta estructura se estabiliza por puentes hidrógeno,
interacción hidrofóbica, electrostática y puentes disulfuros.
Estructura Estructura Estructura Estructura

primaria secundaria terciaria cuaternaria
Residuos de α hélice Cadena polipeptídica Subunidades ensambladas

aminoácidos
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2. Propiedades de las proteínas

2.1. Carga neta: Las proteínas presentan propiedades ácido-base. Los
grupos funcionales de las proteínas se pueden ionizar dependiendo del
pH de la solución donde se encuentren.
2.2. Solubilidad: A pH bajo o por encima del punto isoeléctrico, la
proteína tiene una carga neta positiva o negativa. Esto hace que sea
soluble. En el punto isoeléctrico las proteínas reaccionan unas con
otras formando agregados que tienden a precipitar. Según la fuerza
iónica cambia la solubilidad
2.3. Desnaturalización o pérdida de la estructura o conformación
nativa: Es un cambio parcial o total de la estructura nativa de la
proteína (secundaria, terciaria y cuaternaria).
Ocurre con la ruptura de puentes de azufre y de las interacciones no
covalentes. Los factores que producen la desnaturalización de las
proteínas pueden ser físicos (temperatura) o químicos (pHs extremos,
detergentes, compuestos que forman puentes de hidrógeno o que
participan en interacciones hidrofóbicas)
3. Aislamiento, purificación y caracterización de proteínas

La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren de la
purificación, al menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Los
primeros pasos para encarar el estudio de una proteína involucran su
aislamiento o extracción a partir de una fuente determinada (animal, vegetal,
fúngica, bacteriana, etc.) y su purificación, al menos parcial. Esto requiere
generalmente un gran esfuerzo ya que una célula contiene miles de sustancias
diferentes y la molécula que buscamos puede ser extremadamente inestable o
encontrarse a concentraciones muy bajas. Sin embargo, se dispone de
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diferentes métodos adecuados para cada caso particular y para cada etapa de
este proceso, tales como, lisis celular, destrucción mecánica o técnicas de
congelación-descongelación, a fin de romper las células y extraer las
proteínas.
3.1. Métodos de ruptura celular y extracción de proteínas

La extracción de proteínas es considerada a menudo sólo como un paso
preliminar para una subsiguiente purificación, pero de hecho constituye un
paso crucial para su estudio, ya que el procedimiento de extracción determina
la naturaleza y la estabilidad de las proteínas extraídas, lo que a su vez
determina la calidad y la validez de los resultados.
En general, el primer paso consiste en la obtención de un homogenato,
que implica la destrucción de la célula y el pasaje de las proteínas a solución o
suspensión. Esto puede llevarse a cabo de diferentes maneras, entre las que se
puede citar:
A) Homogenización mecánica: Puede utilizarse un homogeneizador de
vidrio, mortero, licuadora, a veces, con la ayuda de abrasivos como alúmina,
arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotónico (sacarosa 0,25
M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertónico, en una solución
tampón (buffer) adecuado para controlar el pH.
B) Homogeneización sónica: El choque de ondas sónicas o ultrasónicas
provoca cambios de presión de miles de atmósferas, que rompen la pared
celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para
determinados tejidos animales (bazo, riñón, eritrocitos).
C) Desintegración térmicas: El congelamiento y descongelamiento rápido y
repetido suele usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelación
se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al
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descongelarse, las células se destruyen osmóticamente debido a la presencia

de agua pura y se libera su contenido.
D) Homogeneización por deshidratación: Se basa en la precipitación de
proteínas por solventes orgánicos (etanol, acetona, etc.). En la preparación
del "polvo acetónico" se utiliza acetona en frío.
3.2 Métodos de extracción de proteínas (tejidos vegetales)
Para la extracción de proteínas a partir de un homogenato de tejidos
vegetales se pueden citar tres procedimientos generales:
A) Extracción con soluciones tampón: El uso de tampones de baja fuerza
iónica nos permite recuperar las proteínas citoplásmicas solubles y las de los
espacios intercelulares, mientras que con alta fuerza iónica también extraemos
las proteínas ligadas a la pared celular.
B) Extracción con detergentes: La extracción con dodecil sulfato de sodio
(SDS) permite la extracción de proteínas solubles y de las ligadas a la
membrana celular en condiciones desnaturalizantes.
C) Precipitación directa: Consiste en precipitar directamente la proteína total
del tejido, triturando éste en presencia de ácido tricloroacético (ATC) frío al
10%. Esta última técnica se utiliza para comparar patrones proteicos entre
varias muestras analizadas por 2D–PAGE (electroforesis bidimensional en
geles de poliacrilamida). Sin embargo, la presencia de ATC desnaturaliza
irreversiblemente las proteínas, por lo que no puede ser utilizado cuando se
efectúan estudios de actividad enzimática o de otro tipo.
Para evitar la desnaturalización es necesario operar a bajas temperaturas
y a veces es conveniente la adición de inhibidores de enzimas proteolíticas
(proteasas) al buffer de extracción. Algunos agentes estabilizadores como el
dimetilsulfóxido (DMSO) al 10%, o glicerol al 25% protegen las proteínas
contra la acción proteolítica. La adición de agentes reductores como el
ditiotreitol (DTT) 5 mM, L-cisteina 8 mM, o β –mercaptoetanol 3mM,
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protege las proteínas de la oxidación, pero se debe tener cuidado porque estos
agentes, en algunos casos pueden activar a las proteasas.
3.3 Métodos de purificación y caracterización
Por otro lado, para separar o purificar una proteína a partir de una
mezcla de proteínas se aplican habitualmente métodos cromatográficos que
aprovechan diferentes propiedades de la molécula proteica, como su masa
molecular (en la cromatografía de filtración por gel), su carga (en la
cromatografía de intercambio iónico) o su afinidad por determinados grupos
químicos (cromatografía de afinidad). El análisis de la proteína o proteínas
aisladas, como la determinación de su peso molecular o la existencia de
subunidades (estructura cuaternaria), pI (punto isoeléctrico), se lleva a cabo
generalmente mediante técnicas electroforéticas en condiciones nativas o
desnaturalizantes e isoelectroenfoque. El análisis de la estructura de una
proteína se hace mediante RMN, dicroísmo cicular, espectrofluorimetría,
secuenciación, etc. Si la proteína es una enzima, se realiza el análisis de su
actividad biológica y estudio de su comportamiento cinético.
Técnicas utilizadas en el estudio de proteínas
Purificación Cuantificación Análisis de Análisis de
estructura actividad
Fraccionamiento Espectrofotometría Espectrofluorimetría Actividad
subcelular por enzimática
centrifugación
diferencial
Precipitación Espectrofluorimetría Dicroismo circular Análisis de
salina radioligandos
Diálisis ELISA RMN Complejos
Antígeno
Anticuerpo
Cromatografía de MALDI-MS
filtración por gel,
intercambio
iónico,afinidad
Electroforesis en Secuenciación de
geles aminoácidos
isoelectroenfoque Difracción de RX
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3.4 Cuantificación de proteínas

Por último, muchas veces es indispensable un método que permita
medir la actividad biológica de la proteína que intentamos aislar y purificar
(por ejemplo, una actividad enzimática) y en todo momento se requiere de un
método adecuado para poder cuantificar el contenido proteico del sistema en
estudio. Los criterios importantes para la elección de un método adecuado
para poder cuantificar el contenido proteico del sistema en estudio son:
a) Especificidad
b) Bajo umbral de detección
c) Facilidad para ponerla en práctica
d) Rapidez
e) Costo accesible
f) Facilidad para integrarla a un protocolo de purificación
Entre los métodos más usados citaremos tres:
Absorbancia a 280 nm
Aunque ninguno de los 20 aminoácidos hallados en las proteínas
absorbe luz en la región visible del espectro electromagnético, tres de ellos
(tirosina, triptofano y fenilalanina) absorben significativamente en la región
del UV cercano a los 280 nm. Dado que las proteínas poseen restos de
aminoácidos aromáticos, las medidas de absorción a 280 nm constituyen un
método rápido para la determinación del contenido de proteína de una
solución. Este método es usado para determinar la localización de proteínas en
una o más fracciones procedentes de un proceso de separación
cromatográfica.
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Proteínas (mg/ml) = 1.55 A280 – 0.76 A260
Método de Bradford - Fijación no Covalente de Colorante

El colorante puede existir en diferentes formas iónicas en una solución
ácida. La forma aniónica (azul) del Coomassie Blue G250 (λmax=590 nm), se
fija a las proteínas por interacciones electrostáticas con los grupos catiónicos.
El colorante interacciona en forma preferencial con los grupos funcionales de
arginina y lisina. El mismo colorante tiene una forma catiónica roja (λmax=470
nm) y otra verde (λmáx=650 nm). El complejo es estable por una hora.
Método de Lowry
Es un método espectrofotométrico de valoración cuantitativa de
proteínas. Se basa en la reacción de las proteínas con el reactivo de Folin-
Ciocalteau, que consiste en una solución de tungstato sódico y molibdato
sódico en ácido fosfórico y ácido clorhídrico. A una adecuada dilución de
proteínas se añade el Reactivo de Folin que forma un complejo coloreado con
ellas, siendo la intensidad de color resultante proporcional a la concentración
de proteínas, según la ley de Lambert-Beer (A= ε.L.C).
Fundamento: La reacción entre las proteínas y los reactivos empleados
por este método consta de dos etapas:
1ª) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas en los
átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos, formando complejos. Estos
complejos Cu2+-proteína, de un color azul pálido, provocan el desdoblamiento de
la estructura tridimensional de la proteína, exponiendo hacia la superficie a los
residuos fenoles de tirosina, que van a participar en la segunda etapa de la
reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con
tartrato.
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2ª) También en medio básico, el cobre actúa como catalizador de la

reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau por parte de los grupos fenólicos de
los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas. El principal
constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico,
de color amarillo, que al ser reducido por los residuos fenólicos da lugar a un
complejo de color azul intenso que se lee en espectrofotómetro a una longitud de
onda (λ) de 750 nanómetros (nm). La intensidad del color depende de la
cantidad de estos aminoácidos aromáticos presentes en las proteínas y será
proporcional a la concentración de proteínas en la solución.
Reacción entre la proteína y los reactivos de Cu2+ y de Folin

Cada método presenta sus ventajas y desventajas las cuales se resumen
en la tabla. La elección de uno u otro método dependerá del objetivo final que
se pretende llegar en el estudio de proteínas.
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Ventajas Desventajas
Grupos -Gran espectro de sensibilidad -Interfieren ácidos
Aromáticos -Método no destructivo nucleicos y otros
(280 nm) compuestos aromáticos.
Unión Peptídica -Proteínas con y sin grupos -Detección de otros
(205 nm) aromáticos compuestos químicos.
-Método no destructivo -Interfieren la mayoría
de los tampón.
Método de -10 veces más sensible que UV -Interferencia de varias
Lowry (5 a 100 µg) sustancias.
(745-750 nm) -Aconsejable para mezclas -Inestabilidad de los
complejas (tisulares) reactivos
-Desviación de la
linealidad a altas
concentraciones
Método de -5 veces más sensible que el de -La sensibilidad
Bradford Lowry depende del contenido
(595 nm) -Pequeñas interferencias se de lisinas y argininas.
compensan con el control -El complejo deja
restos azules en las
cubetas.
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Experimentación
Proteínas
Objetivos
• Extraer, concentrar y purificar proteínas de origen animal y vegetal.
• Estudiar la propiedad amortiguadora del pH de las proteínas.
• Determinar el punto isoeléctrico de una proteína.
• Estudiar el efecto de solventes orgánicos sobre las proteínas.
• Ensayar e interpretar los procesos de desnaturalización reversible e
irreversible de las proteínas.
• Emplear un método colorimétrico para el análisis cuantitativo de las
proteínas presentes en una muestra desconocida.
A. Extracción de proteínas solubles de hojas de tártago (Ricinus

communis).
Técnica: pesar aproximadamente 100 g de hojas de tártago. Lavar el
material vegetal con agua corriente y enjuagar con agua destilada. Cortar en
trozos pequeños con tijeras y homogeneizar en una procesadora con 100 ml de
buffer fosfato de sodio 50 mM pH 7,5 conteniendo 2-mercaptoetanol 1 mM
(buffer de extracción) y rotular como Extracto Crudo (M0). Filtrar el
extracto crudo por doble gasa y centrifugar el líquido filtrado a una velocidad
de 2000 rpm durante 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y medir su
volumen. Rotular como Extracto Centrifugado (M1).
B. Técnica de concentración de extracto de proteínas solubles

El extracto centrifugado se concentra mediante precipitación con
sulfato de amonio sólido hasta un 100 % de saturación (para 100 ml de
solución al 100 % se debe agregar 70,6 g de (NH4)2SO4). Se debe medir el
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volumen del extracto que se va a concentrar y calcular la cantidad de sal

necesaria para alcanzar una saturación del 100 %. Pesar el sulfato de amonio y
agregarlo lentamente y con agitación para lograr una buena precipitación de
las proteínas. Posteriormente centrifugar a una velocidad de 2000 rpm durante
15 minutos. Descartar el líquido sobrenadante y resuspender el precipitado en
un pequeño volumen de buffer acetato de sodio 10 mM pH 5,5 con 2-
mercaptoetanol 1 mM (tampón de diálisis).
A fin de eliminar el (NH4)2SO4, que puede alterar irreversiblemente a
algunas proteínas, se debe someter el extracto concentrado a un proceso de
diálisis. Para ello, se carga el extracto en una membrana de diálisis y se dializa
contra 500 ml del tampón de diálisis durante dos horas, renovando el líquido
de diálisis a los 60 minutos. Durante este proceso las moléculas salinas de
menor tamaño atraviesan los poros de la membrana por difusión simple y las
proteínas, de mayor tamaño, son retenidas. Rotular como Extracto
concentrado (M2).
Advertencia: el 2-mercaptoetanol es un producto combustible y

sumamente tóxico por ingestión, inhalación o contacto con la piel. Irrita
ojos, piel y vías respiratorias.
C. Propiedad amortiguadora de las proteínas: titulación con ácido.

Reactivos:
- Acido clorhídrico 0,01 N
- Solución indicadora de Rojo de Metilo. Vira de rojo (pH 4,2) a amarillo (pH
6,3).
- Suero sanguíneo.
- Suero desproteinizado : A una muestra de suero sanguíneo se la somete a
calentamiento (100°C durante 1 a 2 minutos). Posteriormente se filtra o
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centrifuga 5 min a 2000 rpm. Se descarta el precipitado. El sobrenadante

constituye el suero desproteinizado
Procedimiento:
Titular una fracción alícuota del suero y una del suero
desproteinizado, ambos diluidos 1/5 con agua destilada. La titulación se
realiza en presencia de 10 gotas del indicador rojo de metilo que al mezclar
con el suero se torna de color amarillo,.agregando HCl 0,01 N hasta cambio
de color a rosado pálido. Se mide el volumen de HCl gastados.
D. Solubilidad de la caseína a diferentes pH

Reactivos:
- Acido acético 1 N.
- Solución de caseína en acetato de sodio 0,1 N.
Procedimiento:
- Rotular nueve tubos de 1 a 9. En el tubo uno colocar 3,2 ml de ácido
acético 1 N y 6,8 ml de agua destilada, mezclar.
- Agregar 5 ml de agua destilada a los 8 tubos restantes.
- Tomar 5 ml de la solución del tubo 1 y verter en el tubo 2. Mezclar y
repetir la operación hasta el último tubo. Descartar los 5 ml finales.
- Medir el pH a cada solución (rango de pH esperado 3,5-5,9).
- Agregar 1 ml de caseína a cada tubo de la escala de pH y mezclar
inmediatamente por agitación.
- Observar la solubilidad de la caseína a distintos pH a tiempo cero (T0) y a
los 30 minutos (T30) de contacto.
E. Precipitación y desnaturalización de proteínas.
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Reactivos:
- Etanol de 95°
- Acetona
- Hidróxido de sodio conc.
- HCl conc.
- Solución de ovoalbúmina: separar la clara de huevo, medir su volumen y
batir durante unos minutos, mezclar con cinco volúmenes de agua destilada y
filtrar la mezcla a través de doble gasa.
Procedimiento:
• Precipitación de ovoalbúmina con solventes orgánicos: agregar
volúmenes iguales de alcohol y acetona a la solución de ovoalbúmina.
• Coagulación de ovoalbúmina: en una serie de tubos numerados del 1 al 4,
colocar en cada uno 2 ml de solución de ovoalbúmina y proceder a:
Tubo 1: calentar.
Tubo 2: agregar unas gotas de ácido clorhídrico concentrado (HCl).
Tubo 3: agregar solución concentrada de hidróxido de sodio (NaOH).
Tubo 4: usar como control.
• Explicar el fenómeno observado.
F. Determinación cuantitativa de proteínas.

Método de Lowry.
Reactivos:
1- NaOH 0,5 N
2- Reactivo 1: Se prepara en el momento de usar. Cada 10 ml de Na2CO3 2%
se agrega 0,1 ml de CuSO4.5 H2O 1% y 0,1 ml de Tartrato de Na y K 2,7 %.
3 – Reactivo de Folin-Ciocalteau. Se emplea una dilución ½.
195
El método como en todo método cuantitativo colorimétrico requiere de

la realización de una curva de calibración, también llamada curva estándar,
para lo cual se emplea una solución patrón de albúmina sérica bovina (BSA)
de 0,15 mg/ml.
Técnica: Rotular 8 tubos y agregar la solución estándar o las muestras y

los reactivos, según el siguiente protocolo:
BSA: H2O NaOH R1* Folin** DO
Tubo 0,15 mg/ml (ml) (ml) (ml) (ml) 750 nm
(ml)
1 (Blanco) ------- 0,20 0,4 2 0,2
2 (7,5 µg) 0,05 0,15
3 (15 µg) 0,10 0,10
4 (22,5 µg) 0,15 0,05
5 (30 µg) 0,20 -------
M0
M1
M2
* Mezclar y esperar 10 minutos antes de agregar el Reactivo de Folin
** Mezclar y leer exactamente a los 30 minutos la DO a 750 nm.
Curva de Calibración: graficar en papel milimetrado los valores de
DO en función de los de µg de BSA.
Valoración de las muestras desconocidas: Para determinar la cantidad
de proteínas presentes en las muestras problemas se debe interpolar sus valores a
partir de las DO determinadas. En base al contenido de proteínas determinadas
por este método y conociendo los volúmenes y diluciones empleados para la
determinación, se puede calcular la concentración de proteínas de las muestras
problema en mg/ml.
196
ENZIMAS
Definición de enzimas. Nomenclatura y clasificación. Actividad enzimática.
Velocidad de reacción. Cinética enzimática.
Las reacciones químicas de los sistemas biológicos raramente ocurren

en ausencia de un catalizador. Estos catalizadores se denominan enzimas y
son casi en su totalidad de naturaleza proteica, con la excepción de un
pequeño grupo de moléculas de RNA catalítico (ribozimas). Las funciones
vitales de cualquier célula serían imposibles de mantener si las reacciones que
ocurren en ellas fueran extremadamente lentas. Además de incrementar la
velocidad de las reacciones, las enzimas exhiben una elevada especificidad y
en algunos casos pueden ser reguladas por diferentes metabolitos que
aumentan o disminuyen su actividad.
Las enzimas, como todos los catalizadores, son efectivas en pequeñas
cantidades, no sufren modificaciones químicas irreversibles durante la
catálisis ni afectan el equilibrio de las reacciones que catalizan. Aunque los
estadios inicial y final de una reacción son los mismos con y sin un
catalizador, su presencia hace que se llegue al equilibrio mucho más
rápidamente, es decir, sólo modifican la velocidad de la reacción.
Por otro lado, debido a su naturaleza proteica, las enzimas comparten
características con las proteínas no enzimáticas y difieren de los catalizadores
inorgánicos en que:
Son termolábiles y su actividad depende en la mayoría de los casos del pH
del medio.
El reconocimiento de la enzima por su sustrato es altamente específico.
Tienen gran eficiencia, es decir, transforman un gran número de moléculas
de sustrato por unidad de tiempo.
197
Están sujetas a una gran variedad de controles celulares, genéticos y

alostéricos.
Nomenclatura y clasificación de las enzimas

Muchas enzimas han sido designadas añadiendo el sufijo -asa al
nombre del sustrato, es decir, la molécula sobre la cual ejerce su actividad
catalítica. Por ejemplo, la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea y la arginasa
cataliza la hidrólisis de la arginina. Otras enzimas han recibido su nombre en
función del tipo de reacción que catalizan; así la Gliceraldehído-3-fosfato-
deshidrogenasa cataliza la deshidrogenación (oxidación) del Gliceraldehído-
3-fosfato a 3-fosfoglicerato. Incluso tienen nombres específicos que no dan
información alguna del sustrato que transforman o de la reacción que
catalizan, como por ejemplo la tripsina (enzima proteolítica).
No obstante, existe una clasificación sistemática de las enzimas que
las divide en seis grandes grupos, cada uno de los cuales se subdivide a su
vez en clases:
1: Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reducción)
2: Transferasas (transfieren grupos funcionales)
3: Hidrolasas (reacciones de hidrólisis),
4: Liasas (reacciones de adición a los dobles enlaces)
5: Isomerasas (reacciones de isomerización)
6: Ligasas (formación de enlaces con consumo de ATP).
Actividad enzimática
El estudio o investigación de una actividad enzimática involucra dos
aspectos: uno cualitativo y otro cuantitativo.
Análisis cualitativo:
198
Consiste en poner de manifiesto la presencia de la enzima en estudio,

mediante la observación de la transformación del sustrato de la enzima en un
producto dado, mediante reacciones que involucren un cambio de color,
aparición de gas, cambio de pH, variación de viscosidad o de otro parámetro
físico, etc.
Análisis cuantitativo:
Consiste en determinar la cantidad de enzima presente en un sistema;
para ello se recurre a la medida de la velocidad de la reacción catalizada por la
enzima que se ensaya. Esto es posible debido que, en condiciones adecuadas,
la velocidad de una reacción enzimática es directamente proporcional a la
cantidad de enzima presente.
Velocidad de reacción:
Se entiende por velocidad de una reacción química a la variación de la
concentración de reactivos o de productos en función del tiempo. Así, la
velocidad de una reacción enzimática puede medirse como la velocidad de
utilización del sustrato o bien como la velocidad de formación de uno de los
productos. De esta manera, se puede expresar la cantidad de enzima en
términos de unidades enzimáticas, entendiéndose por Unidad de Enzima a la
cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol de
sustrato por minuto bajo condiciones definidas de temperatura y pH .
Cuando la actividad de una enzima se relaciona con el contenido
proteico de la preparación enzimática, se la denomina Actividad Específica y
se expresa como el número de unidades de enzima por miligramo de proteína
(UE/mg). La actividad específica de una enzima indica el grado de pureza de
la preparación enzimática y es máxima cuando la enzima se encuentra pura.
199
Otra unidad empleada para expresar la actividad de una enzima,

especialmente en los campos de medicina y bioquímica, es el Katal (kat). Un
katal es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 mol de
sustrato por segundo. Esta unidad introducida recientemente por la Unión
Internacional de Bioquímica: 1 kat equivale a 60 x 106 UE. Debido a que se
trata de una unidad muy grande, frecuentemente se utilizan submúltiplos
como microkatal (µkat) y nanokatal (nkat). También suele emplearse la
Actividad Molecular (número de recambio): es el número de moléculas de
sustrato transformadas por minuto por una molécula de enzima. Se calcula
dividiendo la velocidad máxima de la enzima por el peso molecular; es una
característica de las enzimas individuales y no refleja la pureza de la
preparación.
Cinética enzimática
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas
por enzimas. Los estudios cinéticos proporcionan información directa acerca
del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad de la enzima. La
velocidad de una reacción enzimática puede determinarse midiendo la
aparición de los productos o bien la desaparición de los reactivos como
función del tiempo. Al medir la aparición de producto (o la desaparición del
sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance o de
progreso de la reacción (Figura 1), o simplemente, la cinética de la reacción.
A medida que la reacción transcurre, la velocidad de aparición del
producto (pendiente de la curva en cada punto) va disminuyendo porque se va
consumiendo el sustrato de la reacción.
200
10
Curva de progreso de la reacción

de Producto
6
[P] Mm
Concentración
[S]O = 1 KM
4
vo
2
(mM)
0
0 100 200 300 400 500 600
TIEMPO (min)
Tiempo (minutos)
–■– Valores medidos -- Velocidad inicial (v0)
Para que los valores determinados reflejen la cantidad de enzima

presente en la preparación siempre se procede a medir la velocidad inicial de
la reacción (v0) que es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo
cero. Así, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total
del sustrato, entonces puede considerarse la concentración molar del sustrato
([S]) como esencialmente constante a lo largo del ensayo. En estas
condiciones no es necesario considerar la reacción inversa ya que la cantidad
de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre.
E+S P+E
En la práctica se debe determinar el rango de tiempo en el que la

variación de la concentración del producto formado (o de sustrato consumido)
es directamente proporcional al tiempo de la reacción. Por ejemplo, en la
201
Figura 1 se observa una respuesta lineal hasta los 50 minutos de incubación;

en consecuencia, para medir la actividad de esa enzima basta con incubar
como máximo durante tiempos inferiores a 50 minutos (por ejemplo 30 ó 40
minutos) y de esta manera estamos seguros de medir actividades
correspondientes a la velocidad inicial de la enzima.
Factores que afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas

La velocidad de las reacciones enzimáticas es afectada por una serie de
factores tales como pH, temperatura, concentración de enzima, concentración
de sustrato y presencia de moléculas efectoras (activadores o inhibidores de la
enzima).
La determinación de la actividad enzimática se realiza generalmente en
las condiciones óptimas de pH y temperatura, en presencia de cofactores y en
concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de
reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). Sin embargo, dichas
condiciones deben ser cambiadas cuando se quiere estudiar el efecto de
alguna de estas variables (pH, temperatura, concentración de sustrato, etc.) o
de otros factores (inhibidores o activadores) sobre la velocidad de la reacción.
Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción.

La concentración del sustrato es uno de los principales factores que
determinan la velocidad de una reacción enzimática. La relación entre la
concentración de sustrato y la velocidad de la reacción enzimática puede
expresarse de manera cuantitativa a través de la ecuación de Michaelis-
Menten.
V= Vmax. [S] / Km+[S]
202
Km representa:
1. Constante de equilíbrio de disociación del complejo ES
2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato
3. Concentración de sustrato para la que la velocidad se hace igual a la mitad
de La máxima (V 0.5)
4. Se define para un dado complejo enzima-sustrato
5. Se mide en unidades de concentración
Km
Considerando la recíproca de la ecuación de Michaelis Menten obtenemos la

ecuación de Lineaweaver Burk
203
Experimentación
ENZIMAS
Objetivos
• Determinar la actividad de una enzima hidrolítica (invertasa ácida soluble
de Ricinus communis) mediante métodos espectrofotométricos.
• Determinar la velocidad inicial de la enzima (efecto del tiempo de
incubación).
• Determinación del pH óptimo de enzima mediante el ensayo del efecto del
pH sobre la actividad de enzima.
• Determinar la KM y la Vmax de la enzime mediante el estudiao del efecto de
la concentración de sustrato.
Análisis cuantitativo de la actividad enzimática

Invertasas:
Son hidrolasas involucradas en el metabolismo de los hidratos de
carbono de especies vegetales. También se las denomina β-D
fructofuranosidasa pues hidrolizan el enlace glicosídico entre la fructosa y la
glucosa del disacárido sacarosa. La sacarosa es un azúcar no reductor pues no
tiene grupos carbonilos libres. La hidrólisis enzimática del disacárido origina
glucosa y fructosa, ambos azúcares reductores. Por lo tanto, la actividad de
esta enzima se puede medir mediante la aparición del poder reductor de
la glucosa y fructosa originadas, según la siguiente reacción:
204
INVERTASA
SACAROSA GLUCOSA + FRUCTOSA
No Reductor Reductores
Las invertasas atacan al disacárido desde el residuo de fructosa y

aunque su principal sustrato es la sacarosa (Glu-Fru), algunas también
hidrolizan otros oligosacáridos β-D fructósidos como la rafinosa (Gal-Glu-
Fru) y la estaquiosa (Gal-Gal-Glu-Fru), aunque en menor proporción.
INVERTASA
RAFINOSA GAL-GLU + FRUCTOSA
INVERTASA
ESTAQUIOSA GAL-GAL-GLU + FRUCTOSA
A. Determinación de azúcares reductores por el Método de Somogyi-

Nelson
Fundamento:
Los azúcares con un grupo aldehído o cetona libre son capaces de
reducir los iones Cu++ del Reactivo alcalino de Somogyi, en iones Cu+, que al
reaccionar con el ácido arseno-molíbdico del Reactivo de Nelson producen
compuestos coloreados que se leen fotocolorimétricamente a 520 nm.
205
Reactivos:
a) Reactivo cúprico de Somogyi. Se prepara en el momento de usar
mezclando 1 volumen de la solución A con 9 volúmenes de la solución B:
Solución A: CuSO4.5 H2O al 10 %.

Solución B: Disolver 28 g. de Na2HPO4 anhidro en 700 ml de agua destilada.
Agregar 40 g de Tartrato de Sodio y Potasio. 4 H2O. Cuando la disolución es
completa agregar 100 ml de NaOH 1N y 120 g de Na2SO4 anhidro. Llevar a
900 ml con agua destilada y dejar en reposo durante 48 horas, filtrar y guardar
en frasco color caramelo.
b) Reactivo de Nelson. Disolver 25 g de molibdato de amonio. 4 H2O en 450
ml de agua destilada, añadir 21 ml de H2SO4 concentrado. Luego de mezclar
con cuidado (reacción exotérmica) y agregar 3 g de arseniato disódico. 7 H2O.
Dejar en reposo durante 48 horas a temperatura ambiente, filtrar y guardar en
frasco color caramelo.
c) Glucosa 1 mM, como solución estándar.
Procedimiento: cargar tubos con cantidades crecientes de la solución de

glucosa, entre 0,05 y 0,30 µmoles, para realizar la curva estándar y diluciones
de las muestras problema centrifugadas para su valoración. Completar con
agua destilada hasta 0,5 ml, agregar 0,5 ml del Reactivo de Somogyi y
calentar en BM hirviente durante 15 minutos. Enfriar, agregar 0,5 ml del
Reactivo de Nelson y 1 ml de agua destilada. Mezclar y leer a 520 nm.
Procesar simultáneamente un Blanco de Reactivos. Graficar la DO leída en
función de µmoles de glucosa y determinar la concentración de azúcares
reductores de las muestras problema.
Sensibilidad del Método: 0,05-0,3 µmoles de azúcares reductores.
206
Curva estándar de azúcares reductores (Somogyi-Nelson)

Solución estándar: glucosa 1mM (1 µmol/ml).
Tubo Glucosa H 2O Reactivo Reactivo H 2O
(ml) (ml) Somogyi Nelson (ml)
(ml) (ml)
0 0 0,50 0,50 100 0,50 1 Leer
1 0,10 0,40 ºC DO
2 0,15 0,35 15 520
3 0,20 0,30 min. nm
4 0,25 0,25
5 0,30 0,20
B. Determinación del efecto del tiempo de incubación sobre la

actividad de la enzima
Tubo Buff. 0,2 Sac. 0,3 M H2O d. Enzima Tiempo

M pH 5,5 (ml) (ml) (ml) (minutos)
T0 0,2 ml 0,1 ------- 0,2 0
T5 0,2 ml 0,1 ml ------- 0,2 5
T10 0,2 ml 0,1 ml ------- 0,2 10
T20 0,2 ml 0,1 ml ------- 0,2 20
Cont. 0,2 ml 0,1 ml 0,2 ------- 0
Sac T0
Cont. 0,2 ml 0,1 ml 0,2 ------- 5
Sac.T5
Cont. 0,2 ml 0,1 ml 0,2 ------- 10
Sac T10
Cont. 0,2 ml 0,1 ml 0,2 ------- 20
Sac T20
Cont. Ez. 0,2 ml ------- 0,1 0,2 20
207
1- Cargar los tubos de acuerdo al esquema, iniciar la reacción

con el agregado de la enzima, incubar en baño termostatizado a 37 ºC el
tiempo indicado en cada caso y finalizar la reacción mediante el
agregado de 0,5 ml del Reactivo de Somogyi.
2- En cada tubo determinar los azúcares reductores que se
formaron durante la reacción enzimática según el método de Somogyi-
Nelson (medir la DO 520 nm).
3- Estimar la DO que corresponde a los nuevos azúcares
reductores formados (∆ DO = DO mezcla – DO Cenz. – DO Csust.).
4- Transformar los datos de DO en micromoles de azúcares
reductores usando una curva estándar del método empleado.
5- Transformar los micromoles de azúcares reductores en
micromoles de sacarosa hidrolizado (dividiendo en 2).
6- Calcular y expresar la velocidad inicial para cada tiempo
como micromoles de sacarosa hidrolizados por minuto (dividiendo en
los minutos que se incubó cada mezccla).
7- Confeccionar en papel milimetrado un gráfico de v en
función de tiempo.
208
C. Determinación del efecto de la concentración de sustrato sobre

la actividad de la enzima
Tubo Sac Sac Sac Sac Sac Buff. H 2O Enzima

pH 5,5 d.
0,025 0,05 0,10 0,20 0,30
M M M M M
0 ------- ------- ------- ------- ------- 0,2 ml 0,1 ml 0,2 ml

(C.Ez)
5 mM 0,1 ml ------- ------- ------- ------- 0,2 ml ------- 0,2 ml
C. 5 0,1 ml ------- ------- ------- ------- 0,2 ml 0,2 ml -------

mM
10 ------- 0,1 ml ------- ------- ------- 0,2 ml ------- 0,2 ml
mM
C. 10 ------- 0,1 ml ------- ------- ------- 0,2 ml 0,2 ml -------
mM
20 ------- ------- 0,1 ml ------- ------- 0,2 ml ------- 0,2 ml
mM
C. 20 ------- ------- 0,1 ml ------- ------- 0,2 ml 0,2 ml -------
mM
40 ------- ------- ------- 0,1 ml ------- 0,2 ml ------- 0,2 ml
mM
C 40 ------- ------- ------- 0,1 ml ------- 0,2 ml 0,2 ml -------
mM
60 ------- ------- ------- ------- 0,1 ml 0,2 ml ------- 0,2 ml
mM
C. 60 ------- ------- ------- ------- 0,1 ml 0,2 ml 0,2 ml -------
mM

con el agregado de la enzima, incubar en baño termostatizado a 37 ºC
durante 15 minutos y finalizar la reacción mediante el agregado de 0,5
ml del Reactivo de Somogyi.
209

6- Calcular y expresar la velocidad inicial para cada
concentración de sustrato como micromoles de sacarosa hidrolizados
por minuto (dividiendo en 15 minutos).
función de concentración de sustrato.
210
D. Determinación del efecto del pH sobre la actividad enzimática
Tubo Buff. Buff. Buff. Buff. Buff. Sac. H 2O Ez.

pH 2,5 pH 3,5 pH 4,5 pH 5,5 pH 6,5 0,3 M d.
2,5 0,2 ml ------- ------- ------- ------- 0,1 ml ------- 0,2 ml
C Sac 0,2 ml ------- ------- ------- ------- 0,1ml 0,2 ml -------
2,5
3,5 ------- 0,2 ml ------- ------- ------- 0,1 ml ------- 0,2 ml
C. Sac ------- 0,2 ml ------- ------- ------- 0,1 ml 0,2 ml -------
3,5
4,5 ------- ------- 0,2 ml ------- ------- 0,1 ml ------- 0,2 ml
C. ------- ------- 0,2 ml ------- ------- 0,1 ml 0,2 ml -------
Sac.
4,5
5,5 ------- ------- ------- 0,2 ml ------- 0,1 ml ------- 0,2 ml
C Sac. ------- ------- ------- 0,2 ml ------- 0,1 ml 0,2 ml -------
5,5
6,5. ------- ------- ------- ------- 0,2 ml 0,1 ml ------- 0,2 ml
C Sac. ------- ------- ------- ------- 0,2 ml 0,1 ml 0,2 ml -------
6,5
C. Ez. ------- ------- ------- ------- ------- ------- 0,4 ml 0,2 ml

con el agregado de la enzima, incubar en baño termostatizado a 37 ºC
durante 15 minutos y finalizar la reacción mediante el agregado de 0,5
ml del Reactivo de Somogyi.
211

6- Calcular y expresar la velocidad inicial para cada pH como
micromoles de sacarosa hidrolizados por minuto (dividiendo en 15
minutos).
función de pH.
212
ÁCIDOS NUCLEICOS
Definición de ácidos nucleicos. Composición. Bases nitrogenadas. Estructura de los
nucleósidos, nucleótidos y polinucleóticos. ADN conformación. ARN. Tipos. Función
INTRODUCCION
Los ácidos nucleicos son las biomoléculas portadoras de la
información genética. Tienen una estructura polimérica, lineal, cuyos
monómeros son los nucleótidos. Son moléculas formadas por centenares de
millones de nucleótidos en una sola estructura covalente. El nucleótido está
formado por un fosfato esterificado a una pentosa, la que a su vez está unida
por un enlace β-glicosídico a una base nitrogenada.
De la misma manera que las proteínas son polímeros lineales
aperiódicos de aminoácidos, los ácidos nucleicos lo son de nucleótidos. La
aperiodicidad de la secuencia de nucleótidos implica la existencia de
información. Los ácidos nucleicos constituyen el depósito de información de
todas las secuencias de aminoácidos de todas las proteínas de la célula. Existe
una correlación entre ambas secuencias, lo que se expresa diciendo que ácidos
nucleicos y proteínas son colineares; la descripción de esta correlación es lo
que llamamos Código Genético, establecido de forma que a una secuencia de
tres nucleótidos en un ácido nucleico corresponde un aminoácido en una
proteína. Además hay ácidos nucleicos implicados en la transmisión y
procesado de la información genética, otros con funciones catalíticas
(ribozimas), y hay secuencias regulatorias que controlan la expresión de
diferentes genes (hormonas, factores de crecimiento, señales químicas en
general).
213
La hidrólisis enzimática completa de un ácido nucleico da lugar a una

mezcla de nucleótidos. La hidrólisis completa de un nucleótido da lugar a una
mezcla equimolar de:
• Una Base nitrogenada heterocíclica, que puede ser de dos tipos:

Purina o Pirimidina
• Una Pentosa, que puede ser Ribosa o 2-Desoxirribosa
• Ortofosfato
Bases nitrogenadas
Las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos son bases heterocíclicas
que pertenecen a una de dos familias:
Unas están basadas en el Anillo pirimidínico, las Pirimidinas que
constituyen un sistema plano de seis átomos, cuatro carbonos y dos
nitrógenos. Los átomos del anillo pirimidínico tienen la siguiente numeración:
N1: C2: N3: C4: C5: C6:
N3 4 5
2 6
1
N
Las distintas bases pirimidínicas se obtienen por sustitución de este
anillo con grupos oxo (=O), grupos amino (-NH2) o grupos metilo (-CH3).
O O NH2
CH3 H
H N N N
O N O N O N
H H H
TIMINA URACILO CITOSINA
2,4 di oxo 5 metil pirimidina 2,4 di oxo pirimidina 2 oxo 4 amino pirimidina
214
Timina se encuentra sólo en la molécula de ADN; Uracilo sólo se

encuentra en el ARN y Citosina es común a ambos ácidos nucleicos.
La otra familia de bases nitrogenadas está basada en el Anillo purínico,
son las Purinas, las que constituyen un sistema plano de nueve átomos, cinco
carbonos y cuatro nitrógenos. El anillo purínico puede considerarse como la
fusión de un anillo pirimidínico con uno imidazólico. Ambas bases púricas
(Adenina y Guanina) se encuentran tanto en ADN como en ARN. Los átomos
del anillo purínico se numeran de la forma siguiente: N1: C2: N3: C4: C5: C6:
N7: C8: N9
N
N1 6
5 7
8
2 4 9
3
N N
H
PURINA
NH2 O
H N
N N
N
N N N
N NH2
H H
ADENINA GUANINA
6 amino purina 2 amino 6 oxo purina
Nucleósidos
La unión de una base nitrogenada a una pentosa da lugar a los
compuestos llamados nucleósidos. Obsérvese el sufijo ósido, característico de
todos los glicósidos. La pentosa puede ser D-Ribosa (D-ribofuranosa), en
cuyo caso hablamos de Ribonucleósidos, o bien 2-D-Desoxirribosa (D-
desoxirribofuranosa), constituyendo los Desoxirribonucleósidos. Todos los
nucleósidos son del tipo anomérico beta. Esto nos introduce a la distinción
215
básica entre ADN (constituído por desoxirribonucleótidos) y ARN (por

ribonucleótidos), que está dada por las distintas pentosas y bases nitrogenadas.
Nucleótidos
Cuando un ortofosfato se esterifica a alguno de los -OH de la pentosa
de un nucleósido, la estructura resultante se llama nucleótido. En los
ribonucleósidos, el ortofosfato puede esterificarse en tres posiciones distintas:
2', 3' y 5'. En los desoxirribonucleósidos, la esterificación con grupos fosfato
se da en 3´, 5´ de la pentosa.
La pentosa se une a la base nitrogenada por un enlace N-glicosídico que
se establece entre el átomo de C1´ del azúcar y el átomo de N9 de las bases
púricas o el N1 de las bases pirimidínicas. El grupo fosfato se halla unido por
un enlace éster al átomo C5´ de la pentosa.
NH2
N
- N
O
5' N N Nucleótido de ADN
- O
O P O CH 2 Desoxiadenosina 5´monofosfato (AMP)
4' H H 1'
O
H H
3' 2'
OH H
Además de los nucleótidos formados por un ortofosfato aparecen entre

las biomoléculas nucleótidos formados con un polifosfato. Ej. ADP, ATP.
NH2
- - N
N Adenosina 5´difosfato (ADP)
O O
5' N
ON
-
O P O P O CH 2
4' H 1'
O O H
H H
3' 2'
OH OH
216
Aparte de su carácter como monómeros de ácidos nucleicos, la

estructura de nucleótido está generalizada entre las biomoléculas, y
particularmente como coenzimas, por ej. NADP, FAD, CoA.
Polinucleótidos
Dos nucleótidos pueden unirse a través de un enlace fosfodiéster. Un
nucleótido está fosforilado en 3' y este fosfato, a su vez, esterifica al 5'-OH del
siguiente nucleótido
El enlace así establecido se llama enlace
fosfodiéster, y es característico de los ácidos
nucleicos. A su vez, el grupo 3' -OH del segundo
nucleótido puede esterificarse a otro fosfato que
por su parte se esterifica al 5'-OH del siguiente
nucleótido y este último se une de la misma
manera a otro nucleótido y así sucesivamente.
Convencionalmente los polinucleótidos se numeran desde el residuo 5'
terminal, que es aquel que tiene un 5'-OH libre (extremo 5') el cual muy
frecuentemente aparece esterificado a un fosfato o polifosfato mientras que en
el extremo opuesto de la molécula hay un grupo 3' -OH libre que recibe el
nombre de extremo 3'.
Las enzimas que hidrolizan polinucleótidos, genéricamente llamadas
nucleasas, son, por lo tanto, fosfodiesterasas (su acción consiste en la
hidrólisis de un fosfodiéster).
Acido Desoxirribonucleico, ADN

La conformación B del ADN fue propuesta por Watson y Crick en su
trabajo original de 1953. Son dos cadenas de polinucleótidos enrollados uno
217
en torno a otro, constituyendo una doble hélice dextrógira de tipo

plectonémico (lo cual quiere decir que para separar uno de otro es preciso
desenrollar previamente la hélice). Puede observarse que las bases están en
planos aproximadamente perpendiculares al eje mayor de la doble hélice y
dirigidas hacia dentro de la estructura mientras que las desoxirribosa-fosfato
se dirigen hacia el exterior.
Los dos polinucleótidos así estructurados tienen polaridad opuesta.
En uno de sus extremos hay un grupo 5'-OH libre, el extremo 5' mientras que
en el otro extremo hay un grupo 3'-OH libre, el extremo 3'
El otro polinucleótido presenta una
polaridad opuesta. Su extremo 5' está del mismo
lado que el 3' del otro polinucleótido; mientras
que el extremo 3' está del lado del 5' del otro
polinucleótido, son por lo tanto, antiparalelos.
Los dos polinucleótidos interaccionan
entre sí mediante enlaces de hidrógeno
establecidos entre las bases nitrogenadas de uno
y de otro. Esta interacción sólo puede tener lugar
entre adenina y timina (el par A-T) entre las
que se establecen dos enlaces de hidrógeno. O bien, entre guanina y citosina
(el par G-C) entre las que se establecen tres enlaces de hidrógeno.
La estructura del DNA se mantiene gracias a los enlaces de hidrógeno
establecidos entre las bases, por una parte, y a una interacción de naturaleza
hidrofóbica que se da entre pares de bases contiguos, la interacción de
apilamiento (stacking).
218
Conformación A
La conformación A del ADN aparece en cristales de baja hidratación y
menor grado de polimerización que el ADN-B. Se trata de una estructura más
ancha y corta que el ADN-B.
Conformación Z
La conformación Z del ADN aparece fundamentalmente en zonas
ricas en el par G-C.
Existen algunas diferencias entre la conformación Z y las otras dos. En primer
lugar las hélices son levógiras, es una doble hélice más estrecha y alargada
que el ADN-B.
También puede hallarse ADN en las mitocondrias o en los cloroplastos
(células eucariotas) o los plásmidos (células procariotas), virus y
transposones.
219
El ADN mitocondrial y cloroplastídico

Las mitocondrias poseen su propio ADN, no asociado con histonas, que
se replica dentro del mismo orgánulo y forma nuevas mitocondrias (o
cloroplastos, en el caso de las células vegetales) por división simple;
asimismo, se transcribe y se traduce -aunque a escasas proteínas. En
aproximadamente ¾ de todas las especies de plantas, el gameto masculino no
aporta los cloroplastos al cigoto. De modo semejante, en animales (incluidos
los humanos) el espermatozoide no contribuye con citoplasma al huevo
fecundado y, en consecuencia, las mitocondrias son de origen materno.
El ADN adicional de las bacterias: los plásmidos

Aunque las bacterias contienen en su cromosoma todos los genes
necesarios para su crecimiento y reproducción, se ha encontrado, virtualmente
en todos los tipos de bacterias, moléculas de ADN adicionales conocidas
como plásmidos. Los plásmidos son, al igual que el cromosoma bacteriano,
circulares y auto replicantes y van asociados a alguna cualidad o factor que
otorgan a la célula huésped. En algunos casos la replicación es independiente
y, entonces, la bacteria puede contener múltiples copias.
Los más conocidos son el plásmido o factor F (sexual) y el R (resistente
a las drogas). La transferencia de plásmidos, y con ellos las características que
proveen a la bacteria, se lleva a cabo por conjugación o por transformación
(pasando simplemente, de una célula a otra a través de las membranas).
Propiedades:
• Absorción de luz UV a 260 nm. En el ADN doble hélice se da el
fenómeno de hipocromismo: el ADN desnaturalizado por el calor
absorbe un 20-30 % más que el ADN nativo
• Reacción positiva de los polidesoxirribonucleótidos a la difenilamina y al
220
reactivo de Schiff
• Reacción con orcinol
• Reacción con agentes intercalantes (acridinas)
• Resistencia a hidrólisis por álcalis.
• Metilación de purinas: por tratamiento con dimetil sulfato (DMS) y
calentamiento a pH neutro se produce la metilación de las purinas. El
tratamiento a pH bajo produce la ruptura del enlace glicosídico con
formación de un sitio apurínico. El tratamiento posterior con ácido
diluido rompe la cadena por el sitio apurínico.
• El tratamiento de ADN con hidrazina rompe el enlace glicosídico de las
pirimidinas, quedando un sitio apirimidínico; el tratamiento posterior con
piperidina rompe la cadena por el sitio apirimidínico
-
O O H H -
O O H H
N N
P P
- -
O O
O N O N
H2C N O H2C N O
O O
-
O O -
O O
P O P Sitio apurínico
- H3C H -
O O
O N N O
H
N
H2 C N N H2C OH
H
. O O
-
O O -
O O
P O P O
- -
O H3C H O H3C H
O N O N
pH bajo
H2 C N O H2C N O
O O
- O H - O H
221
-
O O H H
-
O O H H
N N
P P
- -
O O
O N O N
H 2C N O H2C N O
O O
-
O O -
O O
P O P O
- H -
O H3C H
O N
O N N O N
H H
N N
H2C N H 2C N N
N
H H
O O
- O
O O
- H H
O O- H H -
O OO
N N
P
P P O DMS P
-
O
- -O -
O O
O H C HN H 3C O H N
O O 3 N O N
H 2C N O H 2C H 2C N O
H2C N O N O
O O O O
O -O O O
- H -
O O-O O H
H N H N
P P P P
- - -
O -O O
O O Sitio
N
N
apurínico OO O- N
N
H2CH C N H 2C N N
2 N
O OH O
O
O O
- O -
O O O-
P O P O
- -
O H 3C H Ácido diluído O H3C H
O O N
N
H 2C H 2C N O
N O
O O
-
O O H -
O O H
H N H N
P P
- -
O O N
O N O N
N
H 2C N H 2C N N
N
O O
O O
• Ruptura enzimática de polinucleótidos: a) Endonucleasas: atacan

enlaces fosfodiéster situados en el interior de una cadena polinucleotídica,
y suelen ser específicas de cada ácido nucleico Ribonucleasas,
Desoxirribonucleasas b) Exonucleasas: atacan enlaces fosfodiéster
situados en los extremos (3’ o 5’) de una cadena polinucleotídica, y suelen
222
• atacar indistintamente ambos tipos de ácidos nucleicos. Ruptura tipo

a: Da lugar a una mezcla de 5’-nucleótidos y Ruptura tipo b: Da lugar a
una mezcla de 3’-nucleótidos
-
O O
O O
P
- H H
O N N
O N O N
H H
N -
O P O CH2 N
H2C N N N
N O H
O H O-
OH
-
O O
H H H H
P N N
-
O
O
N N
O
H2C -
N O O P O CH2 N O
O O
O-
-
O O OH
P O O
- H3C H
O H3C H
O N N
O
-
H2C O P O CH2 N O
N O O
O O-
- O OH H
O H H N
H N
P
-
O N N
O N N
O
- N
H2C N O P O CH2 N
N O
O O-
O OH
223
Los fragmentos de restricción del DNA pueden separarse mediante

técnicas electroforéticas. Una vez separados, se tratan con bromuro de etidio
(un agente intercalante) y se observan bajo luz UV.
Ácido Ribonucleico, ARN

Sin importar el tipo de ARN del que se trate, el producto de la transcripción es
siempre una cadena simple de ARN. Las monohebras tienden a adoptar una
conformación helicoidal con giro a la derecha, dirigida por las interacciones
del apilamiento de bases.
• Reactividad Química: El RNA, al tener el grupo 2’-OH, es mucho más
reactivo químicamente que el DNA. En concreto, puede ser
completamente hidrolizado por álcali a una mezcla de 2’- y 3’-nucleótidos.
• Estructura tridimensional: Las formas en doble hélice del RNA adoptan
la configuración A (en lugar de la B, propia del DNA), así como los
híbridos DNA-RNA.
• Tamaño molecular: Aun con ser grande, es de bastante menor tamaño
que el DNA.
• Funciones: El ácido ribonucleico (RNA, ARN) cumple una serie de
importantísimas funciones en la célula,
1- RNA mensajero (mRNA), que porta la información necesaria para el
establecimiento de una secuencia correcta de aminoácidos por parte de la
maquinaria de síntesis proteica
2- A su vez, el mRNA deriva del transcrito primario o RNA nuclear
heterogéneo (HnRNA), que es el primer producto de la transcripción y
sufre una serie de modificaciones antes de convertirse en mRNA.
3- RNAs nucleares pequeños (snRNA) o RNAs nucleolares pequeños
(snoRNA), que participan en la conversión de HnRNA en mRNA.
4- RNA de transferencia (tRNA), al cual se unen los distintos aminoácidos,
224
que quedan así activados y aptos para integrarse en la biosíntesis de

proteínas.
5- RNA ribosómico (rRNA) que integra, junto con proteínas, la partícula
conocida como ribosoma.
6- RNAs genómicos: en algunos virus, el RNA es el material genético. En
ciertos casos, este RNA se retrotranscribe a DNA mediante el proceso de
transcripción inversa y se integra en el genoma del huésped; es el caso de
los retrovirus.
7- RNAs como enzimas: Algunos RNA son capaces de catalizar reacciones
químicas del mismo modo que las enzimas, son las ribozimas. Participan
en el procesado del RNA transcrito primario (mRNA) y en la formación de
enlace peptídico en la síntesis de proteínas.
- N
O
5' O N
- O Nucleótido de ARN
O P O CH 2
Uridina 5´monofosfato
4' H 1'
O H
H H
3' 2'
OH OH
225
Experimentación
Ácidos nucleicos: ARN y ADN
Objetivos
• Obtener el ácido ribonucleico precipitado de la levadura de cerveza.

• Obtener el ácido desoxirribonucleico precipitado del timo de ternera
• Comprobar la solubilidad de los ácidos nucleicos en diferentes solventes.
• Realizar la hidrólisis de los ácidos nucleicos obtenidos.
• Verificar el resultado de la hidrólisis a través de reacciones características
de cada uno de sus componentes.
A. Obtención de ácido ribonucleico

Disgregar 50 g de levadura (Saccharomyces cerevisiae) y disolver en
150 ml de NaOH al 0,3%. Calentar a Baño María (B.M), 100°C. durante 30
minutos removiendo de vez en cuando. Enfriar y agregar ácido acético glacial
hasta reacción ligeramente ácida, enfriar y filtrar para eliminar las proteínas.
Verter la solución agitando vigorosamente en 20 ml de alcohol etílico al 95%
el que contiene 2 ml de HCl 36%. Dejar reposar y lavar el precipitado 2 veces
con etanol, por decantación y luego con éter, decantar el exceso de líquido,
transferir a un papel de filtro y secar el residuo por aspiración sobre Büchner
con bomba de vacío. Usar el precipitado así obtenido para estudiar las
propiedades del ácido nucleico como sigue:
1. Solubilidad: Evaluar la solubilidad en agua fría y caliente y en alcohol
2. Solubilidad en álcalis: Agregar HCl 10% hasta que la solución se torne
ácida y luego NaOH 2 N. Observar.
226
3. Hidrólisis: A una cantidad pequeña de precipitado agregar 10 ml de H2SO4

10% y calentar a ebullición durante 10 min.
4. Ensayo con pentosas: Colocar 2 ml de hidrolizado en un tubo de ensayo,
agregar unas gotas de reactivo de Bial y calentar en B.M. a ebullición durante
3 minutos. La aparición de un color verde revela la presencia de pentosas. El
reactivo de Bial contiene orcinol en ácido clorhídrico y forma complejos sólo
con las pentosas.
Reactivo de Bial: 300 ml de HCl concentrado en 250 ml de agua destilada.
Añadir 1,5 g de orcinol y 8 gotas de cloruro férrico al 1%
5. Ensayo de fosfatos: Agregar un ligero exceso de amoníaco, acidificar con

ácido nítrico y agregar molibdato de amonio 10% a la solución en ebullición.
Un precipitado color amarillo revela la formación de fosfomolibdato de
amonio.
H3PO4 + 3 NH3 + 24 HNO3 + 12 (NH4)2MoO4 12 MoO3PO4 (NH4)3 + 24 NH4NO3 + 12 H2O
6. Ensayo de bases: Colocar 2 ml del líquido hidrolizado en un tubo de
ensayo y añadir unas gotas de solución de Ag NO3 0,1 M, un precipitado
blanco indica la presencia de bases. Las mezclas de bases nitrogenadas
precipitan por el agregado de soluciones de plata.
227
B. Aislamiento del ácido desoxirribonucleico

El método consta de cinco pasos:
1. Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-proteína).
El propósito de esta primera etapa es aislar, en fracciones diferentes, los
complejos nucleoproteicos que se encuentran presentes en el timo de ternera:
la ribonucleoproteína (RNP) y la desoxirribonucleoproteína (dRNP).
Esta separación se consigue homogeneizando el tejido en una solución
salina de baja fuerza iónica (ClNa: 0,05 a 0,25 moles/litro), que favorece la
estabilidad de ambos complejos y disuelve a la mayor parte de las moléculas
que se encuentran presentes en el timo (incluso la RNP) pero no disuelve a
las dRNP. En el método elegido se utiliza una solución isotónica (ClNa 0,15
M = 0,9 %).
Los métodos de baja fuerza iónica son adecuados para el aislamiento de
las dRNP; sin embargo presentan una gran desventaja: favorecen la liberación
de las nucleasas; estas enzimas producen la degradación enzimática parcial de
los ácidos nucleicos y requieren, para su actividad la presencia de ciertos
cationes bivalentes (Mg++, Mn++. Fe++ y Co++). Para evitar este inconveniente,
la homogeneización se realiza en presencia de agentes quelantes como el
EDTA, o de ciertos aniones como el fluoruro o el citrato, que extraen del
medio los cationes bivalentes que son necesarios para la actividad de estas
enzimas. En el método que elegimos se utiliza el citrato para complejar los ca-
tiones bivalentes (citrato de sodio 0,015 M).
Si se quiere mantener la integridad de la molécula de ADN es necesario
verificar que las soluciones que se emplean en su aislamiento se encuentren a
pH 7. Los ácidos, a pH inferior a 2 producen la ruptura del enlace N-
glucosídico de las purinas dando origen a un sitio apurínico.
A pH alcalino se produce la desnaturalización del ADN o sea la ruptura
de los puentes hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas
228
polinucleotídicas. También se recomienda agregar algunas gotas de alcohol

octílico normal, porque evita la formación de espuma y produce hemólisis con
lo cual se facilita la eliminación de la hemoglobina del tejido.
Otro factor muy importante es la temperatura; a bajas temperaturas (0 a
5°C) se inhibe la ADNasa y otras enzimas que se producen en el metabolismo
de la glándula y que actúan sobre el ADN produciendo la degradación de su
molécula. Por ese motivo en esta primera etapa todos los pasos deben
realizarse en frío (0 a 5°C), aunque se trabaje en presencia de inhibidores.
Los dos tipos de nucleoproteínas (RNP y dRNP) que se encuentran
presentes en el homogenato, diferenciables por su distinta solubilidad, pueden
separarse por centrifugación en frío; se obtiene un precipitado formado por el
material insoluble en la solución salina (dRNP) y un sobrenadante que
contiene el material soluble en esa solución (RNP).
Métodología: Pesar 15 g de timo en una cápsula de Petri y cortar con un
cuchillo o navaja en láminas delgadas; colocar el tejido en un vaso de
licuadora y agregar 45 ml de citrato de sodio 0,015 M y 45 ml de cloruro de
sodio 0,15 M (SSC-1X). Mantener el pH de la suspensión en 7 mediante el
agregado de tampón TRIS-HCl 20 mM pH= 7. Homogeneizar hasta obtener
una suspensión de color rosado con resto de tejido de aspecto fibroso.
Centrifugar el homogenato durante 5 minutos a 5.000 r.p.m. a 5°C. Se obtiene
un precipitado adherente blanquecino (dRNP) y un sobrenadante de color
rosado (RNP). Desechar el sobrenadante y trabajar con el precipitado.
2. Disociación del complejo en sus dos componentes: DNA y proteínas.
La homogenización del tejido con solución SSC-1X y la centrifugación
posterior, realizadas en la primera etapa, han permitido aislar el DNA del timo
de ternera combinado con proteínas en forma de un complejo dRNP.
El propósito de esta segunda etapa es disociar el complejo aislado,
liberando el DNA (como desoxirribonucleato de sodio) de las proteínas que lo
229
acompañan. Esta disociación se consigue mediante el empleo de Lauril sulfato

de sodio o dodecil sulfato de sodio (SDS), reactivo que en presencia de
cloruro de sodio, disocia el complejo dRNP y precipita las proteínas liberadas
sin producir la despolimerización del nucleato.
Metodología: Colocar en un erlenmeyer de 200 ml el precipitado obtenido y
agregar 30,75 ml de citrato de sodio 0,015 M y dispersar con varilla de vidrio
a temperatura ambiente. Agregar 0,77 ml de solución de SDS al 5% en etanol
al 45%.Agregar los siguientes reactivos en el orden indicado mezclando
después de cada adición: 9,72 ml de SDS al 45% en etanol al 45%, 52,50 ml
de ClNa 2 M y 3,78 ml de citrato de sodio 0,015 M.
3. Eliminación de las proteínas.
Las proteínas que quedan en el sobrenadante luego del tratamiento con
SDS se eliminan con una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico, que las
desnaturaliza y coagula. La preparación cruda de ADN se agita vigorosamente
con cloroformo-alcohol isoamílico. La emulsión resultante se centrifuga en
frío para acelerar la separación de las fases. Se separan dos fases bien
definidas separadas por una interfase sólida; ellas son:
I-Fase Orgánica: (cloroformo - alcohol isoamílico) se separan en el fondo del
tubo y contiene los compuestos lipídicos.
II-Fase acuosa: en la parte superior del tubo y contiene la sal de sodio del
ADN y nucleoproteína.
III-Interfase sólida: es de color blanco y se interpone entre las dos anteriores;
está constituida por el gel que se forma entre el clorhidrato de proteína y la
mezcla de cloroformo - alcohol isoamílico.
Métodogía: En una ampolla de decantación colocar la suspensión obtenida y
agregar el mismo volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1, v/v),
agitar vigorosamente durante 30 segundos. Distribuir la emulsión resultante
en tubos de centrífuga y centrifugar en frío (5ºC) durante 10 minutos a 5000
230
r.p.m. Retirar los tubos suavemente de la centrífuga para mantener la

separación de las fases. Con una pipeta capilar retirar la capa acuosa superior
que contiene la sal de sodio del ADN tratando de no perturbar la fase proteica.
4. Precipitación del desoxirribonucleato de sodio.
El etanol al 95 % precipita al ADN bajo la forma de un material fibroso
que puede ovillarse alrededor de una varilla de vidrio. Esta propiedad permite
separar el ADN de otras macromoléculas que coagulan de una manera no
fibrosa, como por ejemplo el ARN y las proteínas.
Metodología: A la capa acuosa desproteinizada agregar dos volúmenes de
etanol al 95% (5°C). Verter lentamente sobre las paredes del recipiente
tratando de formar una capa alcohólica sobre la fase acuosa viscosa. Con una
varilla de vidrio gruesa agitar la solución de ADN con un movimiento de
rotación suave y continuo hasta que las dos fases se mezclen y todas las fibras
del material gelatinoso rico en ADN se hallan enroscado sobre la varilla
Presionar las fibras de ADN sobre las paredes del recipiente para eliminar el
exceso de solvente. Posteriormente colocar la varilla sobre un papel de filtro.
Lavar el precipitado introduciendo la varilla que contiene el ADN en un tubo
que contenga etanol al 95% y luego en otro que contenga éter etílico. . Todo
el procedimiento se efectúa a baja temperatura (5°C). Retirar el ADN de la
varilla y colocar en un vidrio de reloj. Dejar secar 10 minutos para eliminar
por completo el solvente.
5. Disolución e hidrólisis del desoxirribonucleato de sodio. La sal de sodio
del ADN es soluble en agua destilada y en soluciones de baja fuerza iónica.
Metodología: A una cantidad pequeña de precipitado agregar 10 ml de ácido
sulfúrico 10 % y calentar a ebullición durante 10 min (hidrólisis). Ensayar los
productos de hidrólisis: pentosas, fosfatos y bases utilizando la metodología
descripta previamente.
231
CROMATOGRAFÍA Y ELECTROFORESIS
Generalidades, clasificación de métodos cromatográficos, aplicaciones,

electroforesis
El término cromatografía, del griego khromatos (color) y graphos

(escrito), fue usado por primera vez en 1906 por el botánico ruso Miguel
Tswett para describir la separación de pigmentos vegetales. Tswett definió la
cromatografía como un método en el cual los componentes de una mezcla de
solutos (analítos) son separados en una columna adsorbente (fase estacionaria)
dentro de un sistema fluyente (fase móvil). La separación, basada en la
velocidad de desplazamiento diferencial de los solutos, se establece al ser
arrastrados los mismos por la fase móvil (liquida o gaseosa) a través de un
lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria (sólida o líquida).
La separación entre dos sustancias empieza cuando una es retenida más
fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más
rápidamente en la fase móvil. Las retenciones mencionadas pueden tener su
origen en fenómenos de adsorción, que es la retención de una especie
química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando
delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases, o bien de
absorción, que es la retención de una especie química por parte de una masa,
debido a la tendencia que ésta tiene a formar una mezcla con la primera
(absorción pura) o a reaccionar químicamente con la misma (absorción con
reacción química) considerando ambas como un fenómeno másico y no
superficial.
Las técnicas cromatográficas aprovechan alguna o algunas propiedades
físicas o físico-químicas de los analitos, como solubilidad, adsorción,
232
volatilidad, tamaño, carga, reactividad química o bioquímica, etc. La mezcla

de sustancias a separar se coloca en una situación experimental dinámica
donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de ellas pero por
duplicado tal como la solubilidad en dos líquidos diferentes, como ocurre en
cromatografía líquido-líquido. Por otro lado, se considera improbable que dos
especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o
físico-químicas frente a un sistema cromatográfico dado. Por tanto, en estas
diferencias, que pueden ser muy pequeñas, se basa la separación
cromatográfica. Así, las propiedades de los componentes de una mezcla
determinan su “movilidad” entre sí y con respecto a la fase móvil. Se eligen
las condiciones experimentales y las fases cromatográficas para que los
componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La base de la
separación cromatográfica será, por tanto, la diferencia en la velocidad de
migración de los mismos.
Clasificación de los métodos cromatográficos: Para clasificar globalmente a

los métodos cromatográficos es necesario tener en cuenta dos criterios:
• Tipo de fenómeno físico-químico que prevalezca o fundamento del
proceso cromatográfico, lo que conduce a los tipos de cromatografía.
• Forma de realizar el proceso cromatográfico, es decir, lo que constituye
las distintas técnicas cromatográficas
Tipos de cromatografía
- Fase estacionaria sólida:
Cromatografía de adsorción: El sólido adsorbe al componente que
inicialmente estaba en fase móvil, líquida o gaseosa (Fuerzas de Van der
Waals).
Cromatografía de intercambio iónico: el sólido es un intercambiador de
iones (fuerzas electrostáticas).
233
Cromatografía de exclusión (o de geles): el sólido es un gel formado por

polímeros no iónicos porosos que retienen a las moléculas de soluto según su
tamaño.
Cromatografía de afinidad: es un tipo especial de cromatografía de
adsorcion, utilizada especialmente en bioquímica, en la que un sólido tiene
enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo, un
indicador enzimático o un anticuerpo.
- Fase estacionaria líquida: en ese caso el líquido se encuentra soportado en

un sólido inerte, se trata de la Cromatografía de partición. El soluto se
reparte entre la fase móvil (líquido o gas) y la fase estacionaria.
Según la naturaleza de la fase móvil, la técnica cromatográfica

correspondiente recibe el nombre de dicha fase móvil:
- Fase móvil líquida o cromatografía liquida, cabe distinguir:
Cromatografía líquido-líquido (CLL), en la que ambas fases son líquidas y,
por tanto, se trata de una cromatografía de partición.
Cromatografía liquido-sólido (CLS), en la que la fase estacionaria es sólida
(adsorción, intercambio iónico, exclusión, afinidad).
- Fase móvil gaseosa o cromatografía de gases, puede ser:
Cromatografía gas-liquido (CGL), que es una cromatografía de partición.
Cromatografía gas-sólido (CGS), que es una cromatografía de adsorción.
Técnicas cromatográficas
Según la forma de llevar a cabo la separación cromatográfica, cabe
distinguir dos tipos de técnicas cromatográficas: en columna y plana.
Cromatografía en columna: se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se
coloca la fase estacionaria y a través de ella se hace pasar la fase móvil. El
234
flujo de la fase móvil (líquido o gas) a través de la fase estacionaria se

consigue por: presión, capilaridad, gravedad.
Cromatografía plana: en este caso la fase estacionaria está colocada en una

superficie plana. Se divide en dos tipos generales:
Cromatografía en papel: en la que el papel actúa como soporte de la fase
estacionaria (cromatografía de partición).
Cromatografía en capa fina: en la que un sólido actúa como fase estacionaria
(cromatografía de partición), que se extiende en una capa delgada sobre una
placa, generalmente de vidrio o aluminio.
Además, en estos casos el flujo de la fase móvil puede conseguirse de dos
formas:
Por capilaridad (cromatografía horizontal y ascendente).
Por capilaridad y gravedad (cromatografía descendente).
La cromatografía plana es considerada la más simple de todas las
técnicas cromatográficas. La diferencia principal con la cromatografía en
columna es de tipo técnico, es decir, difieren en la forma de soportar la fase
estacionaria. Sin embargo el fundamento de ambas técnicas es el mismo.
En la cromatografía plana, la muestra a separar se sitúa sobre el plano
que contiene la fase estacionaria (papel o placa fina) en forma de mancha, o a
235
veces de banda, a corta distancia de uno de los extremos de dicho plano. Una
vez seca la mancha o banda, el extremo del plano próximo a la misma se pone
en contacto con la fase móvil, manteniendo todo el sistema cromatográfico en
una cámara cerrada. La separación se produce por migración diferencial de los
componentes de la muestra en la dirección en que se mueve la fase móvil.
Generalmente, a diferencia de la cromatografía en columna, en cromatografía
plana las sustancias analizadas no abandonan el lecho cromatográfico, de
forma que el proceso se detiene cuando la fase móvil ha alcanzado una
determinada zona del plano.
En la cromatografía en papel, la celulosa actúa como soporte de la fase
estacionaria que suele ser agua. No obstante, también existen en el comercio
papeles impregnados (gel de sílice o alúmina, silicona, intercambiadores
iónicos, etc.) o tratadas químicamente (grupos intercambiadores incorporados
al esqueleto polimérico de la celulosa), que amplían la aplicabilidad de esta
técnica.
En cromatografía en capa fina, un sólido o soporte de la fase
estacionaria, se extiende en forma de capa sobre el plano de una superficie
rígida, normalmente una capa de vidrio o polietileno o una placa de aluminio,
de forma que la fase móvil fluye a través del mismo. Dependiendo de las
características del sólido utilizado, la cromatografía será de partición,
adsorción, intercambio iónico o exclusión.
Hasta hace relativamente poco tiempo, la cromatografía en capa fina
(CCF) o Thin Layer Cromatography (TLC) era considerada una técnica
cualitativa simple y rápida, para separar mezclas no demasiado complejas,
pero su aplicabilidad cuantitativa resultaba una pobre alternativa frente a otras
técnicas cromatográficas. Sin embargo, actualmente, debido a los cambios
introducidos en esta técnica (calidad de los soportes, equipos para aplicar
muestras y sistemas de detección), es considerada una técnica útil para separar
236
y determinar cualitativa y cuantitativamente mezclas complejas a nivel de

trazas. Estos cambios han llevado a modificar el nombre de la técnica,
denominándose Cromatografia en Capa Fina de Alta Resolución (CCFAR) o
High Performance Thin Layer Cromatography (HPTLC). Lo mismo ocurrió
cuando se mejoró la capacidad de resolución de la cromatografía líquida en
columna, pasando a denominarla Cromatografía Liquida de Alta Resolución
(CLAR) o High Performance Liquid Cromatography (HPLC).
Diferencias entre cromatografía plana y en columna

Aunque con algunas modificaciones, los principios teóricos de la
cromatografía en columna pueden ser aplicados, en general, a la
cromatografía plana. Las diferencias entre estas técnicas hay que buscarlas en
la distinta configuración de ambos sistemas cromatográficos ya que la
cromatografía plana se realiza en un sistema de lecho abierto, mientras que la
cromatografía en columna es un sistema de lecho cerrado. Sobre esta base
pueden indicarse las diferencias siguientes:
• En la cromatografía plana la separación se realiza por distancias mientras
que en columna se hace por tiempos o volúmenes de elución.
• En cromatografía plana la velocidad de la fase móvil sólo puede
controlarse indirectamente ya que está gobernada por fuerzas capilares que
237
son las que permiten el paso de dicha fase a través del lecho
cromatográfico. Por el contrario, en cromatografía en columna la velocidad
de la fase móvil puede controlarse regulando el gradiente de presión a
través de la columna (por ej. cromatografía de alta presión).
• En la cromatografía plana, el tiempo que dura la separación está
determinado por el tiempo necesario para que el frente del disolvente
llegue a una zona determinada del lecho cromatográfico y es independiente
del camino recorrido por los componentes de la muestra. En cromatografía
en columna, cada soluto debe atravesar completamente la longitud de la
columna, por lo que el tiempo que dura la separación está determinado por
el tiempo que tarda el componente más lento en llegar al detector.
• En la cromatografía en columna la separación de varias muestras se realiza
de forma secuencial, es decir, cada muestra debe “sembrarse”, fraccionarse
y detectarse individualmente, mientras que en cromatografía plana, la
separación de varias muestras se realiza de forma simultánea, siendo todas
ellas sometidas al mismo tiempo a igual proceso separativo, lo cual supone
un ahorro de tiempo.
• Otra diferencia se encuentra en la forma de llevar a cabo la detección.
Mientras que en cromatografía en columna este es un proceso dinámico,
pasando cada soluto eluído por el detector (por ejemplo UV-visibles;
índice de refracción), en cromatografía plana es un proceso estático ya que
se analizan o revelan todas las fracciones de distintas muestras a la vez.
Aplicaciones de la Cromatografía
La cromatografía es probablemente la más versátil de las técnicas de
separación, ya que es aplicable a cualquier mezcla soluble o volátil. Las
técnicas cromatográficas se pueden emplear para la separación, aislamiento,
purificación e identificación de diversos compuestos (orgánicos, inorgánicos o
238
biomoléculas) de diversos tamaños o pesos moleculares. De esta manera,

poseen múltiples aplicaciones en diversas áreas (médicas, biológicas,
bioquímicas, bromatológicas, toxicológicas, farmacéuticas, alimenticias,
químicas, industriales, agronómicas, etc.). Así por ejemplo, estas técnicas son
muy usadas en la purificación de proteínas (como enzimas, lectinas,
anticuerpos, etc.), como también en el estudio de azúcares y de otro tipo de
compuestos tales como los compuestos fenólicos, alcaloides, etc.
Técnicas cromatográficas en columna para la separación de proteínas

Cromatografía de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices (fase
estacionaria) que tienen una carga neta, positiva en el esquema. La carga de la
matriz de la columna así como la carga de las proteínas dependerá del pH del
solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). En
condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que
tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas
cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada
positivamente), siendo eluídas las restantes. Para elu ir las proteínas retenidas
se puede variar la carga iónica de la fase móvil o su pH de forma que se
alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz,
neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna.
239
Las partículas cargadas negativamente

se unen a la matriz sólida cargada
positivamente, y son retenidas.
Las partículas cargadas positivamente

son rechazadas por la matriz sólida
cargada positivamente y son eluidas.
La elución de las partículas cargadas

negativamente se consigue cambiando
el pH del solvente hasta igualar a su
punto isoeléctrico o hasta invertir su
carga neta
Cromatografía de filtración en gel

La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas
matrices (fase estacionaria) formadas por unas esferas porosas. El volumen de
los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. Cuando penetran en
el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los
poros de las esferas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio
entre las esferas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la
fase libre entre las esferas. La segunda proteína, por su tamaño, sólo puede
encontrarse entre las esferas. El flujo de solvente usado como fase móvil es
más elevado entre las esferas que en el interior de los poros de éstas, por lo
que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de
mayor peso molecular respecto a las de menor peso molecular. En esta
cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las
menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna
y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor
calidad. La filtración por gel se emplea para determinar el peso molecular de
proteínas desconocidas mediante el uso de patrones de peso molecular de
proteínas conocidas.
240
Las moléculas pequeñas penetran en

los pequeños conductos que
presentan las bolas de gel, donde la
velocidad de flujo de solvente es
menor.
Las moléculas grandes, incapaces de
penetrar en los pequeños conductos
de las bolas de gel se mueven entre
ellas, donde la velocidad de flujo de
solventes es superior. Como
consecuencia, las moléculas de
mayor peso molecular son eluidas
antes que las de menor peso
molecular
Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad

En la cromatografía de afinidad las esferas de gel que conforman el
lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando, una
molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la
mezcla a separar. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la
superficie de las esferas de gel la proteína afín, y deja pasar el resto. La
elución de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de
carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isoléctrico, variando
la fuerza iónica del solvente, etc.) con lo que se reduce la intensidad de la
interacción hasta anularla.
La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor
(proteína) unido a las esferas, que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla
compleja, o un antígeno (usado en una inmunización) que recubre las esferas
y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen
(anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso concreto de la
inmunoafinidad el ligando que recubre las esferas son anticuerpos que
241
retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopes que

reconocen.
En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel
recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las
proteínas a purificar. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a
la elución, primero de las proteínas no unidas ('run throught') y
posteriormente de las retenidas (eluido específico).
Las bolas de gel están recubiertas de un

ligando por el que tiene afinidad alguna
de las proteínas a aislar. Al pasar la
mezcla compleja a través de la columna
la proteína es retenida en la superficie
de la bola, eluyéndose de las demás.
Para eluir la proteína retenida por
afinidad se suele aumentar la fuerza
iónica de la solución de solvente o
incluir en éste el ligando soluble a alta
concentración de forma que compita
con el que está unido a las bolas de gel
por la unión a la proteína
Electroforesis
La electroforesis es una técnica para la separación de proteínas (y
también de aminoácidos, péptidos y ácidos nucleicos) que se basa en el
desplazamiento de las proteínas cargadas en un campo eléctrico. Si se coloca
a las proteínas en un campo eléctrico, el sentido en que se mueven las
moléculas depende del pH de la solución. Si el pH es igual al punto
isoeléctrico (pI) de una proteína, ésta no migra. A un pH por debajo de su pI,
predominan las cargas positivas y la proteína migra hacia el cátodo (polo
negativo). A un pH superior al pI, existe un predominio de cargas negativas y
la proteína migra hacia el ánodo (polo positivo). En general, se puede decir
que cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá
242
hacia uno u otro electrodo dependiendo de: su carga eléctrica, su tamaño, la

intensidad del campo eléctrico y la temperatura del medio.
Generalmente ésta técnica no se utiliza para purificar proteínas en
grandes cantidades porque existen métodos alternativos más sencillos y
porque a menudo afectan la estructura y por tanto la función de las proteínas.
Pero la electroforesis es muy útil como método analítico. Su ventaja es que las
proteínas pueden visualizarse además de separarse, lo que permite hacer una
estimación rápida del número de proteínas en una mezcla o del grado de
pureza de una preparación proteica determinada. La electroforesis también
permite la determinación de propiedades de una proteína tales como su pI, e
incluyendo marcadores de peso molecular durante la corrida electroforética,
permite determinar la masa de la proteína de interés.
Dirección
Muestra
de la
migración
a) Cuba de electroforesis para placas de geles de poliacrilamida (PAGE). El gel se

encuentra encerrado entre dos placas de vidrio (como un sandwich). La muestra se
siembra en la parte superior (cátodo o polo negativo) y las proteínas de la mezcla,
que se encuentran a un pH alcalino, migran hacia el ánodo (polo positivo).
b) Placa de PAGE corrida y revelada con un reactivo para proteínas. Las
proteínas de la mezcla original se separan en bandas de acuerdo a su carga/masa
(en condiciones nativas) o a su masa (condiciones desnaturalizantes).
243
Existen métodos electroforéticos rápidos y sensibles que involucran un

soporte sólido para la solución investigada. Entre los más empleados se puede
citar a los geles de poliacrilamida que consisten en geles porosos cuya
porosidad se puede regular en función de la concentración de la
poliacrilamida y donde las proteínas migran en función de su relación
carga/masa. Las electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) poseen
múltiples aplicaciones para el estudio de proteínas. Existen dos tipos
principales: en condiciones nativas y en condiciones desnaturalizantes. En
el primer caso, las proteínas se separan en función de su carga/masa. Las
condiciones desnaturalizantes implican la presencia de un detergente
aniónico, el SDS (dodecil sulfato sódico). El SDS, se une a todas las proteínas
en la misma proporción formando una especie de micela cargada
negativamente que enmascara la carga intrínseca de las proteínas, con lo que
éstas se separan solo en función de su masa e independientemente de su carga.
El único inconveniente de esta técnica es que el SDS al ser un detergente
desnaturaliza las proteínas y además separan en sus subunidades a las
proteínas multiméricas. Las electroforesis en SDS permite calcular el peso
molecular de las cadenas polipeptídicas y el número de subunidades que
posee la proteína.
Otro método electroforético frecuentemente usado para la separación y
caracterización de proteínas y otras moléculas es el que usa como soporte tiras
de acetato de celulosa, que presenta propiedades de adsorción mínimas, por lo
que los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas. Esta técnica
presenta algunas ventajas como su rapidez y la posibilidad de analizar
cantidades de muestra pequeñas; por otro lado, las tiras pueden disolverse y
por lo tanto es factible la cuantificación de las bandas separadas.
244
Experimentación
Cromatografía y electroforesis
Objetivos
• Separar mediante cromatografía en capa fina e identificar por métodos

químicos un alcaloide a partir de una especie vegetal
• Separar mediante técnicas cromatográficas pigmentos de una especie
vegetal
• Purificar proteínas mediante cromatografía de filtración por gel
• Separar e identificar proteínas de suero sanguíneo mediante técnicas
electroforéticas
A. Extracción, separación e identificación de un alcaloide a partir de

hojas de Nicotiana tabacum
-Extracción: Pesar 5 g de material vegetal seco (Nicotiana tabacum) y
triturado y agregar 50 ml de etanol. Filtrar por gasa doble. Rotular.
-Separación e identificación:La separación se efectuará mediante
cromatogrfía en capa fina (CCF) y la identificación por revelado químico.
Aplicar con micropipeta sobre la línea base en un cromatofolio de sílica
gel (Kieselgel G60 F254 0.2 mm, Merck, fase estacionaria), 10 µl del extracto
etanólico de N. tabacum y 10 µl de una solución de Nicotina como testigo,
dejar evaporar el disolvente. El desarrollo de la placa se lleva a cabo en un
recipiente de vidrio, por el método ascendente. Colocar en el interior del
recipiente metanol:amoníaco (99/1, v/v, fase móvil) hasta una altura de 0,5 a 1
cm y tapar, para conseguir que la atmósfera esté saturada de vapor del
disolvente. Luego de un período de tiempo apropiado, introducir la placa de
245
sílica gel. Dejar desarrollar la placa hasta que el disolvente alcance unos 5 cm
por encima del origen. Sacar la placa de la cuba, marcar el frente de
disolvente y dejar evaporar el mismo. Revelar con reactivo de Dragendorff’s
(solución acuosa de ácido tartárico, nitrato de bismuto y ioduro de potasio).
Determinar y comparar los valores de Rf para el alcaloide presente en el
extracto y el compuesto testigo.
B. Extracción, separación e identificación de pigmentos de frutos de

Capsicum annuum
-Preparación de la muestra: Secar los frutos de pimiento en atmósfera de
aire forzado hasta peso constante y triturar. Resuspender 100 mg del material
vegetal triturado en 5 ml de n-hexano
-Separación (cromatografía en columna) e identificación: En una columna
de vidrio (15 mm d.i x 25 cm largo) introducir una pequeña cantidad de
algodón compactado y presionar (para retener la fase estacionaria sin
dificultar el paso de la fase móvil).
246
Preparar una suspensión con 10 g de silicagel previamente activada por

calentamiento a 100°C y la cantidad de n-hexano necesaria para hacer una
papilla. Verter la suspensión en el interior de la columna y compactar el
adsorbente con suaves golpecitos a la vez que se abre la llave de la columna
para permitir la salida del solvente.
La superficie superior del adsorbente debe estar completamente
horizontal y el solvente debe quedar a la altura del nivel de la silica gel.
Sembrar con pipeta Pasteur la muestra preparada por las paredes de la
columna. Abrir la llave lentamente para que la siembra quede inmersa en la
silica gel. Cerrar la llave y añadir una pequeña cantidad de solvente para lavar
la pared interior de la columna. Abrir la llave para permitir la salida del
solvente, cuidando siempre que éste quede a nivel de la sílica gel.
247
Iniciar la elución agregando con pipeta Pasteur por las paredes de la

columna, 20 ml de n-hexano, luego 25 ml de una mezcla de n-hexano: acetato
de etilo al 30 %, continuar con una mezcla al 50%, 70% y finalmente 25 ml de
acetato de etilo (aumenta la polaridad de la mezcla de solventes). Recoger el
volumen inicial de solvente, que corresponde al volumen muerto de la
columna éste no contiene ningún producto y puede despreciarse. Luego
recoger fracciones de 3 ml utilizando un colector automático. Los
componentes de la mezcla eluyen en orden creciente de polaridad
Analizar las fracciones mediante CCF para observar los distintos
componentes del extracto de Capsicum annuum y seguir el curso de la
separación. Desarrollar las placas con n-hexano:acetato de etilo (2:1, v/v) y
revelar con luz UV a 254 nm o con solución alcohólica de ácido
fosfomolíbdico y posterior calentamiento a 110 °C. Las fracciones con igual
perfil cromatográfico se reunen en un mismo balón y se concentran en
evaporador rotatorio.
C. Separación de proteínas mediante cromatografía de filtración por gel

En una columna de vidrio (15 mm d.i x 25 cm largo) introducir una
pequeña cantidad de algodón compactado y presionar.
Con la columna cerrada añadir 5 ml de buffer fosfato de sodio 0,2 M
pH 7 (fase móvil), a continuación comenzar a añadir el gel (Sephadex G-150,
fase estacionaria) debidamente hidratado en el mismo tampón, lentamente y
evitando hacer burbujas de aire dentro de la columna. En este momento;
colocar un recipiente debajo de la columna para recoger el líquido que va a
fluir, abrir la columna para realizar el proceso de empaquetado. Hacer pasar
unos ml de buffer y dejar que la columna gotee hasta que se elimine todo el
tampón de la parte superior del gel.
248
Sembrar 0,1 ml de solución coloreada (Azul Dextrano) para determinar

el volumen de exclusión (Vo) de la columna. Abrir la llave dejando entrar la
muestra, eluir la columna con la fase móvil, al mismo tiempo se comienza a
recolectar fracciones del eluído (2 ml). Se procede así hasta que el volumen
del líquido que ha atravesado la columna sea el volumen total de la misma. En
ese momento se cierra la llave, terminando la recolección de las fracciones.
Vo se determina cualitativamente, corresponde al volumen de elución
del pico de Azul dextrano. A continuación sembrar la muestra. Dejar gotear
hasta que toda la muestra entre en el gel. Agregar a la columna solución
tampón y recoger fracciones de 2 ml utilizando un colector automático.
Analizar las fracciones determinando su absorbancia a 280 nm en
espectrofotómetro.
Cromatograma: graficar el perfil de elución de la proteína de la muestra
problema representando en el eje de abscisas el volumen eluído y en
ordenadas las lecturas de DO a 280 nm para cada fracción de la columna.
Determinar el volumen de elución (Ve) de la proteína de la muestra
problema, volumen de exclusión (V0) y volumen total (Vt).
El Vt de la columna se calcula usando la fórmula: π r 2 x h
Ve
Ve
Número de fracción
Respuesta del detector= Abs 280 nm
249
D. Electroforesis
Determinación de las proteínas del suero humano
-Preparación de la muestra: Por centrifugación de una muestra de sangre se
obtiene el suero humano.
-Separación e identificación: La separación se realizará mediante
electroforesis en membrana de acetato de celulosa.
Humedecer en tampón (Buffer Veronal sódico 0,04M pH=8,6)
membranas de acetato de celulosa gelatinizadas (CELLOGEL) durante 10
minutos. Eliminar el exceso de tampón poniendo las tiras entre dos hojas de
papel de filtro, con cuidado de que no lleguen a secarse por completo. Cargar
la cuba del aparato de electroforesis con tampón. Extender las tiras sobre el
puente de la cubeta de electroforesis de modo que la cara mate de la tira de
acetato de celulosa quede hacia arriba, teniendo cuidado que ambos extremos
queden sumergidos en la solución buffer. Sembrar con ayuda de un aplicador
de plástico, la muestra de suero en la tira a 2 cm del cátodo. Conectar el
aparato de electroforesis dejando pasar la corriente durante 60 minutos a un
voltaje fijo de 200 V.
Una vez finalizada la electroforesis, depositar las tiras en una cubeta
con solución colorante (0,5% , p/v negro amido en metanol 45% + ácido
acético 10%), de modo que queden cubiertas por el líquido, durante 10
minutos. Seguidamente lavar las tiras en solución de lavado (metanol 45% +
ácido acético 5%) hasta que se observen bien las bandas de proteína (azules)
sobre un fondo blanco.
Dibujar el patrón de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de
proteínas séricas, indicando la posición de ánodo y cátodo así como el punto
de aplicación de la muestra. Identificar las proteínas que corresponden a cada
banda y justificar el orden.
250
Bibliografia
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252

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Capítulo III

Consideraciones teóricas y prácticas

Los aminoácidos son compuestos nitrogenados que tienen un papel

Funciones de las proteínas

1. Niveles de organización en las proteínas

Estructura Estructura Estructura Estructura

Residuos de α hélice Cadena polipeptídica Subunidades ensambladas

2. Propiedades de las proteínas

3. Aislamiento, purificación y caracterización de proteínas

3.1. Métodos de ruptura celular y extracción de proteínas

descongelarse, las células se destruyen osmóticamente debido a la presencia

3.4 Cuantificación de proteínas

Proteínas (mg/ml) = 1.55 A280 – 0.76 A260

Método de Bradford - Fijación no Covalente de Colorante

2ª) También en medio básico, el cobre actúa como catalizador de la

Reacción entre la proteína y los reactivos de Cu2+ y de Folin

A. Extracción de proteínas solubles de hojas de tártago (Ricinus

B. Técnica de concentración de extracto de proteínas solubles

volumen del extracto que se va a concentrar y calcular la cantidad de sal

Advertencia: el 2-mercaptoetanol es un producto combustible y

C. Propiedad amortiguadora de las proteínas: titulación con ácido.

centrifuga 5 min a 2000 rpm. Se descarta el precipitado. El sobrenadante

D. Solubilidad de la caseína a diferentes pH

E. Precipitación y desnaturalización de proteínas.

F. Determinación cuantitativa de proteínas.

El método como en todo método cuantitativo colorimétrico requiere de

Técnica: Rotular 8 tubos y agregar la solución estándar o las muestras y

Las reacciones químicas de los sistemas biológicos raramente ocurren

Están sujetas a una gran variedad de controles celulares, genéticos y

Nomenclatura y clasificación de las enzimas

Consiste en poner de manifiesto la presencia de la enzima en estudio,

Otra unidad empleada para expresar la actividad de una enzima,

Curva de progreso de la reacción

–■– Valores medidos -- Velocidad inicial (v0)

Para que los valores determinados reflejen la cantidad de enzima

En la práctica se debe determinar el rango de tiempo en el que la

Figura 1 se observa una respuesta lineal hasta los 50 minutos de incubación;

Factores que afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas

Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción.

Considerando la recíproca de la ecuación de Michaelis Menten obtenemos la

Análisis cuantitativo de la actividad enzimática

Las invertasas atacan al disacárido desde el residuo de fructosa y

A. Determinación de azúcares reductores por el Método de Somogyi-

Solución A: CuSO4.5 H2O al 10 %.

Procedimiento: cargar tubos con cantidades crecientes de la solución de

Curva estándar de azúcares reductores (Somogyi-Nelson)

B. Determinación del efecto del tiempo de incubación sobre la

Tubo Buff. 0,2 Sac. 0,3 M H2O d. Enzima Tiempo

1- Cargar los tubos de acuerdo al esquema, iniciar la reacción

C. Determinación del efecto de la concentración de sustrato sobre

Tubo Sac Sac Sac Sac Sac Buff. H 2O Enzima

0 ------- ------- ------- ------- ------- 0,2 ml 0,1 ml 0,2 ml

5 mM 0,1 ml ------- ------- ------- ------- 0,2 ml ------- 0,2 ml

C. 5 0,1 ml ------- ------- ------- ------- 0,2 ml 0,2 ml -------

1- Cargar los tubos de acuerdo al esquema, iniciar la reacción

2- En cada tubo determinar los azúcares reductores que se

D. Determinación del efecto del pH sobre la actividad enzimática

Tubo Buff. Buff. Buff. Buff. Buff. Sac. H 2O Ez.

1- Cargar los tubos de acuerdo al esquema, iniciar la reacción

5- Transformar los micromoles de azúcares reductores en

La hidrólisis enzimática completa de un ácido nucleico da lugar a una

• Una Base nitrogenada heterocíclica, que puede ser de dos tipos:

Timina se encuentra sólo en la molécula de ADN; Uracilo sólo se