TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN,

FRACCIONAMIENTO Y ANÁLISIS DE
PROTEÍNAS
COMPORTAMIENTO DE LAS
PROEÍNAS EN DISOLUCIÓN
COMPORTAMIENTO DE LAS
PROTEINAS EN DISOLUCIÓN
EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA
Y DEL pH SOBRE LA SOLUBILIDAD DE
LAS PROTEÍNAS
 EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA SOBRE LA SOLUBILIDD DE PROTEÍNAS

SALTING-IN, SOLUBILIZACIÓN POR SALADO SALTING-OUT, PRECIPITACIÓN POR SLADO

EL SALTING-IN , SOLUBILIZACIÓN POR SALADO SE EXPLICA POR EL EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA
SOBRE EL RADIO DE Debay-Hückel

RADIO DEBAY-HÜCKEL : ESFERA DE INFLUENCIA O RADIO DE ACCIÓN DE UN DETERMINADO IÓN

R = 1/b2 ; b 2= I 4πe2/εKT: I= ½ Σ ci zi 2 ; I = fuerza iónica : R= K/I2

ASÍ a > I, < RADIO Debay-Hückel, menor probabilidad de interaccionar entre contra-iones,
mayor solubilidad y menor probabilidad de precipitación.
A < I, > RADIO de fuerza iónica, mayor probabilidad de interacción entre contra -iones ,
mayor probabilidad de formar complejos y precipitar. Menor solubilidad.

EL SALTING-OUT, PRECIPITACIÓN POR SALADO, SE DEBE A LA PÉRDIDA DEL

COMPORTAMIENTO IDEAL DE LAS DISOLUCIONES Y A LA COMPETENCIA DE LOS
IONES POR EL AGUA PARA SOLVATARSE
UTILIZACIÓN DEL SALTING-OUT
EN PROCESOS DE PURIFICACIÓN
COMPORTAMIENTO ÁCIDO-BASE
DE LAS PROTEÍNAS
APLICACIONES PARA SU
FRACCIONAMIENTO Y PURIFICACIÓN
 EVOLUCIÓN DE LA CARGA NETA D EUNA PROTEÍNA EN FUNCIÓN DEL pH

δ+

PI
CARGA NETA
pH

δ-

DEPENDIENDO DEL pI LAS PROTEINAS SON ÁCIDAS O BÁSICAS

EFECTO DEL pH
PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE
PROTEINAS
METODOS DE SEPARACIÓN
METODOS DE ANÁLISIS
MÉTODOS BASADOS EN LA
DIFERENCIA DE LA CARGA O
POLARIDAD
Cromatografía
Electroforesis
isoelectroenfoque
INTERCAMBIO IONICO

NaCl
ELECTROFORESIS
 METODOS BASADOS EN LA
DIFERENCIA DE PESO MOLECULAR
DIALISIS
CENTRIFUGACIÓN
FILTRACIÓN MOLECULAR
 SDS-PAGE

ELECTROFORESIS EN GELES DE
POLIACRILAMIDA EN PRESENCIA DE SDS
Y EN CONDICIONES
DESNATURALIZANTAS
 SDS-PAGE
La electroforesis en presencia de SDS
(dodecil sulfato sódico) analiza la migración
de las cadenas polipeptídicas tras un
tratamiento químico (SDS y β-
mercaptoetanol) y térmico, proceso que
desnaturaliza las proteínas.
El SDS es un detergente que además
de desnaturalizar la proteína le añade carga.
Al unirse en proporción al tamaño de la
proteína la relación carga/masa es constante
para todas.
El β-mercaptoetanol rompe los puentes
disulfuro, separando las posibles uniones
intra- o intercatenarias.
 -
- -

- -

- -
SDS
-
-
-

El SDS proporciona carga a la proteína de forma que la relación Q/m= CTE

Reducción de puentes disulfuro por β-mercaptoetanol
A

βme
s s

B
s s βme
+

C
βme
s
s

D
βme
 Geles
Los geles van a proporcionar una fase en la
que se van a separar macro-moléculas.
Los geles se pueden obtener por
polimerización (acrilamida/bis-
acrilamida)o por solidificación de una
disolución (agarosa). Controlando la
concentración de polímero (acrilamida/bis-
acrilamida) o de soluto (agarosa)que
genera el gel, se puede obtener un
entramado más o menos tupido que
ofrecerá mayor o menor resistencia a la
movilidad de las macromoléculas a
Polimerización de geles de acrilamida-bisacrilamida.
SEPARACIÓN DE PROTEINAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA
A

βme
s s

B
s s βme
+

C
βme
s
s

D
βme
A B C D M
DIALISIS
CENTRIFUGACIÓN
Ultracentrifugación Zonal: Las muestras sobre gradiente de densidad (la densidad
máxima del gradiente debe ser inferior a la de la partícula menos densa que se quiere
separar)
Ultracentrifugación isopícnica o equilibrio de gradiente:
Las partículas a separar se mezclan uniformemente con una disolución que contiene un
soluto muy denso y muy difusible (ej CsCl). En el equilibrio las partículas se detienen en
la zona donde la densidad del gradiente creado por el soluto es la de la partícula.
FILTRACIÓN MOLECULR
 METODOS BASADOS EN
INTERACCIONES ESPECÍFICAS
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD.
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
ELECTROFORESIS EN CONDICIONES
NO DESNATURALIZANTES
DEDUCCIÓN DEL Nº DE CADENAS
Determinación del nº de cadenas

Ruptura y bloqueo de puentes

disulfuro
Reducción de puentes disulfuro por β-mercaptoetanol
Reducción de puentes disulfuro por ácido perfórmico
Bloqueo de los grupos sulfhidrilos
 OTROS METODOS
• ISOELECTROENFOQUE
• HPLC
• ELECTROFORESIS EN DOBLE DIMENSIÓN
 ISOELECTROENFOQUE
Separación de proteínas por
electroforesis en un gradiente de pH
en condiciones nativas.
Las proteínas sometidas a un campo
eléctrico migran en el gradiente de
pH hasta que llegan al pH de su
punto isoeléctrico. En ese punto su
carga neta es cero y no se mueven.
De hecho se concentran en esa zona.
ISOELECTROENFOQUE; Primero se genera un gradiente de pH realizando primero una
electroforesis de una mezcla de polianfolitos (moléculas con cagas y que generan distintos
valores de pH). Seguidamente se colocan las proteínas en el Gel y se vuelve a conectar
el campo eléctrico. Las proteínas migrarán hacia un polo o hacia otro dependiendo de la
carga que tengan (lo que depende de la zona del gel donde estén y de su naturaleza). A
medida que la proteína se mueve por el gradiente de pH, va cambiando su carga. Cuando
Su carga neta es cero deja de moverse. De esta forma las proteínas se separan según su
pI, concentrándose en bandas. Esta técnica permite separar proteínas con valores de pI
muy próximos (0.01).
Equipo para realizar isoelectrenfoque
 Electroforesis en doble
dimensión
Combinación de electroisoenfoque y
SDS PAGE
 Purificación de proteínas
Para llegar a purificar una proteína (a
homogeneidad) se suele requerir la
combinación de varias técnicas de
separación de proteínas.
El proceso de purificación se puede
seguir, cuantificar y visualizar por SDS
PAGE
PROCESO D EPURIFICACIÓN
DE UNA PROTEÍNA.
 TÉCNICAS DE DETECCIÓN Y
CUANTIFIACACIÓN DE PROTEÍNAS
DETERMINACIÓN TOTAL DE
PROTEÍNAS (LOWRY, BIURET,
BRADFORD).
DETERMINACIÓN DE PROTEINAS DE
FORMA ESPECÍFICA
ELISA
Western Blot.
 Determinación de la
concentración total proteínas
Métodos Colorimétricos
Lowry
Biuret
Bradford
 Bradford

Lowry y Biuret: (λ = 540nm)

Ley de Lambert -Beer
WESTERN BLOT (INMUNOBLOT)

TÉCNICA PARA DETECCIÓN DE

PROTEÍNAS QUE COMBINA
ELECTROFORESIS E
INMUNODETECCIÓN
WESTERN BLOT

TRANSFERENCIA
LA TÉCNICA PUEDE SER CUANTITATIVA
EN TÉRMINOS ABSOLUTOS Y RELATIVOS
 ELISA (ENZYME-LINKED
IMMUNO-SORBENT ASSAY)
ELISA DIRECTO (DETECCIÓN DE ANTÍGENO)
ELISA INDIRECTO (DETECCIÓN DE ANTICUERPO)
LA TÉCNICA PUEDE SER CUANTITATIVA
 METODOLOGÍAS UTILIZADAS PARA EL ESTUDIO DE
PROTEINAS

• ESPECTROSCOPIA
• FLUORESCENCIA
• DICROISMO CIRCULAR
• RMN
• R-X
• ESPECTOMETRIA DE MASAS

(CAPITULOS 5 Y 6 DEL MATHEWS VAN HOLDE)

CRISTALES DE MIOGLOBINA