PROFESOR PATROCINANTE:

Dr. Enrique Dupré

Departamento de Biología Marina
Universidad Católica del Norte

PROFESOR CO-PATROCINANTE:
Dr. Orlando Garrido
Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas
Facultad de Ciencias
Universidad Austral de Chile

ENCAPSULACIÓN DE BLÁSTULAS DE Tetrapygus niger

(MOLINA 1782) (EQUINODERMATA: ECHINOIDEA) EN GEL
DE ALGINATO DE SODIO.

Tesis de Grado presentada como parte

de los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Biología Marina y
Título Profesional de Biólogo Marino.

NATANIELA NICOLINA PRAT TASSO

VALDIVIA – CHILE
2013
 ii

COMISIÓN DE TESIS

PROFESOR PATROCINANTE

Dr. Enrique Dupré Moragas

Departamento de Biología Marina

FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR. UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL NORTE

PROFESOR CO-PATROCINANTE:

Dr. Orlando Garrido

Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas

FACULTAD DE CIENCIAS. UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

PROFESOR INFORMANTE:

Dr. Jorge Toro Yagui

Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas

FACULTAD DE CIENCIAS. UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

 iii

ÍNDICE

Pág.

ÍNDICE GENERAL iii

Índice de Tablas v

Índice de Figuras vi

RESUMEN vii

Abstract ix

1.-INTRODUCCIÓN 1

1.1 Criopreservación 2

1.2 Alginato 4

1.3 Antecedentes de la técnica de encapsulación 6

Hipótesis 8

1.4 Objetivos Generales 8

1.5 Objetivos específicos 8

2.- MATERIAL Y MÉTODOS 9

2.1 Obtención de ejemplares 9

2.1.1 Obtención de larvas 9

2.2 Encapsulación 9

2.2.1 Extracción de Alginato 9

2.2.2 Preparación Agua de Mar Artificial 10

 iv

2.2.3 Método de extrusión: preparación de cápsulas 10

2.2.4 Desencapsulación 11

2.3 Tratamientos 11

2.3.1 Tratamiento A: Alginato 11

2.3.2 Tratamiento D: Determinación de toxicidad del DMSO 11

2.3.3 Tratamiento AD: Criopreservación y encapsulación 12

2.4 Análisis de sobrevivencia y crecimiento 13

2.5 Análisis estadístico 13

3.-RESULTADOS 14

3.1 Controles 14

3.2 Tratamiento A 14

3.3 Tratamiento D 15

3.4 Tratamiento AD 15

3.5 Análisis estadístico 17

4.- DISCUSION 19

5.- REFERENCIAS 22
 v

Índice de Tablas

Tabla Descripción Pág.

I Tabla I: Efecto de la exposición a la solución crioprotectante sobre

movilidad de las larvas del erizo de mar. 16

II Test de Scheffé (p˂0.05), comparaciones de varianza de medias entre los

tratamientos. 17
 vi

Índice de Figuras

Figura Descripción Pág.

1 Método de extrusión básico y manual de cápsulas de alginato. 10

2 Esquema de los distintos tratamientos sometidos a larvas del erizo de mar negro,

Tetrapygus niger: (a) Tratamiento A, encapsulación en base de alginato de sodio;(b)

Tratamiento D, exposición a agente crioprotector DMSO y (c) Tratamiento AD, encapsulación

en base alginato de sodio con exposición a DMSO. 12

3 Cápsulas de alginato que contienen blástulas de erizo de mar : (a) Alginato 1%

p/v, (b) Alginato 1,5% p/v en blástulas de erizo de mar.

14

4 Promedio de tamaños obtenidos en larvas en estado de prisma 24 horas post

exposición a los distintos tratamientos: (A) alginato 1% , (A2) alginato 1.5%, (D) DMSO 1M,

(D2) DMSO 2M, (AD) alginato 1% y DMSO 1M, (AD2) alginato 1,5% DMSO 2M y finalmente

el control , cuyas larvas crecieron en condiciones normales de laboratorio.

18
 vii

RESUMEN

El Erizo negro, Tetrapygus niger (Molina, 1782), es uno de los erizos marinos más

abundantes en la costa central de chile. Los estados larvales tempranos han sido utilizados en

bioensayos por ser un método rápido, sensible y simple. La limitación de la estacionalidad

reproductiva de estas especies, refleja la búsqueda de técnicas para preservar individuos durante

todo el año. Una de estas técnicas es la criopreservación que es un proceso de congelación que

requiere estabilizar el agua intracelular para prevenir el daño permanente generado por la

formación de hielo intracelular, mediante soluciones químicas o crioprotectores que penetran en

la célula y la reemplazan. Sin embargo, la concentración de éstos pueden dañar permanentemente

las células por su toxicidad química. Por ello, se utiliza un agente no penetrante que brinda una

protección externa al criodaño, aumentando la viabilidad celular.

Uno de estos agentes no penetrantes que protege a las células durante la congelación es el

alginato. Este compuesto proveniente de las algas marinas es un polisacárido de estructura tal

que le permite interactuar con el catión Ca++, para formar agregados estructurales del tipo

“caja de huevo”, y cuyas propiedades más importante son la permeabilidad, estabilidad y

resistencia. Es uno de los geles más utilizados en la encapsulación celular.

El presente trabajo busca demostrar que el encapsulamiento de estadíos larvales de

invertebrados marinos mediante el uso de alginato de sodio no afecta la viabilidad y crecimiento

de éstos post-desencapsulamiento.

Se realizaron tres tratamientos con larvas en estado blástula: (A) encapsulación con

alginato de sodio al 1% y al 1,5%, (D) Determinación de toxicidad utilizando Dimetilsulfóxido

al 1M y 2M, y (AD) combinación de ambos tratamientos. La sobrevivencia a los tratamientos fue

 viii

medida por el porcentaje de larvas prisma y el de tamaño promedio obtenidas 24 horas después

de cada tratamiento.

En el tratamiento A al 1% se observó un alto porcentaje 93,5% de larvas prisma y en los

tratamientos D y AD se obtuvo una diferencia significativa en los tamaños de larvas observadas.

Estos resultados demuestran que el alginato permite aumentar la viabilidad de las larvas a la

exposición de un agente crioprotector.

 ix

ABSTRACT

The black sea urchin, Tetrapygus niger (Molina, 1782) is the most abundant species of

sea urchin on the central Chilean coast. The developmental stages of sea urchins bioassay has

been used as a rapid, sensitive and simple method. The limitation of reproductive seasonality by

this species reflects the search of techniques to preserve individuals throughout the year. One of

these techniques is the cryopreservation, a cooling process which stabilizes intracellular water to

prevent permanent damage generated by the formation of intracellular ice, through chemical

solutions or cryoprotectant that penetrate into the cell and replace it. However, the concentration

of these can permanently damage the cells by its chemical toxicity. Therefore, it is used a non-

penetrating agent that provides a protection to external cryodamage, increasing the cell viability.

One of these agents not penetrating that protecs the cells during freezing is the alginate.

This compound from seaweed is a polysaccharide structure such that interacting with the cation

Ca++ allows structural aggregates to form of egg-box types, and whose properties more

important are the permeability, stability and resistance. Being one of the gels more used in the

cell encapsulation.

This paper seeks to demonstrate that the encapsulation of larval marine invertebrates

through the use of sodium alginate does not affect the viability and growth of these post-

decapsulation.

Three treatments were done with larvae in blastula stage: (A) Encapsulation of sodium

alginate at 1% and 1.5 %, (D) Determination of toxicity using Dimethylsulfoxide to 1M and 2M,

and (AD) the combination of both treatments. The survival of the treatments was measured by

the percentage of larvae prism and average size obtained 24 hours after each treatment.
 x

In the treatment A of 1% is observed a high percentage 93,5% of larvae prism and in the

treatments D and AD are obtained a significant difference in the sizes of larvae. These results

demonstrate that the alginate allows increasing the viability of larvae to the exposure of a

cryoprotectant.
 1

1.- INTRODUCCIÓN

El erizo negro, Tetrapygus niger (Molina, 1782), es el más abundante de las especies de

erizos de mar encontradas en la costa chilena central (Rodríguez y Ojeda, 1993). Aunque un

número de estudios recientes se ha centrado en el rol ecológico que esta especie juega en las

comunidades marinas chilenas, muchas características biológicas claves de esos erizos de mar

permanecen desconocidas (Fuentes y Barros, 2000).

Los individuos de esta especie son dioicos sin dimorfismo sexual, liberan sus gametos al

mar por lo que la fertilización ocurre en la columna de agua, dando a lugar una blástula que es

ciliada y de nado libre. La gastrulación comienza con la formación del blastoporo, en donde las

células se reordenan exteriormente para luego migrar hacia el interior de la blástula en un

proceso denominado invaginación. Luego de este proceso, la larva se vuelve cónica, y uno de los

lados se aplana dando lugar la superficie oral, esta larva ciliada se denomina Prisma.

Posteriormente, la larva comienza a formar proyecciones las cuales darán lugar a los brazos que

ayudarán a llevar el alimento a la boca, esta larva es denominada Pluteus. Finalmente luego de

percibir señales químicas y llegando a su fin embrionario, esta larva está preparada para asentarse

y metamorfosear (Gilbert, 2010).

Los estados larvales tempranos de los erizos de mar han sido utilizados por décadas en

bioensayos de análisis de agua, por ser un método de estudio rápido, sensible y simple para el

asesoramiento y monitoreo de contaminación marina (Bellas y Paredes, 2011; Saco-Álvarez et

al., 2010).Sin embargo la única limitación es la estacionalidad reproductiva de estas especies

(Suquet et al., 2000; Smith et al., 2001; Bellas y Paredes, 2011).

 2

Los avances metodológicos en los procedimientos de criopreservación pueden ser una

solución para la mantención de una línea genética deseable en un centro de cultivo. Los

principales beneficios de la criopreservación de espermatozoides son: la disponibilidad de

gametos durante todo el año, la posibilidad de realizar fecundaciones en especies cuya sincronía

en la evacuación de gametos se pierde, el uso de la totalidad de espermatozoides obtenidos de las

espermiaciones inducidas o naturales, y reducción de los costos relativos a la mantención de

reproductores. Bajo estas consideraciones, la esperma de más de 200 especies de peces ha sido

criopreservada (Suquet et al., 2000).

1.1 Criopreservación

El proceso de criopreservación requiere estabilizar el agua intracelular para prevenir el

daño celular permanente generado por la formación de hielo intracelular. Para evitar esta

formación de hielo, es necesario añadir soluciones químicas o crioprotectores (CP) que penetren

a la célula y remplacen el agua. Por otra parte, una alta concentración de Cps puede dañar

permanentemente las células por su toxicidad química. Para solucionar estos problemas es

necesario determinar cuál es el crioprotector que genera menor daño a la célula, la concentración

en que se debe utilizar y el tiempo que puede permanecer en contacto con la célula. Si se utiliza

una concentración baja, la célula podría experimentar un aumento de volumen por entrada de

agua que finalmente genera un daño permanente a la membrana plasmática. Por el contrario si la

concentración es alta, la célula se deshidrata excesivamente, su membrana se dobla y finalmente

se rompe. Una manera de evitar este quiebre de la membrana por contracción es proteger la

membrana con una solución que proteja externamente a la célula evitando el arrugamiento

excesivo de ella (Heng et al., 2004).

 3

En estudios de erizos se ha establecido que estados embrionarios tardíos son menos

susceptibles a estrés térmico, y toleran bajas temperaturas de congelamiento, mucho más que

estados de desarrollo tempranos, se obtienen mayores porcentajes de sobrevivencia y

crecimiento post-deshielo en estadios de blástula que en aquellos en estado mórula o en huevos

fecundados (Bellas y Paredes, 2011).

En la actualidad existen escasos estudios respecto a la criopreservación de los estadios

tempranos de desarrollo de especies de invertebrados marinos de importancia comercial. Smith

et al. (2001), señalan que estudios existentes de criopreservación de gametos en especies de

moluscos, los métodos de manejo de semen, tipos de crioprotectores y procedimientos de

congelamiento son muy similar a aquellos usados para animales domésticos. Sin embargo, los

requerimientos de fecundación tienden a ser distintos. En animales domésticos se requiere sólo

un espermatozoide para fecundar un huevo de la hembra, en cambio, en moluscos se requiere de

un gran número espermático (gran cantidad y gran concentración) para realizar una fecundación

de millones de huevos.

Heng et al., (2004) menciona que encapsular las células previo al congelamiento brinda

una protección externa al criodaño, aumentando la viabilidad celular. La utilización del alginato

de sodio como un agente crioprotectante no penetrante puede jugar un rol importante en la

criopreservación, así como se han utilizado otros polisacáridos como protectores del criodaño

causado en el congelamiento celular: tales como la albúmina, trehalosa o sucrosa y otros geles

(Murua et al.2008: Agudelo e Iwata, 2008).

Zhang et al. (2010), utilizó la encapsulación en base de alginato para analizar y comparar

la viabilidad post-vitrificación de células estromales mesenquimáticas derivadas de embriones de

 4

ratón, utilizando un kit estándar de fluorescencia para cuantificar vivos/muertos. Utilizando 10%

dimetilsulfóxido (DMSO) por 15 minutos como solución vitrificante, y una solución al 2% (p/v)

de alginato de sodio con 5mM de KCl, 20 mM NaCl y 20 mM de glucosa, obtuvo una alta

sobrevivencia de células encapsuladas vitrificadas, en comparación con aquellas no encapsuladas.

Por lo que propuso utilizar ambas técnicas combinadas para la criopreservación de células

sensibles a los tratamientos de congelamiento y uso de agentes crioprotectantes.

1.2 Alginato

El alginato es un polisacárido que es extraído de las algas pardas, también es un

exopolisacárido producido por bacterias como Pseudomonas aeruginosa. Es un copolímero linear

compuesto por ácido β-D-manurónico (M) y ácido α-L-gulurónico (G), conformando regiones de

bloques M, bloques G, y estructuras alternantes (bloques MG). La composición química y la

secuencia puede variar entre especies de algas e incluso, entre diferentes partes del alga y la

época del año cuando es cosechada (Draget y Taylor, 2011). La combinación de técnicas

químicas y bioquímicas permite un control sobre la secuencia de monosacáridos y por lo tanto, su

locación y cantidad de sustituyentes. Este control molecular provee un potencial considerable

para crear numerosos derivados de ácidos algínicos modificados.

Una característica importante de los alginatos es la afinidad o capacidad de unirse a cationes

multivalentes, que le permite la formación del gel, y que la transición de sol a gel no dependa

de la temperatura. Su afinidad a estos iones se muestra en descenso en el siguiente orden: Pb >Cu

> Cd > Ba > Sr > Ca > Co, Ni, Zn > Mn. El agente quelante de mayor uso en los estudios con

alginato es Ca++, son escasos los estudios en los que integran una variación o comparación con

Sr++ o Ba ++.
 5

Los bloques G son los únicos responsables de las interacciones iónicas. En presencia de

cationes multivalentes ellos permiten la formación de agregados del tipo “caja de huevo”,

denominado así por la similitud con esta estructura. En este modelo el catión se ubica en las

cavidades electronegativas formadas por las moléculas del ácido algínico, en forma similar a un

huevo en una caja de huevo. De ahí, un alginato con un alto nivel de secuencias G presenta

mayor afinidad para ligarse que aquellos alginatos con bajo contenido de G. Las uniones

selectivas de iones metales divalentes y la correspondiente fuerza del gel fue encontrado en

ascenso en el orden bloque MM< Bloque MG < Bloque GG (Gómez et al., 2008). Determinando

y estandarizando las diferencias en las secuencias de G y M, es de suma importancia desde que

tienen un impacto significativo en las propiedades del gel de alginato incluyendo

biocompatibilidad, estabilidad, resistencia mecánica, permeabilidad, biodegradabilidad y

comportamiento de expansión (Orive et al., 2006). La estructura resultante es una estructura

permeable que permite la difusión de pequeñas moléculas como glucosa, agua y oxígeno, pero

impermeable a grandes moléculas. Esta característica hace que el alginato sea un biomaterial de

gran utilidad en la encapsulación celular (Draget y Taylor, 2011; Zhang et al., 2010; Murua et al.,

2009; Orive et al., 2006; Heng et al., 2004).

La encapsulación en base de alginato ha sido utilizada en especies ganaderas con el objeto de

preservar espermatozoides con material genético seleccionado para una posterior reproducción de

animales. Esta metodología fue aplicada primero por Nebel et al. (1993), a los espermatozoides

de bovinos para realizar inseminaciones artificiales (IA). El concepto de Nebel de

microencapsulación de esperma para IA fue mantener microcápsulas en el útero de las hembras

durante el estro hasta que se produjera la ovulación, permitiendo mantener la viabilidad de una

alta concentración de espermatozoides, además de permitir la liberación de éstos durante todo el

 6

intervalo de fertilidad, garantizando así un incremento en la fecundación. Otros estudios en

encapsulación se han realizado en semen de bovinos, ovejas, cerdos, y perros (Huang et al., 2005;

Maxwell et al., 1996; Shah et al., 2010; Weber et al. 2006) con el objeto de mejorar la

criopreservación de semen para un posterior uso en inseminación artificial.

1.3 Antecedentes de la técnica de encapsulación

En medicina la encapsulación celular es principalmente la inmovilización de células mediante

una cubierta externa permeable que permite protegerlas. En mamíferos permite la protección del

ataque inmunológico del hospedador, mientras mantiene una difusión bidireccional de nutrientes,

oxígeno y desperdicios (Murua et al., 2008). En la industria alimenticia, la encapsulación se

refiere a una tecnología en la cual el componente bioactivo tal como los probióticos son

completamente envueltos y cubiertos por una matriz sin difusión del componente bioactivo (Voo

et al., 2011). Algunos de los principales beneficios en este ámbito es la protección del agente

bioactivo contra la evaporación, reacciones químicas o difusión de alimento, entrega controlada

y la preservación de estabilidad de los componentes bioactivos durante el procesamiento y

almacenamiento, prevención de interacciones indeseables con otros componentes de productos

alimenticios y mejorar el desagradable sabor durante la alimentación (Nedovic et al., 2011).

En las últimas décadas el interés en el campo de la microencapsulación ha aumentado, en

parte por el avance y la optimización de biomateriales utilizados para elaborar las cápsulas

(Murua et al., 2009). Existe un bajo número de polisacáridos que han sido estudiados para su uso

en la industria de encapsulación alimenticia, basados en el sistema de entrega específica que

protege los componentes bioactivos alimenticios de las condiciones deletéreas del estómago y la
 7

parte superior del intestino delgado (Voo et al., 2011). Uno de estos compuestos utilizados para

la encapsulación es el alginato de sodio que ya ha sido utilizado en ganadería para preservar

material genético (Nebel et al., 1993), así como en el área farmacéutica su uso para extender el

tiempo de residencia en el medio gástrico y controlar la liberación de la droga (Angadi et al.,

2012).

Todos los antecedentes señalados han conducido a utilizar estados larvales de erizo de mar

como modelo para determinar condiciones favorables para manipular larvas y someterlas a la

técnica de encapsulación, la cual se ha descrito tiene resultados favorables en la

criopreservación.
 8

Hipótesis de trabajo.

La encapsulación de blástulas de erizo de mar mediante el uso de alginato de sodio no afecta

la viabilidad y crecimiento post desencapsulamiento.

1.4 Objetivo general.

Establecer una metodología de encapsulamiento en base a geles de alginato de sodio en

estadíos larvales de Tetrapygus niger que permita conservar su viabilidad post-

desencapsulamiento.

1.5 Objetivos específicos.

- Generar protocolos de encapsulación de larvas para estadíos de blástula, utilizando

diferentes concentraciones de alginato de sodio.

- Determinar la viabilidad de las larvas encapsuladas y desencapsuladas.

-Determinar la viabilidad de las larvas encapsuladas y desencapsuladas, expuestas a un agente

crioprotector.
 9

2.- MATERIAL Y MÉTODOS

2.1 Obtención de ejemplares

Individuos maduros de erizo negro Tetrapygus niger, fueron obtenidos desde la bahía La

Herradura, siendo trasladados al Laboratorio Húmedo de la Universidad Católica del Norte y

mantenidos con agua de mar filtrada circulante y aireación constante por al menos 24 horas antes

de los experimentos.

2.1.1 Obtención de larvas

Los erizos de mar fueron lavados individualmente con agua de mar filtrada e inducidos al

desove y espermiación mediante el método tradicional inyectando KCl en la cavidad celómica a

través de la membrana de la región oral (Fuentes y Barros, 2000).

Se realizaron fecundaciones entre pool de gametos (n=3) de machos y hembras. Estos

fueron separados en recipientes de vidrio de 500 mL. a 16ºC con cambio de agua de mar filtrada

constante. A partir de las 20 horas siguientes a la fecundación se obtuvieron larvas en estado

blástula, a las 44 horas se obtuvieron estados prisma y a las 72 horas posterior se obtuvieron

estados pluteus de acuerdo a lo descrito por Fuentes y Barros (2000).

2.2 Encapsulación

2.2.1 Extracción de Alginato

A partir del alga parda Lessonia vadosa se realizó el procedimiento de extracción y

purificación de alginato de sodio descrito por Chandía et al. (2001).

 10

2.2.2 Preparación Agua de Mar Artificial

Debido a que el agua de mar contiene el catión Ca++ para evitar la polimerización del

alginato se prepara agua de mar artificial libre de este catión, de acuerdo a la fórmula ; 510nM

NaCl, 10 mM KCl, 50 mM MgCl2, 1 mM EGTA( etilen glicol del ácido tetracetico), 10 mM Tris-

HCl, pH 8.0 (Dupré y Schaaf, 1996).

2.2.3 Método de extrusión: preparación de cápsulas

Se utilizó el protocolo de preparación de cápsulas de alginato de sodio descrito por Shah

et al. (2010), utilizando alginato al 2% p/v diluido en Agua de mar artificial (AMA) preparada en

el laboratorio. Este alginato es mezclado con una muestra de blástulas de erizo de mar,

obteniendo un concentración final al 1 % p/v.

Utilizando una jeringa que contiene el gel con larvas, se dejó gotear sobre una placa Petri

con CaCl2 150 mM (diluido en AMA) y permanecieron ahí durante 10 minutos (Figura 1). Las

cápsulas formadas fueron tamizadas y lavadas con agua de mar filtrada, finalmente se

mantuvieron en un recipiente con agua de mar filtrada y aireación constante por 24 horas.

Figura 1: Método de extrusión básico y manual de cápsulas de alginato.

 11

2.2.4 Desencapsulación

Las cápsulas fueron puestas en un tubo que contiene una solución de citrato de sodio 75 mM

disuelto en AMA (pH 8.0). El gel de alginato de las cápsulas fue disuelto por ruptura mediante

vórtex a temperatura ambiente por 5 minutos. Las larvas liberadas fueron mantenidas en agua de

mar filtrada y aireación por 24 horas, la viabilidad se determinó cuantificando aquellas larvas que

llegaron al estadío larval de prisma y posteriormente a larva de dos brazos o también conocida

como larva pluteus temprana. Para ambas exposiciones se tomó una muestra de larvas para medir

el daño producido por el citrato y el vórtex.

2.3 Tratamientos

En el presente trabajo se consideró el pH (8.0) y la temperatura (T= 16ºC) como valores

constantes. El tratamiento control fue el cultivo de larvas en condiciones de laboratorio sin

exposición a agentes crioprotectores.

2.3.1 Tratamiento A: Alginato

Una muestra de larvas en estado de blástula fue encapsulada en alginato de sodio al 1%p/v y

al 1,5%p/v (Fig. 2 (a)), la cápsula fue mantenida en agua de mar filtrada y aireación constante

durante una hora, luego fue desencapsulada con Tris-citrato de sodio 75mM. La muestra se lavó y

tamizó 3 veces para evitar la retención de restos de alginato con cambio de agua constante.

2.3.2 Tratamiento D: Determinación de toxicidad del Dimetilsufóxido (DMSO)

Las larvas en estado de blástula de Tetrapigus niger fueron incubadas en DMSO 1M y 2M

durante 10 minutos (Fig.2 (b)), la exposición al DMSO fue realizada en 2 pasos molares.

Posteriormente fueron extraídas del DMSO y se cultivaron en agua de mar durante 24 horas.
 12

2.3.3 Tratamiento AD: Determinación de Toxicidad del DMSO en Alginato.

Se realizó el paso de encapsulación y desencapsulación anteriormente descrito para larvas de

blástula . Incorporando en este caso el DMSO 1M en el recipiente con CaCl 2 150mM, el tiempo

de exposición fue de 10 minutos. Las larvas liberadas de la cápsula por Tris-citrato de sodio

75mM fueron incubadas en agua de mar por 24 horas.

Figura 2: Esquema de los distintos tratamientos a los cuales fueron sometidas las larvas del erizo

de mar negro, Tetrapygus niger: (a) Tratamiento A, encapsulación en base de alginato de

sodio;(b) Tratamiento D, exposición a agente crioprotector DMSO y (c) Tratamiento AD,

encapsulación en base alginato de sodio con exposición a DMSO.

 13

2.4 Análisis de sobrevivencia y crecimiento

Para determinar la sobrevivencia y crecimiento de las blástulas que fueron expuestas a los

diferentes tratamientos se tomaron fotografías utilizando una cámara fotográfica marca Canon

modelo Powershot A630. Las imágenes obtenidas fueron analizadas con el programa de

microscopía Zeiss Axiovision 4.8.2 con el cual utilizando una escala conocida se estimó el

tamaño de las larvas en cada tratamiento. Así mismo, se utilizaron las imágenes para realizar los

conteos de individuos que pasaron al siguiente estadío larval, aquellos que permanecieron en

estado blástula y agrupación de células amorfas se consideró como mortalidad. La longitud larva

se determinó midiendo la distancia entre el vértice y el fin del brazo post-oral, que representa su

dimensión máxima, de acuerdo a lo descrito por Saco-Álvarez et al. (2010).

2.5 Análisis estadístico

Los datos fueron analizados mediante el programa estadístico Statistica 7. Utilizando la

opción ANOVA de una vía para comparar las medias del crecimiento entre Tratamientos, y Test

post hoc para identificar las mayores diferencias.

 14

3.- RESULTADOS

3.1 Controles

Individuos sometidos al control de exposición única al Tris-Citrato de sodio y

agitador vórtex por 10 minutos presentaron un 95 % de sobrevivencia.

3.2 Tratamiento A

Las cápsulas obtenidas con alginato al 1,5 % p/v fueron más compactas que aquellas al

1%p/v (Figura 3). En ambas concentraciones de alginato se utilizó una dilución 1:1 en cuanto a

gel de alginato y blástulas en AMA, obteniendo un promedio de 40 individuos por cápsula en

ambos casos. No existen diferencias significativas en la variable crecimiento y sobrevivencia en

el uso de ambas concentraciones.

F igu ra

Figura 3: Cápsulas de alginato que contienen blástulas de erizo de mar: (a) Alginato 1% p/v, (b)

Alginato 1,5% p/v .

 15

Los tratamientos que incluían alginato, al momento de su exposición al citrato de sodio y

agitador vórtex, el alginato retorna a su estado sólido y cae al fondo del recipiente por su peso,

por otra parte las larvas que fueron liberadas se observó un desprendimiento de la cadena ciliar

por lo que tendían a caer al fondo también. A las 24 horas siguientes del tratamiento las larvas se

recuperaron y son encontradas en la superficie al estado de prisma cuya sobrevivencia presentó

un 93% y 80%, respectivamente.

3.3 Tratamiento D

Las larvas expuestas a DMSO 1 M por 10 minutos no presentaron arrugamiento ni

pérdida del color y se obtuvo una sobrevivencia de 91.66%. Sin embargo, aquellas larvas

expuestas a DMSO 2 M se obtuvo una sobrevivencia de 50% y las larvas cambiaron

notoriamente su coloración, desde rosado a un color anaranjado y en algunos casos cercano a un

amarillo. También se observó una disminución de movilidad por lo que tendían a estar en el

fondo del recipiente. A las 24 horas alcanzaban un estado prisma deteriorado, de menor tamaño

en comparación con otros tratamientos, aquellas larvas expuestas a DMSO 1M presentaron un

tamaño promedio de 102.8 ± 10.1 µm y 84,56± 5.43 µm para aquellas expuestas a DMSO 2M

(figura 4), en este último se obtuvo coloración anaranjada y la mayoría de los individuos

permaneció en el fondo de la columna de agua.

3.4 Tratamiento AD

Así como los tratamientos anteriormente descritos, los individuos extraídos de las

cápsulas mediante el rompimiento de éstas por el agitador vórtex, permanecieron sin movimiento

en la columna, se observó una ausencia ciliar en la mayoría de los individuos de este tratamiento,

lo que explica que se mantuvieran en el fondo del recipiente. Sin embargo, luego de 24 horas del
 16

desencapsulamiento, las larvas se encuentran en estado prisma en la columna de agua cercana a

la superficie, presentan una coloración rosada, se observa nuevamente la presencia de cilios y en

movimiento.

Tabla I: Efecto de la exposición a la solución crioprotectante sobre movilidad de las larvas del

erizo de mar.

Estado Composición Molaridad Tiempo Estado Porcentaje de larvas

Larval de la cápsula CP (M) (Hrs) esperado móviles (sobrevivencia)

Blástula Alginato 1% - 1 24 Prisma 93,59

Blástula Alginato 1,5% - 2 24 Prisma 80,68

Blástula - DMSO 1 24 Prisma 91,66

Blástula - DMSO 2 24 Prisma 50

Blástula Alginato 1% DMSO 1 24 Prisma 79,44

Blástula Alginato 1,5% DMSO 1 24 Prisma 83,33

 17

3.5 Análisis estadístico

Mediante el análisis de muestras dependientes de una vía ANOVA, se obtuvo que la

distribución de crecimiento en los tres tratamientos tiene diferencias significativas (fig. 4). Por lo

que se realizaron otras pruebas estadísticas post hoc, a partir de los resultados obtenidos del Test

de student se utilizó uno más específico conocido como test de Scheffé (tabla II), en el cual se

observó una diferencia significativa en los tamaños de las larvas observadas en el Tratamiento D

y AD (p˂0.05), observado también en los promedios de tamaño de 102,8±10.1 µm y 113.91

±9.35 µm, respectivamente.

A D AD Control

A 0.128165 0.264746 0.697498

D 0.128165 0.001747 0.750204

AD 0.264746 0.001747 0.048241

Control 0.697498 0.750204 0.048241

Tabla II: Test de Scheffé (p˂0.05), comparaciones de varianza de medias entre los tratamientos.
 18

Figura 4: Promedio de tamaños obtenidos en larvas en estado de prisma 24 horas post

exposición a los distintos tratamientos: (A) alginato 1%, (A2) alginato 1.5%, (D) DMSO 1M,

(D2) DMSO 2M, (AD) alginato 1% y DMSO 1M, (AD2) alginato 1,5% DMSO 2M y finalmente

el control, cuyas larvas crecieron en condiciones normales de laboratorio.

 19

4.- DISCUSION

Es bien conocido que el desarrollo embrionario es un proceso sensible y presentan un

amplio espectro de respuestas fenotípicas a cambios ambientales, especialmente a aquellos que

afectan la disponibilidad alimenticia (Rodríguez, 2003). Existen muchos estudios que utilizan

estados larvales para medir el daño ante ciertas variables, la sobrevivencia y el crecimiento dan

apoyo al método descrito por Saco-Álvarez et al. (2010). Sin embargo, esta respuesta no asegura

que el individuo se asiente y metamorfosee. Cabe mencionar que una de las problemáticas

también señalada en otros estudios es que la inducción del desove, permite utilizar huevos

inmaduros que no podrían ser liberados normalmente durante el desove natural. La tasa de

desarrollo de cualquier larva que es producida por tales huevos puede ser más lento que para

aquellos huevos completamente maduros. Estos también pueden ser menos tolerantes a

condiciones sub-óptimas y por lo tanto, menos manejables a la criopreservación (Adams et al.,

2006).

En este estudio se utilizó el DMSO como agente crioprotector, en concentraciones bajas,

para disminuir la citotoxicidad en la larvas de erizo. Del mismo modo, se utilizó la concentración

más baja de alginato para la mantención de las larvas, puesto que una cápsula con mayor

concentración de alginato tiende a ser más rígida, y menos permeable (Schoichet et al. 1996;

Blandino et al. 1999; Dembczynski y Jankowski, 2000) dificultando la entrada del crioprotector,

también el rompimiento de la cápsula conlleva al uso de concentraciones más altas de citrato de

sodio y el aumento de la intensidad del vórtex, esto afecta la viabilidad de nuestras larvas.

Ambas exposiciones en conjunto mostraron una gran significancia, puesto que los valores

de tamaño fueron mayor en este tratamiento en comparación con el control, y con la exposición
 20

única al DMSO. De acuerdo a Zhang et al. (2010), las técnicas combinadas dan mejores

resultados en la criopreservación.

La exposición de la gota de alginato de sodio con la solución de cloruro de calcio fue de

10 minutos de tal manera que atrape la mayor cantidad de iones Ca++ los cuales contribuyen a la

formación de la matriz sintética de la cápsula. De acuerdo a Castaños (2010), a un mayor tiempo

de exposición se llega a un punto en el que se estabiliza el proceso de gelificación y se puede

considerar que la polimerización está completa. Sin embargo, la factibilidad del uso de las

cápsulas también está determinada por la concentración de ácido manurónico y ácido gulurónico.

Funami et al. (2009) realizaron un estudio del comportamiento de gelificación del alginato de

sodio en la presencia de Ca2+ a distintas tasas de G/M, en el cual, obtuvo que la presencia de los

bloques G tienden a ser un desencadenante en la gelificación, así también son los que determinan

la tasa de incorporación de Ca++. Por lo tanto, al utilizar el alginato se debe conocer muy bien su

composición, pues depende de ésta su desempeño en la aplicación.

Las diferencias de la composición de las cápsulas al mismo tiempo pueden afectar el

proceso inverso, puesto que a mayor fuerza, estabilidad y concentración, se obtienen cápsulas

más difíciles de romper y deshacer. En este trabajo, la dificultad estuvo asociada a la pérdida de

cilios de la larva que se encuentra en la cápsula, y el tiempo que ésta toma para volver a formar

sus cilios, esta cinética es controlado por la producción de ciertas proteínas, las que varían

dependiendo del pool genético. Burns (1973), indica que la cinética ciliar o tasa de crecimiento

ciliar varía tanto de la especie como del estado embrionario en el que se encuentra.

Actualmente la utilización de la técnica de encapsulación ha demostrado obtener buenos

resultados en células de animales terrestres, por lo que cabe destacar que al crear un protocolo
 21

específico para invertebrados marinos, cuya viabilidad se hace presente en este trabajo, también

genera una expansión al uso de innumerables técnicas para mejorar y disminuir el criodaño en

especies de importancia comercial. Al mismo tiempo abre paso a la aplicación de otros

polisacáridos marinos, tales como: ulvanos, carragenanos, laminaranos y fucanos.

En conclusión, la encapsulación mediante alginato de sodio no afecta la viabilidad y

crecimiento de las larvas de Tetrapygus niger post-desencapsulamiento. También se demostró

que el alginato juega un rol de protección en las larvas expuestas a un agente crioprotector como

lo es el DMSO, aumentando la viabilidad de las larvas en estos tratamientos.

 22

5.- REFERENCIAS

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