ABSTRACTO

El descubrimiento de la estructura de doble hélice del ADN hace medio

siglo sugirió inmediatamente un mecanismo para su duplicación por la
copia semi-conservadora de la secuencia de nucleótidos en dos cadenas
hijas de ADN. Poco después, un segundo paso fundamental para la
elucidación del mecanismo de la replicación del ADN fue tomado con el
aislamiento de la primera enzima capaz de polimerizar ADN a partir de
una plantilla. En los años subsiguientes, el mecanismo básico de la
replicación del ADN y sus componentes de la maquinaria enzimática se
aclarará, en su mayoría a través de enfoques genéticos y en bioquímica
vitro. Más recientemente, la organización espacial y temporal del proceso
de replicación del ADN in vivo en el contexto de la cromatina y el interior
de la célula intacta finalmente están comenzando a ser dilucidado. Por un
lado, los recientes avances en técnicas de alto rendimiento en todo el
genoma están proporcionando una nueva ola de información sobre la
progresión de la replicación del genoma a gran resolución espacial. Por
otro lado, las técnicas de microscopía de super-resolución novedoso están
empezando a darnos los primeros atisbos de cómo se organiza la
replicación del ADN en el contexto de las células intactas individuales con
alta resolución espacial. La integración de estos datos con análisis de
microscopía lapso de tiempo nos dará la posibilidad de filmar y diseccionar
la replicación del genoma in situ y en tiempo real.

Tras la elucidación de la estructura de doble hélice del ADN por Watson y

Crick (Watson y Crick 1,953) y el aislamiento de la primera ADN
polimerasa por Kornberg (Kornberg 1,960), una cuestión biológica
fundamental ha sido cómo genomas se duplican antes de la división
celular. En los 50 años desde que estos descubrimientos seminales, los
mecanismos básicos de la replicación del ADN han sido establecidos por
una poderosa combinación de la genética y la bioquímica vitro. A partir
de este cuerpo de trabajo, es evidente que las características y
componentes de la replicación del ADN fundamentales están bien
conservadas durante la evolución desde las bacterias hasta los
mamíferos. Una lista completa de proteínas que están implicadas en el
proceso y sus actividades ha sido compilado, y ahora es posible
proporcionar una descripción relativamente detallada de la maquinaria de
replicación del ADN a nivel molecular (Fig. 1) (Perumal et al. 2.009) . Sin
embargo, el ADN genómico en células eucariotas está lleno
jerárquicamente dentro del núcleo y la duplicación del genoma requiere
el esfuerzo concertado de muchos miles de unidades de replicación
individuales. Como tal, una cuestión igualmente importante es cómo se
coordina la replicación del ADN en el espacio y el tiempo a través de todo
el genoma dentro de la célula viva.

Figura 1.
Esbozo esquemático del tenedor de replicación de ADN y componentes
moleculares y las actividades enzimáticas de la replisoma. PCNA, antígeno
nuclear de proliferación celular (también denominado pinza ADN
polimerasa o factor de capacidad de procesamiento). SSB, el ADN de
cadena sencilla proteínas de unión. ...

RÉPLICA ADN: LO BÁSICO

Cada célula de ciclismo necesita para duplicar su genoma antes de que se

divide. Esto implica no sólo la duplicación precisa y completa su
información genética, que es el foco de este artículo, sino también la
restauración de su información epigenética para construir las estructuras
de la cromatina diferenciados.
Después las células se dividen, los llamados complejos prereplication
incluyendo el complejo helicasa de ADN (MCM 2-7) se reúnen en el ADN
durante toda la fase G1 (por soplado y Dutta 2.005). Al final de G1, la
entrada de la maquinaria del ciclo celular a través de las quinasas
dependientes del ciclo celular desencadena iniciación de la replicación del
ADN en sitios discretos, conocidos como orígenes de replicación, dispersos
por todo el genoma. Cada incendios origen, una vez por ciclo celular y su
espaciamiento deben asegurarse de que todo el genoma se replica
durante la fase S. Los primeros resultados de los experimentos de fusión
de células indicaron que el ADN replicado a partir de ADN no replicado
difería porque no era permisiva para la replicación a menos que pasa a
través de una división mitótica (Rao y Johnson 1.970). Experimentos
posteriores utilizando ensayos de replicación de células libres perfeccionó
esta idea y un modelo fue propuesto por el que los orígenes de replicación
se "licencia" para replicar a finales de la mitosis y G1, y la "licencia" se
retiró como fue replicado el ADN en la fase S (Blow y Laskey 1.988).
Evidencia bioquímica detallada ya está disponible e indica que la
prevención de reconsolidación del MCM complejo de ADN es la clave para
evitar rereplication (Blow y Dutta 2005).

En las bacterias y eucariotas inferiores, los orígenes de replicación se

definen por secuencias específicas de ADN; mientras que en metazoos las
características definitorias de estos sitios siguen siendo menos claro
(Robinson y Bell 2005; Aladjem 2007; Hamlin et al 2008). En cada origen,
proteínas de replicación se ensamblan, que luego duplicar un segmento
(replicón) del genoma de una manera processive (Jacob y Brenner 1963;
Jacob 1.993). Las unidades activas de la replicación del ADN, que consiste
en la maquinaria de replicación (también llamado replisome), la plantilla
de ADN existente, y la cadena de ADN naciente, se conocen como las
horquillas de replicación. Después de la iniciación de la síntesis de ADN,
las horquillas de replicación proceden bidireccionalmente desde el origen,
desenrollar el ADN genómico a medida que atraviesan el cromosoma
(Huberman y Riggs 1.968).

A nivel molecular, la replicación de un molde de ADN genómico implica al

menos dos polimerasas diferentes de ADN, una primasa de ADN, una
helicasa de ADN, una sola cadena de ADN de unión (SSB) complejo de
proteínas (proteína de replicación A, RPA), las topoisomerasas de ADN,
una abrazadera complejo de carga (factor C replicación, RFC) y una (pcna,
PCNA) pinza ADN polimerasa o factor de capacidad de procesamiento.
Además, la polaridad inherente de la reacción de síntesis de ADN (5 'a 3')
requiere la duplicación discontinua de la cadena retrasada además de la
síntesis líder hebra continua. Este proceso implica la síntesis de corto (de
180-200 pb en células eucariotas) fragmentos de ADN conocidas como
fragmentos de Okazaki (Okazaki et al. 1,968) que posteriormente se
procesa y se ligaron entre sí por una serie de enzimas adicionales,
incluyendo las endonucleasas flap (FEN- 1) y la ADN ligasa I (Hubscher y
Seo 2001). Para explicar cómo se coordina la síntesis de ambas hebras,
un dímero asimétrico de ADN polimerasas y factores asociados se ha
propuesto primero para la replicación del ADN procariótico (McHenry
1988) y posteriormente extendido para eucariotas (Tsurimoto y Stillman
1.989). Con el fin de que las polimerasas diméricas pueden extender las
dos hebras antiparalelas a la misma velocidad y en la misma dirección,
de enlace posterior de la cadena retrasada en el replisoma (modelo
"trombón") se ha postulado, con el reciclaje de la polimerasa-rezagado
cadena del final de un fragmento de Okazaki a la siguiente formando un
bucle de cebado cebador de ARN (Sinha et al., 1980; Pandey et al 2009.).
Esta situación sugiere que la maquinaria de replicación a un tenedor de
replicación dada probable consiste en al menos dos módulos funcionales
(sub), uno encargados de dirigir-síntesis de la cadena, y el otro para
rezagados-síntesis de la cadena (Fig. 1). La evidencia bioquímica apunta
a la existencia de grandes complejos de replicación multiproteicos
preformados que contienen todas las actividades (Noguchi et al., 1983;
Tom et al., 1996). Sin embargo, la evidencia de análisis de microscopía
de células vivas puntos a interacciones cortos de tiempo entre los
componentes individuales, lo que sugiere complejos altamente dinámicas
(Sporbert et al., 2002; Sporbert et al., 2005; Schermelleh et al., 2007;
Görisch et al., 2008).

RÉPLICA ADN: EN VIVO

Investigar cómo se organizan las distintas actividades necesarias para la

síntesis de ADN dentro del núcleo celular se refiere a la cuestión más
amplia de entender cómo se regula la replicación del ADN a nivel celular.
Una célula debe duplicar la totalidad de su genoma una vez y sólo una
vez cada vez que se divide. Por lo tanto, en el sentido más amplio, la
investigación de la regulación global de la replicación del ADN se puede
destilar en la cuestión de cómo se coordina la actividad de las unidades
de replicación individuales a lo largo de un ciclo celular. Este problema
bastante desalentador puede dividirse en preguntas más específicas.
¿Cómo se propaga la replicación a lo largo de los cromosomas? ¿Cómo
funciona el celular a asegurar que todo el genoma se replica? ¿Dónde lo
largo del cromosoma comienza la replicación? Estas preguntas fueron
dirigidas originalmente en bacterias, donde el programa de replicación
procede de una manera bastante directa con los orígenes de replicación
genéticamente bien definidos, que el fuego una vez por ciclo celular (Mott
y Berger 2007).

Sin embargo, el tamaño y la complejidad de los genomas eucarióticos

mucho mayor impone dificultades adicionales en la organización de la
replicación del ADN. Por lo tanto, la replicación del ADN eucariota
representa una situación más compleja que permanece poco conocida. La
confusión se centra alrededor de dos observaciones aparentemente
contradictorias. En primer lugar, un número de estudios han demostrado
claramente que la replicación del ADN sigue una progresión temporal
definido (Sparvoli et al., 1994; Cardoso et al., 1997; Jackson y Pombo
1.998; Ma et al., 1998; Dimitrova y Gilbert 2000; Leonhardt et al . 2000;.
Sadoni et al 2004; Easwaran et al., 2005). Activamente transcritas,
euchromatic regiones del genoma tienden a ser duplicado a principios de
la fase S, mientras que la heterocromatina, que está más condensada ya
menudo transcripcionalmente silencioso, replica tarde en la fase S (Fig. 2
y Movie 1 línea en http: //cshperspectives.cshlp .org /). Este fenómeno
fue descrito originalmente por la observación de la replicación a lo largo
de los cromosomas teñidos con Giemsa y correlacionar la síntesis de ADN
con patrones de bandas (Drouin et al. 1990). En segundo lugar, los
orígenes de replicación eucariotas fuego de una manera estocástica en
toda la fase S (Dijkwel et al., 2002; Patel et al 2006). Por lo tanto, la
distribución de los orígenes activos, y la iniciación de este modo la
replicación, los cambios entre cada ciclo celular. Dada la naturaleza
aleatoria de origen de replicación de tiro, es difícil entender cómo una
célula puede mantener la progresión temporal de la replicación. La
conciliación de estos datos adquiridos a muy diferentes niveles de
resolución espacial (de entre cientos de pares de bases de fibras de ADN
estirados y por análisis de electroforesis en gel de dos dimensiones a
megabase dominios de la cromatina en células completas in situ) presenta
un obstáculo significativo a nuestra comprensión de cómo replicación
procede en células eucariotas.
Figura 2.
Progresión temporal de la replicación del genoma. Instantáneas de un
time-lapse película microscopía confocal de la replicación del ADN a lo
largo del ciclo celular en células humanas HeLa que expresan
establemente PCNA GFP-etiquetados. Los tiempos se indican en horas:
minutos y fases del ciclo celular...

Cabe señalar que la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae

representa una excepción a la estrategia eucariota estándar para la
duplicación del genoma. Similar a las bacterias, S. cerevisiae posee
secuencias de origen de replicación bien definidos que pueden disparar a
una velocidad muy eficiente durante la fase S, dando lugar a un patrón
muy homogéneo de la replicación del ADN (<biblio>). Además, el análisis
de todo el genoma de la iniciación de la replicación indica que no hay
sesgo para los sitios de transcripción activa y sin demora observables para
cualquier distintas regiones del genoma (Raghuraman et al., 2001). Por
estas razones, es quizás engañosa generalizar conclusiones obtenidas con
este sistema cuando se contempla eucariota tiempo la replicación del
ADN. Por lo tanto, este artículo se centra en cómo se regula la replicación
del ADN en el núcleo de los sistemas de metazoos.
ENFOQUES GENÓMICOS PARA EL ESTUDIO DEL TIEMPO DE LA
REPLICACION
El reciente desarrollo de ensayos genómicos tiene por primera vez
permitió un examen de todo el genoma de la sincronización de replicación
en poblaciones de células eucariotas. Por ejemplo, el análisis de
microarrays se ha utilizado con éxito en una variedad de sistemas para
generar perfiles de todo el genoma de temporización de replicación.
Estrenada en S. cerevisiae, y más recientemente en S. pombe, Drosophila
melanogaster, y sapiens Homo células (Raghuraman et al., 2001;
Schubeler et al., 2002; Watanabe et al., 2002; White et al., 2004;
Woodfine et al., 2004; Jeon et al., 2005; Eshaghi et al. 2.007;. Hiratani
et al 2008; Watanabe et al 2008), esta técnica por lo general requiere la
sincronización de una población de células en el G1 / S o de su límite de
citometría de flujo la clasificación basada en el aumento de contenido de
ADN a través de la fase S. Tras la liberación en la fase S, la acumulación
de ADN recién sintetizado con el tiempo se mide por hibridación con
arrays de ADN. Alternativamente, el ADN naciente aislado puede
secuenciar directamente a través de alto rendimiento técnicas de
secuenciación profunda novedosos. Un resumen de estos estudios se
compila en la Tabla 1.

Peinado ADN es otra técnica que ha sido recientemente utilizado para

investigar sistemáticamente iniciación de la replicación y el alargamiento
en el nivel de las fibras individuales de ADN. , Moléculas de ADN
individuales largas son despojados de proteínas, estirados uniformemente
a través de una superficie de vidrio, y se examinaron por microscopía de
fluorescencia estándar (Bensimon et al. 1994). Por células de pulso de
etiquetado con nucleótidos antes de este tratamiento, es posible examinar
directamente los sitios de síntesis de ADN (Pasero et al., 2002; Anglana
et al 2003.). Originalmente utilizado con nucleótidos marcados
radiactivamente para medir con precisión la tasa de progresión tenedor
de replicación (Huberman y Riggs 1,968), estudios más recientes han
utilizado este enfoque para comparar la eficiencia de origen de disparo
entre las regiones tempranas y tardías de replicación (Patel et al. 2006).

La aplicación de estos métodos ha, por primera vez, permitió el examen

de cómo avanza la replicación del ADN a nivel genómico. La disponibilidad
de varias secuencias del genoma completo ha permitido adicionalmente
evaluación en silico de la correlación de la replicación del ADN con las
características genómicas estructurales y funcionales. Por ejemplo,
mientras que una relación entre la actividad transcripcional y la
sincronización de replicación había sido sugerida por anteriores informes
de análisis de genes individuales (Gilbert 2002), los estudios de
microarrays que investigan el momento de la replicación del ADN a lo
largo de D. melanogaster y los cromosomas humanos convincentemente
vinculadas estos procesos a nivel de todo el genoma (Schubeler et al.,
2002; Woodfine et al., 2004; Jeon et al., 2005). Específicamente, las
regiones de replicación primeros muestran una fuerte correlación con las
zonas ricas de genes que poseían un alto contenido de GC y contenían
genes transcritos activamente. De hecho, un análisis del genoma humano
de alta resolución reveló que los límites entre las regiones con diferente
contenido de GC (los llamados isochores) correlacionado con las fronteras
entre las zonas de sincronización de replicación del ADN (Costantini y
Bernardi 2.008). Además, estudios recientes también mostraron que una
porción sustancial del genoma (aprox. 60%) no se replica hasta mucho
más tarde en la fase S (Eshaghi et al., 2007).

La dinámica de origen de tiro también ha sido examinada por el análisis

de todo el genoma. De acuerdo con informes anteriores, se encontró que
este proceso sea estocástico, dando lugar a una distribución aleatoria de
sitios de iniciación de la replicación a través de los cromosomas (Patel et
al. 2006). También se demostró que los primeros orígenes fase S son muy
ineficientes para iniciar la replicación. Por el contrario, la eficiencia de
cocción relativo de finales de los orígenes fase S, aunque todavía se
producen de una manera aleatoria, fue significativamente mayor (Eshaghi
et al. 2007). Esto podría reflejar el hecho de que menos de ADN está
"autorizado" para replicar en posteriores etapas de la fase S que conducen
a una eficiencia de tiro al parecer más alto. Alternativamente, en el
supuesto de reciclaje de un factor que limita la replicación de iniciación-
disparar-ha redistribución también permitió propensión modelado
razonable de la fase S basado en estocástico despido de orígenes
individuales (Lygeros et al. 2008). Quinasas dependientes de ciclina se
sugieren como factores limitantes iniciación. Estos factores se reciclan a
los orígenes de disparo finales de los años, lo que aumenta la probabilidad
de su activación.
En conjunto, estos resultados han llevado a la "modelo de eficiencia cada
vez mayor", que tiene el potencial para explicar muchas de las preguntas
en torno a la regulación de la replicación del ADN. Los centros idea
alrededor de la hipótesis de que como una célula progresa a través de la
fase S, la eficiencia global con la que la fracción restante de los orígenes
de replicación disponibles inicia aumentos (Lucas et al., 2000; Hyrien et
al., 2003). Un aspecto atractivo de este modelo es que se da cuenta de
cómo las células pueden evitar el problema de las lagunas en la replicación
del ADN. Por otra parte, suponiendo que diferentes regiones del genoma
poseen eficiencias variables de origen de cocción, también puede explicar
cómo una célula podría mantener cocción estocástica de los orígenes de
replicación y todavía replicar su ADN en una manera ordenada (Rhind
2.006).

En general, esta propuesta ofrece una explicación satisfactoria de cómo

se modula la sincronización de replicación en los núcleos eucariotas. Sin
embargo, dos cuestiones muy importantes permanecen. En primer lugar,
¿cómo la eficiencia de tiro de los orígenes de replicación de aumentar en
el transcurso de la fase S? En segundo lugar, lo que determina la eficacia
de la replicación inherente de una región genómica dado? En cuanto a la
primera pregunta, un modelo se centra en el concepto de reciclaje de la
polimerasa, mediante el cual un número fijo de complejos de polimerasa
de ADN están disponibles para la célula. En el inicio de la fase S, sólo los
más eficientes y / o orígenes accesibles tener la oportunidad de iniciar la
replicación. A medida que el genoma se convierte en duplicado, el número
de orígenes potenciales disminuye, aumentando así la probabilidad de que
se dispara. La respuesta a la segunda pregunta es menos claro, pero las
alteraciones en la estructura de la cromatina es probable que desempeñar
un papel central.

La probabilidad de que una conexión entre estructura de la cromatina y

el momento de replicación ha sido bien establecido (Donaldson 2005).
Esta discusión está más a menudo enmarcado por la correlación entre la
estructura de la cromatina abierta presentes en regiones
transcripcionalmente activas y el hecho de que estos sitios se replican a
menudo temprano en la fase S. En la vista más simple, una estructura de
la cromatina relajado resultados en el ADN genómico más accesible, lo
que conduce a una mayor unión eficiente tanto por factores de
transcripción y replicación. Ha habido una cierta discusión sobre si la
replicación o transcripción juega un papel causal en esta relación (es
decir, si los sitios de replicación primeros "definen" regiones de
transcripción o viceversa), pero no se han obtenido resultados
concluyentes. Una de las deficiencias de los métodos genómicos descritos
anteriormente es que mientras que los perfiles de replicación de
temporización ciertamente reflejan la influencia de estructura de la
cromatina, es difícil dar marcha atrás y examinar directamente la
naturaleza de esta cromatina. Esto es debido en parte a la ensemble /
naturaleza agrupado de análisis genómico, así como el hecho de que ni
ensayo permite un examen detallado de la estructura particularmente
nuclear.

ORGANIZACIÓN CELULAR DE LA REPLICACIÓN

Cromosomas y dominios cromosómicas se organizan no aleatoria dentro

de los núcleos eucariotas y su topología se cree que tienen importancia
funcional (Cremer Cremer y 2001; Kumaran et al., 2008;. Takizawa et al
2008). La inspección microscópica de núcleos es un enfoque poderoso
para investigar la organización espacio-temporal de la replicación en el
contexto de la arquitectura nuclear. La síntesis de ADN en curso
proporciona una manera de detectar directamente los sitios nucleares de
la replicación del ADN después de la introducción de nucleótidos marcados
en las células. Inicialmente, timidina radiactiva se utilizó (Milner 1969) y
más tarde, con el desarrollo de anticuerpos que detectan específicamente
los análogos de timidina halogenados (Gratzner 1.982;. Aten et al 1992),
el análisis de inmunofluorescencia de las estructuras de replicación
nucleares se convirtió en la realidad (Nakamura et al., 1986; Nakayasu y
Berezney 1,989; O'Keefe et al., 1992). Más recientemente, se hizo
análisis de microscopía de células vivas de la progresión de la replicación
posible mediante la introducción de nucleótidos conjugados con
fluorescencia (Schermelleh et al., 2001 o por la expresión de factores de
replicación fluorescentes) (Cardoso et al., 1997; Leonhardt et al., 2000).

Con estos enfoques, la replicación del ADN se encontró que se produzca

en sitios subnuclear llamados focos de replicación, que se acumulan
numerosos factores replicación del ADN y proteínas del ciclo celular
(Cardoso et al., 1993; Cardoso et al., 1997). Estos focos muestran
distintos patrones de localización en el transcurso de la fase S; como tal,
el estudio de su composición y dinámica permite un examen de cómo se
regula la replicación del ADN a nivel celular. Microscopía de lapso de
tiempo de células de mamíferos que viven en el transcurso de un ciclo
celular completo (Fig. 2 y la película 1 en línea en
http://cshperspectives.cshlp.org/) ha demostrado que temprano en la
fase S, inmediatamente después de la aparición de la DNA replicación,
una multitud de pequeños focos de replicación se distribuyen por todo el
núcleo. Durante mediados de la fase S, los focos de replicación son
uniformemente más grande, y se distribuyen alrededor de la periferia de
la envoltura nuclear y nucleolos. Por último, al final de la fase S, los sitios
de replicación se han consolidado en un pequeño número de muy grandes
focos. Además de reflejar la etapa de la progresión de la fase S, el patrón
de focos de replicación también se correlaciona con la naturaleza y la
topología de la cromatina que se replica. Por ejemplo, los patrones de
replicación temprana representan transcriben activamente eucromatina,
mientras que los patrones de replicación finales están asociados con
regiones heterocromáticas. Por lo tanto, este tipo de análisis microscópico
permite la visualización simultánea de ambas dinámicas de replicación y
estructura de la cromatina en una base de células individuales.

Aún no se ha establecido el papel de las modificaciones de la cromatina y

reordenamientos estructurales en la organización de replicación. Cierta
evidencia experimental sugiere un papel de los factores de remodelación
de la cromatina y de montaje para facilitar la replicación a través de
dominios de heterocromatina (Collins et al., 2002; Quivy et al 2008.). Sin
embargo, el impacto de las modificaciones de las histonas es menos clara.
Por ejemplo, la alteración de la histona H3 lisina 9 trimethylation, la marca
epigenética típico de heterocromatina, no afecta significativamente a
finales de replicación de chromocenters ratón (Wu et al. 2006). Otras
modificaciones de las histonas, tales como la fosforilación de la histona
H1 enlazador por Cdk2, se han propuesto para jugar un papel en la
descondensación a gran escala de la cromatina asociada con la replicación
(Alexandrow y Hamlin 2.005).

Examinar la dinámica de la maquinaria de replicación durante la fase S

ha proporcionado además una visión detallada de cómo avanza la
replicación del ADN a nivel celular. La combinación de la microscopía de
lapso de tiempo con fluorescencia photobleaching / activación indica que
la capacidad de procesamiento de la maquinaria de replicación se basa en
las interacciones transitorias de varias enzimas de replicación con un
núcleo estable integrado por el PCNA factor de procesividad (Sporbert et
al., 2002; Sporbert et al. 2005;. Schermelleh et al 2007; Görisch et al
2008.). Este último permaneció asociado con el ADN y sobre
photobleaching ninguna recuperación se midió por períodos de más de 10
minutos. Cuando se midió el montaje de PCNA, se encontró que se
produzca en los sitios adyacentes a los que previamente etiquetados. Esto
indicó que una vez que se ha completado la replicación en un sitio dado,
un nuevo enfoque de replicación de novo ensambla en un sitio vecino
(Sporbert et al., 2002; Sadoni et al 2.004.). Datos consistentes se ha
reportado el uso de dobles nucleótidos experimentos pulso-caza-pulso,
por el cual el ADN replicado secuencialmente se etiqueta por dos pulsos
consecutivos de nucleótidos modificados (Manders et al., 1996; Jackson
y Pombo 1.998). Por lo tanto, la replicación de una región genómica
específica facilita la posterior carga de los nuevos factores de replicación
en los sitios vecinos. Una interpretación de este resultado es que el acto
de la replicación induce cambios locales en la condensación de la
cromatina, que a su vez promueve el acceso / reclutamiento de factores
de replicación y el inicio de los ciclos de replicación adicionales.
Replicación comenzaría en sitios con una "abierta" la conformación de la
cromatina, similar a lo que ya ha sido propuesto. Como resultado de estos
eventos de replicación iniciales, la cromatina en las regiones adyacentes,
que normalmente no apoyarían iniciación de la replicación, comenzaría a
decondense, dando lugar a un aumento de la probabilidad de que los
orígenes presentes en estos sitios dispararían. Es tentador sugerir que la
actividad de helicasas de replicación tales como las proteínas MCM
promovería descondensación cromatina local. Sin embargo, es
igualmente factible que el mero acto de polimerización de ADN es
suficiente para inducir dichos cambios. Esta propagación descondensación
fibra de cromatina puede ser visualizado como análoga a tirando de un
cordón de zapato.

En una escala de todo el genoma, este modelo, lo que nos referimos como
el modelo de dominó, conduce a un modo simple, auto-propagación por
el cual la totalidad de los cromosomas se vuelven completamente
duplicarse simplemente difundir el proceso de replicación usando el
principio de "vecino más cercano" ( La Fig. 3). Esta hipótesis también
encaja muy bien con el modelo de eficiencia cada vez mayor, ya que
proporciona una base física de por qué la eficiencia origen aumentaría en
el transcurso de la fase S. El aumento de la eficiencia de los orígenes
finales no es por el reciclaje de la polimerasa; sino que puede ser
explicada por el hecho de que como una célula progresa a través de la
fase S, se hace más y más probable que cualquier región dada del genoma
es proximal a un sitio de replicación del ADN. Por lo tanto, incluso los
orígenes, contenidos en las regiones de replicación finales de hiper-
condensados como la heterocromatina se hacen accesibles medida que
más y más de la cromatina que rodea sufre replicación.

Figura 3.
Modelo para la progresión de genoma modelo de replicación-domino. (A)
Un grupo replicón (rojo) inicia la replicación en la fase S temprana y la
síntesis de ADN procede bidireccionalmente (burbujas de replicación).
Esto activa el inicio de replicón vecina...

DIRECCIONES FUTURAS

A pesar de los importantes avances en la caracterización del proceso de

replicación del ADN, varias preguntas básicas siguen sin respuesta. Por
ejemplo, todavía no es totalmente evidente cómo la propagación de la
replicación del ADN durante la cromatina se coordina con otros procesos
nucleares. En otras palabras, ¿cómo es la duplicación de la (epi) del
genoma de una vez y sólo una vez por ciclo celular logrado con alta
precisión en un entorno muy variables incluyendo la transcripción
paralelo, reparación, y otras actividades metabólicas de ADN, y en una
plantilla tal diferenciada como la cromatina? ¿Cómo se cromatina
epistates mantenidos en cada ciclo celular? ¿Es la actividad transcripcional
o la estructura de la cromatina determinar la sincronización de replicación
o están más determinados por el tiempo que se replican durante la fase
S?

La interdependencia de todos estos procesos nucleares también está

influenciada por el hecho de que múltiples componentes moleculares que
actúan sobre el metabolismo del ADN son compartidos. Por un lado, el
hecho de que, por ejemplo, muchos factores de replicación de ADN se
comparten con vías de reparación del ADN (el mismo también es el caso
entre la reparación y factores de transcripción) es mucho más económica
para la célula cuando se trata de tareas similares. Por otro lado, esto
puede ser una estrategia peligrosa como mutaciones en factores
individuales tendrán efectos pleiotrópicos y factores pueden llegar
agotado y convertirse en la limitación de velocidad.

Por último, la comprensión del proceso de replicación del ADN requerirá

la capacidad de conectarse datos de los estudios genómicos con los datos
de las células individuales en un modelo coherente unificado. Cerrar esta
brecha (temporal y espacial) se está convirtiendo en realidad con la
llegada de las técnicas Nanoscopia super-resolución novedosos. De
hecho, los últimos análisis de la replicación del ADN en células intactas
proporcionados mucho mayor resolución y en consecuencia mucho mayor
número de focos de replicación a lo largo de la fase S (Baddeley et al.
2009). En un futuro próximo, un objetivo importante del campo será para
visualizar y caracterizar en detalle replicones individuales en células
intactas, que anteriormente sólo se identificaron en las fibras de ADN
estirados (Fig. 4). La integración de estos datos con el análisis lapso de
tiempo nos dará la posibilidad de filmar y diseccionar la replicación del
genoma in situ y en tiempo real.
La Figura 4.
Conexión de análisis de replicón en las fibras de ADN a células enteras in
situ focos de replicación. Células HeLa humana que expresan GFP-
etiquetados PCNA fueron imágenes utilizando confocal convencional
microscopía de barrido láser (CLSM) o super-resolución iluminación 3D-
estructurada...