CULTIVO DE CÉLULAS Y

TEJIDOS VEGETALES

Técnicas de esterilización y
manipulación aséptica

Profesora Lorena Tineo García

1. CONTAMINACIÓN
2. OXIDADACIÓN
3. VITRIFICACIÓN
…ASPECTOS INDESEABLES
4. FRIABILIDAD
…ASPECTO DESEABLE

DE LOS TEJIDOS Y
CÉLULAS
CULTIVADOS
IN VITRO
Recapitulando sobre:
PROCESO DE ESTABLECIMIENTO DE LOS CULTIVOS IN VITRO.
Objetivo: Cultivos asépticos y vivos.
• ASEPSIA • ASEPSIA

FENÓMENOS MEDIOS DE
FISIOLÓGICOS
VINCULADOS AL CULTIVO
CCTV SINTÉTICOS

MEDIO
ELECCIÓN
AMBIENTE
DEL
ARTIFICIAL
EXPLANTE
• ASEPSIA • ASEPSIA
 CONTAMINACIÓN
• Definición de Asepsia
• Ausencia en el sistema de cultivo de
cualquier organismo contaminante que
pudiera afectar los resultados o incluso
matar el tejido vegetal cultivado.
• Contribuye: Los medios ricos en
nutrientes en los cuales prospera una
amplia gama de microorganismos.
 CONTAMINACIÓN
• Principalmente por: Penicillium, Candida,
Cladosporium, Aspergillus, Botrytis,
Alternaria y Fusarium.
Gram positivas:
(Actinomyces, Bacillus, Bordetella,
Lactobacillus, Staphylococcus, Micrococcus
y Streptomyces)
Gram negativas:
(Acitenobacter, Agrobacterium radiobacter,
Erwinia, Klebsiella, Pseudomonas y
Xanthomonas)
 CONTAMINACIÓN
• Problema: La mayoría de los microorganismos
crecen rápidamente en comparación con las células
vegetales, sin embargo existen los m.o. tipo:

Crípticos o subliminales:Son los m.o. que

crecen lentamente, difíciles de detectar y son los
responsables del llamada efecto de halo alrededor
de los explantes.
 DETECCION DE
MICROORGANISMOS CRIPTICOS

Existen dos formas de detección:

• Colocando segmentos de tejido en medios
apropiados para detectar estos m.o y
observando si se presenta su crecimiento.
• Pruebas serológicas
 FUENTES DE CONTAMINACIÓN

1. Instrumental utilizado, cristalería,

medios, etc.
2. El operario.
3. El medio ambiente.
4. Condiciones en que se manipulan los
explantes.
5. El propio explante.
6. …
 MANIPULACIÓN DEL CULTIVO

• Realizar todas las manipulaciones que

impliquen la exposición de los tejidos o del
medio de cultivo en área axénica, siendo lo
ideal trabajar en una campana de flujo
laminar.
• Esterilizar todos los implementos utilizados
para la manipulación de los tejidos antes de
hacer uso de ellos.
 MANIPULACIÓN DEL CULTIVO

• Los frascos o recipientes de cultivo

deben permanecer sellados en un
ambiente libre de polvo y de corrientes
de aire durante el período de incubación.

• Especies que requieren de alto

intercambio gaseoso: Tapados, no
sellados o bien tapas con cubierta de
membrana fina.
 EL EXPLANTE
• Las superficies vegetales:
Albergan un gran número de
microorganismos.
• M.O. Endofíticos:
Están dentro de los tejidos vegetales:
En espacios intercelulares o incluso
dentro de las células.
 ELIMINACIÓN DE
MICROORGANISMOS ENDOFÍTICOS

Existen dos métodos:

• Uso de antibióticos.

• Aislamiento y cultivo de meristemos

combinado con:
– Quimioterapia y/o
– Termoterapia.
 Uso de Antibióticos
Desventajas:
• No es efectivo contra virus y viroides.
• Efecto sobre las células vegetales, sólo
detiene la multiplicación de los M.O.
NO los mata a todos.
• Reanudan su multiplicación al degradarse
el antibiótico o al sub-cultivar en un
medio sin antibiótico.
 Aislamiento y cultivo de meristemos

• Buenos resultados
• Resulta complicado, trabajo muy minucioso.
 ELIMINACIÓN DE MICROORGANISMOS
SUPERFICIALES
• Se realiza básicamente mediante el empleo de compuestos
químicos capaces de eliminar M.O.

• Desventaja: Al matar M.O. también causa daño al tejido

vegetal.

• Sistema Deseable: Matar a la mayoría de los M.O.

causando el menor daño al tejido vegetal.

• Es díficil obtener un 0% de contaminación o un 100% de

asepsia.
 Método general para esterilización
superficial
• Lavado previo del tejido vegetal con agua corriente y un
detergente suave.

• Tratamiento con agente químico desinfectante.

• Enjuague de los tejidos con agua destilada estéril en un

ambiente aséptico.
 Agentes químicos más utilizados para la
desinfección de tejidos vegetales.

Agente Concentración Tiempo (min)

Hipoclorito de Na* 0.5-5% 5-30
Hipoclorito de Ca 8-10% 5-30
Nitrato de plata 1% 5-30
Cloruro de Hg** 0.1-1% 2-10
Etanol 70-96% 0.5-3
Isopropanol 70% 0.5-3
H2O2 3-12% 5-15
Zephiran 0.01-0.1% 5-20
Antibióticos 40-500 mg/l 30-90
 Cloruro de benzalconio
• El cloruro de benzalconio es un desinfectante, bactericida e inhibidor de la
actividad viral. Su fórmula condensada es n-alquil metil bencil cloruro de amonio.
• Es utilizado como sanitizante y desinfectante sin considerar su
propiedad fungicida, específicamente sobre los
géneros Trichophyton, Epidermophyton y Candida, al igual que otros compuestos
de amonio cuaternario, como cloruro de alquildimetilbencilamonio y cloruro
dedidecildimetilamonio.

• Mecanismo de acción: Su acción se ha atribuido a la inactivación de las enzimas

productoras de energía, desnaturalización de las proteínas celulares esenciales y
la ruptura de la membrana celular.

• Toxicología: El cloruro de benzalconio es corrosivo y tóxico según la ficha MSDS

de referencia BE0155 conforme a la directiva 2001/58/CE, así como de una gran
toxicidad en ambientes acuáticos. Pero carece de toxicidad en los casos de
cremas humectantes para piel.

• Principales usos: Contra algas en piscinas, componente principal del

desinfectante para suelos, como fungicida y antibacteriano en algunos productos
Benzal®, antiséptico en higiene dental diluido en baja concentración, aditivo en
algunos colirios.
• ↑ http://www.feriadelasciencias.unam.mx/anteriores/xviiferia/23.pdf
 Ficha técnica de cloruro de benzalconio
• DATOS DE INDENTIFICACIÓN
• Nombre químico (IUPAC): Mezcla de cloruro de alquilbenzildimetilamonio No. CAS: 8001-54-5
• Sinónimos: Cloruro de alquildimetilbenzilamonio; Cloruro de alquildimetil(fenilmetil)amonio cuaternario; Cloruro de alquildimetilbenzil
amonio; Ammonyx; Arquad B 100; Barquat MB-50; Bayclean; Benirol; Bionol; BTC; BTC 824; Capitol; Catamin AB; Catamine AB;
Cequartyl; Desitin Dabaways; Dimanin A; Disinall; Drapolene; Drapolex; Drest; Enchulen; Germicin; Germitol; Osvan; Paralkan;
Romergal CB; Zephiran Chloride

• Para uso Industrial: Polasept 500, 50.000, Líquido Técnico

• Estructura química: Fórmula química: C9H13N-RCl

• Tipo de plaguicida: Fungicida y Bactericida Clasificación: Sal orgánica

• Uso: Industrial
• Presentaciones comerciales: Industrial: Exclusivamente para plantas formuladoras de plaguicidas: como líquido técnico en equivalentes
en gramos de ingrediente activo (I.A./kg o L) de: 485.
• PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS
• Polvo amorfo de color blanco o amarillo, con olor aromático y sabor muy amargo. Su densidad relativa es igual a 0.9884 a 20 °C. Es muy
soluble en agua, alcohol y acetona, pero casi insoluble en éter. En solución acuosa es ligeramente básico. Es incompatible con
detergentes aniónicos y con nitratos.
• PELIGROSIDAD
• Salud (Azul):
• Inflamabilidad (Rojo):
• Riesgo de Explosión (Amarillo):

• TOXICIDAD PARA LOS ORGANISMOS Y EL MEDIO AMBIENTE

• Tipo toxicológico: III
• Es altamente tóxico para el zooplancton y moderadamente tóxico para crustáceos. Su toxicidad varía de moderada a
• alta para peces.
 13 Consideraciones para lograr cultivos
asépticos:
1. Entre más pequeño sea el explante, menor es la
probabilidad de que lleve contaminantes.
2. Sin embargo, por ser por pequeños tienen una
menor probabilidad de sobrevivir y
establecerse, además de que mayor será la
probabilidad de necrosis.
3. Superficie irregular o cubierta de ceras,
vellosidades o tricomas, dificultan la
penetración del agente desinfectante por lo
tanto se recomienda mayor tiempo de
exposición.
4. Pero un mayor tiempo resulta casi siempre
nocivo; por lo tanto se recomienda utilizar vacío
y algún detergente suave (Tween 20).
 Más Consideraciones:
5. La combinación de varios agentes químicos es más efectivo y
menos nocivo que el incremento de tiempo de exposición a
uno solo de ellos. Es conveniente aplicarlos uno después del
otro y no mezclarlos.

6. Los lavados previos del explante pueden resultar tan

importantes como la desinfección misma.

7. Una alternativa a la desinfección de los explantes es la

utilización de cultivos axénicos plántulas asépticas obtenidas
in vitro que sirvan como fuente de tejidos u órganos.

8. Desinfectar semillas para obtener plántulas madre asépticas

donadoras de explantes.
 Desventaja: Cultivos genéticamente heterogéneos.
 Otras consideraciones más…
9. Cuando se tiene fácil acceso a las plantas madres donadoras de
explantes, un pre-tratamiento con fungicidas, bactericidas y
viricidas es útil para reducir la contaminación global.
10. Los explantes susceptibles a la contaminación deben
explantarse-sembrarse con una densidad lo más baja posible,
de preferencia uno por recipiente de cultivo.
11. Trabajar inicialmente con un número grande de explantes por
separado, esperando que aun después de las pérdidas por
contaminación queden suficientes para iniciar el cultivo.
12. Generalmente la contaminación inicial es alta, hasta en un
90%.
13. Muy difícil lograr la asepsia al 100%.
 Causas más frecuentes de contaminación en el
establecimiento y mantenimiento de cultivos in vitro
ETAPA CAUSA DE FORMA DE EVITAR LA
CONTAMINACION CONTAMINACION
Selección de 1.- Presencia de patógenos sobre los 1.- No utilizar plantas con síntomas
tejidos vegetales. fitopatológicos como fuente de explantes.
planta madre 2.- Plantas creciendo en ambientes muy 2.- Pre-tratamiento para sanear las plantas
contaminados. 15-30 días antes de tomas los explantes.

Desinfección 1.- Método de desinfección inadecuado
2.- Falta de penetración del agente
de los desinfectante.
explantes 3.- Baja concentración del agente
desinfectante por ejemplo (cloro activo).
1.- Probar otros métodos y agentes
desinfectantes.
2.- Utilizar vació o detergentes.
3.- Utilizar soluciones nuevas.
4.-No dejar destapadas las soluciones
desinfectantes.

Preparación 1.- Poco tiempo de esterilización, presión 1.- Revisar el autoclave, incrementar el
o temperatura inadecuada. tiempo de esterilización .
del medio de 2.- Almacenamiento inadecuado del medio 2.- Almacenar en un ambiente limpio los
cultivo de cultivo. recipientes con medio de cultivo, cerrados
herméticamente y sellados con plástico.

Sub-Cultivos 1.- Contaminación proveniente del aire.
2.- Instrumentos y accesorios utilizados en
la manipulación del cultivo contaminados.
3.- Cultivos utilizados como fuente de
inóculo con contaminación críptica o
1.- Verificar el funcionamiento de la campana
de flujo laminar.
2.- Flamear frecuentemente pinzas,
espátulas y bisturíes.
3.- Verificar correctamente y
 VITRIFICACIÓN
En algunas especies, los tejidos cultivos in vitro toman un
aspecto vítreo y presentan deformaciones causadas por:

– Problemas fisiológicos, causado por una habituación.

– Son desórdenes anatómicos, morfológicos y fisiológicos causados
por las condiciones en que se realiza el cultivo.
– Este fenómeno se presenta en especies herbáceas y algunas
leñosas.
– Son capaces de prosperar in vitro pero no tienen posibilidad de
adaptarse al medio externo.
 CONDICIONES QUE FAVORECEN LA
VITRIFICACIÓN

1. Exceso de nutrientes.
2. Exceso de carbohidratos.
3. Altos niveles de reguladores de crecimiento.
4. Baja intensidad luminosa.
5. Alta humedad relativa.
6. Alta disponibilidad de agua en el medio.
 CARACTERÍSTICAS DEL TEJIDO VÍTREO

1. Hiperhidratación (Tejidos hiper-hidratados y suculentos).

2. Pérdida aparente del control de las relaciones hídricas del
tejido.
3. Paredes celulares delgadas y poco lignificadas.
4. Grandes espacios intercelulares llenos de agua.
5. Deformaciones de la cutícula.
6. Atrofia de los estomas.
Plántulas vitrificadas
Sub-cultivo aséptico
Plántulas normales
 MEDIDAS PARA EVITAR LA
VITRIFICACIÓN
1. Utilizar altas concentraciones de agar
en el medio (0.8-1.2%)
2. Utilizar Polietilenglicol.
3. Reducir la concentración de
reguladores del crecimiento.
 OXIDACIÓN

1. El tejido vegetal herido, dañado, estresado al ser

disectado excreta compuestos que intervienen en el proceso
de cicatrización y defensa contra los patógenos.

2. Los compuestos fenólicos al contacto con la atmósfera

causan oscurecimiento del tejido.

 Generación de radical como las quinonas las cuales son tóxicas

al tejido cultivado in vitro.
 MEDIDAS PARA EVITAR O REDUCIR LA
OXIDACIÓN

1. Cortar los explantes firmemente en un recipiente con agua abundante

(estéril), cambiándola frecuentemente.

2. No usar navajas sin filo u oxidadas.

3. Añadir compuestos antioxidantes al agua de lavado: ácido cítrico y ácido

ascórbico.

4. Agregar cisteína, ditio-treitol, meta-bisulfito de sodio (Cuidado pueden

resultar tóxicos).

5. Utilizar en el medio de cultivos agentes que adsorban los compuestos

fenólicos excretados como el carbón activado.

6. Utilizar ficol, polivinil-pirro-lidona (PVP), la polivinil-poli-pirrolidona (PVPP);

la PVP y la PVPP (Cuidado Pueden absorber los reguladores de crecimiento).

7. Subcultivar frecuentemente (cada 24-48 horas) hasta que cese la excreción

de sustancias oxidantes.
 Técnicas de cultivo en medio líquido y sólido
• Las técnicas clásicas de micropropagación de plantas requieren un
medio de sustento, el cual les proporcione a las plantas, tejidos o
células en cuestión, los nutrientes, agua, vitaminas y azucares entre
otros, indispensables para mantenerlos con vida y realizar los
procesos morfogénicos (Soltero-Quintana, 2006).

• Generalmente según su consistencia es común dividirlos en dos

grandes grupos:
 cultivos en medios sólido (semisólido dependiendo de la concentración del
agar) y
 cultivos en medios líquidos, donde el explante se encuentra sumergido de
manera parcial (Mroginski y col, 2004).
 Estático
 Agitación
 De acuerdo con George (1993) un medio de cultivo básico está compuesto
por macro y micronutrientes, vitaminas y fuentes de carbono. Las
concentraciones en las cuales están dadas son necesarias para el
desarrollo del explante dependiendo de su genética.
 Principales limitaciones de los medios de
cultivo líquidos estáticos

• Disminución del coeficiente de multiplicación y de la

calidad de las plantas.
1. Hipoxia
2. Hiperhidricidad

• Posibles soluciones
1. Cultivar sobre papel de filtro, bloques de celulosa o esponjas.
2. Sub-cultivos alternos en medios de cultivos con Agar y Gelrite.
3. Técnica de doble capa (Medio de cultivo semisólido y líquido).
4. Agitación constante del cultivo.
5. Ventilación forzada en los frascos de cultivo.
6. Cultivo intermitente SIT, RITA, BIOMINT´S.
 Biorreactores de Inmersión Temporal

• La micropropagación tiene un gran potencial comercial, debido a la velocidad con

la que se realiza la propagación de plantas genéticamente homogéneas, por lo
general de alta calidad, vigorosas y libres de enfermedades (Amhed y col., 2001).
• Si bien muchas de las veces el uso de esta técnica limitada a los cultivos de valor
agregado, debido a los costos asociados con las técnicas convencionales in vitro
(Escalona y col., 2003); porque demoran mucho tiempo y trabajo por lo que
requieren de un gran número de mano de obra.
• Esto sin duda encarece la labor de multiplicación e incrementa los costos de
producción.

• En la actualidad, se favorece el desarrollo de métodos de micropropagación que

utilizan medios líquidos, ya que permiten el escalonamiento de la
micropropagación (Eide y col., 2003). Tal es el caso de los biorreactores de
inmersión temporal (BIT), que constituyen una herramienta eficaz en la
propagación de plantas in vitro (Aragón y col., 2004), pues aumentan su
coeficiente de multiplicación y reafirman la calidad de las mismas.
• Estos medios de cultivo se emplean para propagar masivamente
material vegetal, con la ventaja de que son sistemas
semiautomatizados que permiten reducir los costos de producción
y la manipulación (Etienne y Berthouly, 2002).

• La aplicación de la inmersión temporal, como técnica de

micropropagación, constituye una de las variantes más novedosas
y de gran utilidad en varios cultivos (Escalona y col., 2003).

• La estrategia de adaptación de las plantas a las condiciones de

los biorreactores de inmersión temporal es una combinación de
características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas que
permiten un uso más eficaz de los recursos del medio interno en
el frasco (Aragón y col., 2004).

• El diseño de los pequeños reactores biotecnológicos permite

mantener las plantas en el mismo contenedor, durante períodos
largos de tiempo mediante la renovación del medio de cultivo, lo
que hace factible la automatización del proceso (Portillo y
SantacruzRuvalcaba, 2006).
CALOGÉNESIS
Un ”callo” (también denominado “callus” o ”calli”), se define como:
Una agrupación o masa de células no diferenciadas, amorfas (sin forma).

En las plantas completas las células callosas son aquéllas que se forman
a consecuencia de una herida.
CALGÉNESIS Y FRIABILIDAD
 FRIABILIDAD
Condición callosa deseable y favorable ya que son
tejidos con capacidad de disgregación celular.
 BIOTECNOLOGÍA
La Biotecnología tiene por objeto el uso de seres
vivos o sus partes a favor de un proceso, nace de
la necesidad de crear alternativas más económicas,
viables y ecológicas que las tecnologías actuales.
Es multidisciplinaria, se apoya principalmente en
ciencias como la biología, la genética y la química,
entre una infinidad de otras mas, para solucionar
problemas de la agricultura, medicina, la ecología,
industria, etc., a beneficio del hombre.
INVESTIGACIÓN PARA ENTREGAR

 ¿Qué es el ácido cítrico y el ácido ascórbico?

 ¿Qué es la cisteína, ditio-treitol, meta-bisulfito de sodio?

 ¿Qué es el carbón activado?

 ¿Qué es ficol?

 ¿Qué es la polivinil-pirro-lidona (PVP)?

 ¿Qué es la polivinil-poli-pirrolidona (PVPP)?