Evaluación​ ​de​ ​la​ ​transferencia​ ​de​ ​CO​2​​ ​un​ ​biorreactor​ ​de​ ​fibroblastos

Cristhian​ ​J.​ ​Rondón​ ​(Cód.​ ​25492647)​ ​y​ ​Johan​ ​Blanco​ ​Barrero​ ​(Cód.​ ​25492633)
Universidad​ ​Nacional​ ​de​ ​Colombia

Resumen

Actualmente existen muchos métodos para crear tejido conectivo artificial, uno de ellos es
por medio de reactores en condiciones monitoreadas y controladas. El Grupo investigación
en Ingeniería de Tejidos desarrolló un biorreactor tipo spinner con el fin de crear sustitutos
artificiales de tejido el uso de soportes de colágeno I para producir cultivos de fibroblastos.
Durante los primeros ensayos se presentaron problemas con regulación del ph y la
transpaso de masa entre las fases, por lo cual se prueba un sistema de aireado por
microdispersión de gas para hacer una evaluación con respecto al sistema de aireado
superficial, el cual es uno de los más comunes en estos cultivos. Se llegó a la conclusión de
que a pesar de causar muerte celular, con el cuidado necesario y uso de antiespumantes o
tensoactivo, se logra controlar este problema obteniendo un excelente control sobre el pH y
a​ ​su​ ​vez​ ​sobre​ ​la​ ​ ​transferencia​ ​de​ ​masa​ ​para​ ​mejorar​ ​el​ ​metabolismo​ ​y​ ​crecimiento​ ​celular.

Palabras clave​: Biorreactor; Tejido Conectivo Artificial; Fibroblastos; Colageno; ph;

Microdispersión;​ ​Transferencia​ ​de​ ​Masa,​ ​Metabolismo.

Abstract

Currently there are many methods to create artificial connective tissue, one of them is by
means of reactors under monitored and controlled conditions. The Tissue Engineering
Research Group specializes in the creation of fiber optic devices for the creation of devices
for the production of colony materials for the production of fibroblasts. During the first tests
there were problems with pH regulation and the transparency of the mass between the
phases, so an air system is tested by gas microdispersión to make an evaluation with
respect to the surface air system, which is one of the most common in these crops. It was
concluded that it can be deadly, with the necessary care and the use of antifoams or
surfactants, this problem has been controlled, obtaining excellent control over pH and
frequency​ ​over​ ​mass​ ​transfer​ ​to​ ​improve​ ​metabolism​ ​and​ ​cell​ ​growth.

Keywords​: Bioreactor; Artificial Connective Tissue; Fibroblasts; Collagen; ph;

Microdispersion;​ ​Mass​ ​Transfer,​ ​Metabolism.
El tejido artificial se ha convertido en una alternativa importante en los últimos años cuando
no hay disponible una fuente natural para tratamientos de injerto por pérdida de tejido, como
por ejemplo la piel, el cual es el más común. Los injertos artificiales poseen ventajas con
respecto a los otros tipos de injertos, como el autoinjerto (tejido del individuo), homoinjerto
(tejido de otra persona) y xenoinjerto (tejido que pertenece a otra especie); pues, no
producen un rechazo inmunológico ni infecciones, no tienen una limitación en la cantidad y
no​ ​generan​ ​morbilidad​ ​en​ ​el​ ​sitio​ ​donante.

A pesar de que en el exterior ya existen productos desarrollados a partir de sustitutos

artificiales aprobados por su buen desempeño como injertos, la industria colombiana ha
tenido una incursión muy leve en la producción de tejido artificial. La falta de regulación de
la ley obliga a importar estos productos a unos costos muy elevados, además, de que su
comercialización es problemática; pues, solo algunos pocos pueden ser comprados en los
centros médicos que hacen parte de los productos del fabricante. Por ello, el desarrollo de
estos productos con tecnologías más baratas y a grande escala es el objetivo principal de la
investigación, ya que, no sólo es una necesidad para los Colombianos sino para toda la
humanidad. En trabajos anteriores ya se ha evaluado el rendimiento de injertos artificiales
como sustitutos de piel y tejido conectivo oral, se encontraron resultados positivos
disminuyendo el tiempo de cicatrización y la contractura, por tal razón, los convierte en una
muy​ ​buena​ ​opción​ ​que​ ​promueve​ ​la​ ​regeneración​ ​del​ ​tejido​ ​sin​ ​el​ ​riesgo​ ​al​ ​rechazo​ ​inmune.

El uso de biorreactores dinámicos permite controlar condiciones de crecimiento, mejorando

las propiedades histológicas en los tejidos. esto se debe a un mejor control en el pH y la
transferencia interfacial. El grupo de ingeniería de tejidos desarrolló un biorreactor agitado
para la sintetización de tejido mucoso y de piel; con el objetivo de llevar al procedimiento a
la escala industrial. En estudios anteriores se descubrió que la aireación superficial no
lograba controlar de manera óptima el pH, por ello, para mejorar la difusión de aire y la
transferencia de CO​2 Y O​2 se implementó un sistema de aireación por dispersión el cual
aumentó​ ​el​ ​control​ ​del​ ​ph​ ​del​ ​medio.

Con este artículo se busca difundir los resultados obtenidos durante la investigación, e​ntre
la comparación de dos sistemas de aireación los cuales tienen gran potencial para se​r
utilizados en la escala industrial. Así, en primer lugar, el artículo presenta el método actual
desarrollado por el grupo de investigación, comparándolo con trabajos anteriores del mismo
grupo; para ello, se muestran resultados que evidencian mejorías en el control de las
variables de producción; estos avances en el método de fabricación son descritos
concretamente en el análisis de resultados. Finalmente, se llega a algunas conclusiones
que​ ​darán​ ​cuenta​ ​de​ ​la​ ​innovación​ ​del​ ​método​ ​y​ ​la​ ​viabilidad​ ​de​ ​los​ ​resultados.

METODO

Se realizó el procedimiento para ambos sistemas de aireación (superficial y de

microdispersión de gas); además, se usó una velocidad angular de 60 rpm teniendo en
cuenta resultados anteriores del grupo (Castro, 2009). Para cada sistema se evaluó la
capacidad para regular el pH. Se usó de una solución 4.5 g/L de glucosa y 3.7 g/L de
NaHCO​3 para simular las condiciones del cultivo. Mediante esta solución se determinó los
KLa para la transferencia de O​2 y CO​2​. Se utilizaron dos mezclas de gas: [N​2 (70%) - O​2
(20%)​ ​-​ ​ ​CO​2​​ ​(10%)]​ ​y​ ​[N​2​​ ​(75%)​ ​-​ ​O​2​​ ​(20%)​ ​-​ ​CO​2​​ ​(5%)]

Materiales​ ​e​ ​Instrumentos.

● Células: Se usa fibroblastos aislados y preservados por congelamiento, mediante un

baño térmico (37°C) se descongelan y posteriormente se centrifugan por 10 min.
Con el fin de eliminar trazas, los fibroblastos y el pellet de trabajo fueron lavados en
0.001​ ​L​ ​de​ ​medio​ ​de​ ​cultivo​ ​DMEM.
● Soportes de Colágeno: Se ajusta la concentración a 5 mg/mL, posteriormente, se
congelan moldes a -20°C para luego liofilizar. Se adiciona glutaraldehído al 0.02%,
se​ ​lava​ ​para​ ​eliminar​ ​glutaraldehido​ ​y​ ​se​ ​esteriliza​ ​con​ C
​ ​2​H​4​O​.
● Aislamiento de Colágeno tipo I: Para eliminar tejido muscular y adiposo se lava la
fascia de bovino con etanol al 70%, luego, se sumergen pedazos en acético 0.5 M,
después, se agita por 2 días a 4°C, por último, se filtra la suspensión. Para ajustar el
pH el filtrado se trata con NaOH 5 M, posteriormente, se agita y centrifuga por 10
min. La precipitación se lava por un día con PBS y luego se repite el proceso con
agua​ ​destilada​ ​para​ ​finalmente​ ​disolverlo​ ​en​ ​0.1​ ​M​ ​de​ ​ácido​ ​acético.
● Biorreactor: El biorreactor trabaja en la parte exterior de una incubadora de CO​2​, con
un volumen máximo de 2 L y 24 soportes. Consiste en un cilindro de vidrio con fondo
plano y agitación por aletas modificadas. Cuenta con dos boquillas roscadas
laterales para tomar muestras, inyectar trazadores, drenaje. Para fijar los soportes
de Colágeno cuenta con columnas y bandejas, las columnas se fijan con tuercas a la
tapa, para aumentar la transferencia de mas se construyen las bandejas con una
fracción​ ​de​ ​vacío.
Procedimiento.

A Continuación se muestra el diagrama de flujo donde se presenta el orden estipulado para

el experimento, lo primero que se debe hacer es una caracterización del mezclado, lo
segundo es llenar el biorreactor con agua destilada, para posteriormente agitar e inyectar
azul de metileno para medir la absorbancia, lo siguiente es determinar el tiempo de
mezclado, lo cual se lleva a cabo por medio de dos métodos, el potenciométrico y el visual.
Además de todo esto se lleva a cabo un control del ph en el reactor, para posteriormente
medir la constante volumétrica de transferencia de masa del O​2 y CO​2​, KLa (O​2​), KLa (CO​2​)
respectivamente; antes de medir el ph del cultivo nuevamente se realiza la carga del
reactor, todo esto para finalmente medir la concentración de​C​6​H​12​O​6 y hacer el estudio
histológico.

Figura​ ​1​ ​diagrama​ ​de​ ​bloques​ ​del​ ​procedimiento

Análisis​ ​de​ ​Resultados

1.​ ​Sistema​ ​de​ ​transferencia​ ​de​ ​CO​2

● Caracterización del Mezclado: ​En primer lugar se determinó la (DTR), la gráfica

determinada de las edades de distribución E(θ) (Fig 2), se muestran las curvas de
 los 3 experimentos, cuando el reactor funciona con una aireación de 0.250 vvm y
una velocidad 60 rpm. Por otra parte, se observaron variaciones pequeñas en
algunos de los valores de E(t). Además, se compara con la curva de comportamiento
ideal​ ​(línea​ ​negra),​ ​obteniendo​ ​resultados​ ​similares.

Figura​ ​2.​ ​Gráfica​ ​de​ ​la​ ​DRT​ ​normalizados​ ​en​ ​función​ ​del​ ​tiempo.

Con los valores experimentales de la (figura 2) se obtiene la varianza y el tiempo de

residencia medio, Con estos datos y la función E(θ) se calculó la dispersión y el número de
Peclet. El número de Peclet calculado representa que el valor de dispersión es alto(Tabla
1).

Tabla​ ​1.​ ​Relacion​ ​del​ ​numero​ ​con​ ​la​ ​dispersión​ ​en​ ​el​ ​sistema​ ​(Levenspiel,​ ​2004).

● Tiempo de mezclado: ​Se utilizan los 2 métodos de análisis y se presentan los datos
en la Tabla 2 . También, incluye los resultados encontrados en trabajos anteriores
que también utilizan el mismo sistema de aireación y agitación (barra magnética)
(Castro,​ ​2009).

Tabla​ ​2.​ ​(TM)​ ​Tiempo​ ​de​ ​Mezclado

La Tabla 2 permite comparar los 2 tiempos de residencia para cada uno de los sistemas de
aireación, se observa que para la microdispersión tiene un valor menos de TM . La Figura 3
muestra las imagenes del método visual. El panel A, muestra la microaspersión por gas,
mientras la muestra B corresponde a la evaluación con la aireación superficial. el sistema
trabaja​ ​con​ ​un​ ​agitador​ ​magnético​ ​modificado​ ​con​ ​aletas​ ​suspendió​ ​a​ ​0.05​ ​m​ ​en​ ​el​ ​reactor

Figura​ ​3.​ ​TM​ ​para​ ​ambos​ ​sistemas.

● Reproducibilidad de las variables medidas en el reactor: ​Durante 8 horas se

revisa el pH para 3 sistemas diferentes: (A) Aireación superficial de CO​2 10%, (B)
Microdispersión de aire/CO​2 5% y (C)Microdispersión de aire/CO​2 10%. Se hizo la
gráfica de los pH promedio en función del tiempo, donde se observa que el mismo a
lo​ ​largo​ ​del​ ​biorreactor​ ​(Figura​ ​4).

Figura​ ​4.​ ​Medidas​ ​promedio​ ​de​ ​pH​ ​respecto​ ​al​ ​tiempo​ ​para​ ​ambos​ ​sistemas​ ​de​ ​aireación

2.​ ​Análisis​ ​de​ ​la​ ​regulación​ ​del​ ​pH​ ​en​ ​el​ ​biorreactor​ ​libre​ ​de​ ​células

● Control del pH para la situación de operación de cultivo con células: ​La Figura
5​ ​contiene​ ​9​ ​datos​ ​obtenidos​ ​en​ ​función​ ​del​ ​tiempo,​ ​para​ ​los​ ​sistemas​ ​(A)
Figura​ ​5.​ ​pH​ ​promedio​ ​contra​ ​tiempo.​ ​(A)​ ​(verde),​ ​(B)​ ​(rojo)​ ​y​ ​(C)​ ​(azul).

La Figura 6 gráfica el pH contra tiempo, utilizando el sistema (C). Este sistema fue el que
arrojó los mejores resultados en el análisis del control de pH (Figura 5), por esto, se trabaja
con esa condiciones para esta evaluación. La figura 6 nos muestra los datos de pH a
diferentes​ ​capacidades​ ​de​ ​operación

Figura​ ​6.​ ​pH​ ​respecto​ ​al​ ​tiempo​ ​ ​para​ ​el​ ​sistema.​ ​1.1L​ ​(rojo),​ ​0.9L​ ​(verde),​ ​0.7L​ ​(azul).

● Control del pH: ​En la Figura 7 evaluó la rapidez de estabilizar el pH de ambos

sistemas. Donde el sistema comienza en 8.45 con una solución de 3.7g/L de
NaHCO​3​,​ ​se​ ​mide​ ​la​ ​cantidad​ ​de​ ​tiempo​ ​hasta​ ​que​ ​alcanza​ ​el​ ​valor​ ​de​ ​7.8.

.
Figura 7. Medición del tiempo necesario para estabilizar el pH (7.8) en el sistema.
Microdispersión​ ​(rojo)​ ​y​ ​(azul)​ ​aireación​ ​superficial.
 ● Determinación KLa [O​2 y CO​2​]: ​Para la Figura 8 se hizo la gráfica de ln(1-Cl/Cg) en
función del tiempo(s), donde Cl es la concentración de O2, mientras que, Cga a la
concentración de O​2 en la saturación. El valor KLa es igual a la pendiente de la
recta.

A​ ​ ​

B​ ​

Figura 8. Cálculo de las (kLa). obtenidas a partir de rectas al graficar ln(1-cl/cg) contra. A
muestra​ ​la​ ​aireación​ ​por​ ​microdispersión​ ​y​ ​B​ ​la​ ​aireación​ ​superficial.

Tabla​ ​3.Valores​ ​calculados​ ​de​ ​ ​KLa​ ​ ​para​ ​de​ ​O​2​​ ​y​ ​CO​2

3.​ ​Tiempo​ ​de​ ​respuesta​ ​(τ)​ ​del​ ​oxímetro.

A Continuación se grafica en la Figura 9 nos muestra la concentración de O​2 en solución

con agua destilada en contra del tiempo (s). El tiempo de respuesta (τ)es el tiempo
necesario para saturar con nitrógeno un 63% la concentración. Las mediciones se
realizaron​ ​después​ ​incorporar​ ​el​ ​O​2​​ ​en​ ​el​ ​biorreactor.
Figura​ ​9.​ ​Determinación​ ​de​ ​la​ ​concentración​ ​de​ ​O2​​ en​
​ ​función​ ​tiempo.

4.​​ ​Estudio​ ​de​ ​fibroblastos​ ​con​ ​cada​ ​sistema​ ​de​ ​aireación

● Consumo de glucosa: ​La Figura 10 muestra el cambio de la concentración de

glucosa contra el tiempo para cada uno de los sistemas de aireación. En ambos
casos​ ​es​ ​evidente​ ​la​ ​disminución​ ​de​ ​glucosa.

Figura 10. Medición de la concentración de glucosa en el sistema contra el tiempo. (azul)

Aireación​ ​por​ ​microdispersión​ ​y​ ​(rojo)​ ​aireación​ ​superficial​ ​..

● Control del pH: ​Se muestra las variaciones del pH en una semana en cada sistema
de​ ​aireación,​ ​en​ ​la​ ​Figura​ ​11,​ ​se​ ​observa​ ​que​ ​en​ ​ambos​ ​casos​ ​el​ ​pH​ ​disminuye.

Figura 11. pH del biorreactor contra tiempo. Aireación por microdispersión (azul), aireación
superficial​ ​(rojo).
Concentración de O2: ​A continuación se grafica para cada sistema de aireación la
concentración promedio de O2 durante una semana. Se observa que la concentración de
O2​ ​es​ ​mayor​ ​para​ ​el​ ​sistema​ ​de​ ​microdispersión.

Figura 12. Concentración de O2 en función del tiempo. Sistema de microdispersión (azul),

aireación​ ​superficial​ ​(rojo).

● Análisis de los tejidos obtenidos: Se tomó fotos a cortes histológicos para contar
las​ ​células.​ ​La​ ​Figura​ ​13​ ​presenta​ ​una​ ​correlación​ ​lineal​ ​con​ ​(R^2=0.91).

Figura​ ​13.​ ​Gráfica​ ​del​ ​conteo​ ​de​ ​los​ ​fibroblastos.

Tabla​ ​4.​ ​Conteo​ ​del​ ​número​ ​de​ ​células​ ​en​ ​cada​ ​sistema​ ​de​ ​aireación.

● Evaluación Histológica: ​En la Figura 14 se muestra cortes histológicos teñidos a

diferentes alturas del biorreactor. La parte izquierda corresponde a la aireación por
microdispersión; mientras que, la parte de la derecha representa la aireación
 superficial. se observa que el crecimiento celular es parejo a diferentes alturas y que
es​ ​mucho​ ​mayor​ ​cuando​ ​se​ ​usa​ ​microdispersión.

Figura​ ​14​ ​Evaluación​ ​histológica.​ ​Convenciones:​ ​(C)​ ​Fibras​ ​de​ ​colágeno.​ ​(F)​ ​Fibroblastos.

Se presenta en la Figura 15 muestras de fibroblastos nucleados y de matriz celular, en

diferentes tamaños y partes del biorreactor con microdispersión. También se muestra fibras
que​ ​no​ ​han​ ​sido​ ​degradadas​ ​por​ ​las​ ​proteinasas.

Figura 15 . Cortes histológicos del reactor con microdispersión. Convenciones: Fibras de

colágeno​ ​(C),​ ​matriz​ ​extracelular​ ​(ME),​ ​fibroblastos​ ​(F).

Discusión​ ​y​ ​conclusiones

Para en el trabajo en el biorreactor es necesario supervisar las condiciones del

procedimiento (El cambio en pH, la concentración y la cantidad en la transferencia de CO​2​)
(Siddiqui et al,1996) (Cosmo, Mackenzie y Beck,1961). Los cuales son factores que afectan
directamente el incremento, la estructura y la transcripción genética de la células del cultivo.
En esta investigación se desarrolló con un volumen mayor a comparación de trabajos
anteriores (Arevalo y Díaz, 2005). Durante el proceso se presentaron problemas con el
sistema de aireación original en una regulación buena del pH, el crecimiento celular y la
transferencia de O​2 y CO​2​, por lo cual, fue necesario cambiar a la microdispersión de gas
evaluando​ ​su​ ​desempeño.

Se operó el biorreactor modificado a las mismas condiciones de velocidad de agitación,

bandejas y disposición en las columnas con respecto a investigaciones anteriores los cuales
trabajan con el sistemas de aleacion original. En consecuencia, se evidenció una reducción
en el tiempo de mezclado. Aunque, las curvas de tiempo de residencia (DTR) permanecen
constantes Debido al cambio en el biorreactor se muestra una variación en los tiempos de
mezclado que operan a la misma velocidad de agitación, bandejas y disposición en las
columnas. Otro beneficio fue la disminución de fluctuaciones en las medidas del cultivo ya
que​ ​este​ ​no​ ​genera​ ​volúmenes​ ​muertos​ ​los​ ​espacios​ ​entre​ ​columnas.

Las deficiencias mostradas en el sistemas original de aireación superficial, se deben a que

este tipo de sistema esta enfocados para volumes de cultivos más pequeños. Por
consiguiente, la transferencia de gases es muy baja y la regulación del pH es insuficiente;
por lo tanto, se decide incrementar la concentración de CO​2​. La microdispersión de una
solución de aire a 10% de CO2 en la mezcla con NaHCO3, causó que el pH del sistema se
mantuviera en valores inferiores al equilibro (7.8). Se hizo comparación de los dos sistemas
midiendo la velocidad de bajar el pH de (8.45) hasta (7.8). Obteniéndose un resultado
categórico donde el sistema de microdispersión es 10 más rápido que el sistema superficial.
Además, se demostró que el pH no depende del volumen de carga para el sistema de
microdispersión. Es decir, se puede hacer experimentación para volumes de operación
menores​ ​a​ ​una​ ​escala​ ​de​ ​laboratorio​ ​y​ ​de​ ​esta​ ​manera​ ​ahorrar​ ​costos.

Mediante el coeficiente de transferencia de oxígeno, se demostró que la transferencia

interfacial de los gases más eficiente en el sistema de microdispersión. Dicha transferencia
afecta directamente la oxigenenacion en el biorreactor: Por tanto de puede variar las
condiciones​ ​del​ ​proceso​ ​con​ ​mucha​ ​facilidad,​ ​lo​ ​cual​ ​no​ ​se​ ​puede​ ​en​ ​el​ ​sistema​ ​original.

Al trabajar con el sistema de microdispersión, siempre hay la preocupación que este

sistema puede producir daño y muerte celular (Jianyong y Mattheus,1995),(Alves, Maia y
Vasconcelos,2004),(Chisti,2000). Pero los efectos negativos de pueden ser resueltos con el
uso de tensoactivos y antiespumantes, para este trabajo el daño celular fue mínimo. Este
trabajo es pionero en presentar resultados exitosos en sistemas que usan microdispersión
con gas. El cual podrá ser una alternativa con muchos beneficios en biorreactores agitados
de​ ​gran​ ​volumen​ ​(>1.5​ ​L)​ ​para​ ​la​ ​producción​ ​de​ ​tejido​ ​artificial.

Referencias

Alves SS, C.I. M, Vasconcelos JMT.(2004).Gas-liquid mass transfer coefficient in stirred

tanks interpreted through bubble contamination kinetics. Chemical Engineering and
Processing.43:823-830.

Arevalo P, Díaz JF. (2005). Construcción y puesta en marcha de un biorreactor para el

crecimiento de fibroblastos en mallas de colágeno tipo I. Trabajo de grado en Ingeniería
Química.​ ​Bogotá:​ ​Universidad​ ​Nacional​ ​de​ ​Colombia.

Bello SA, Pereira ER, Fontanilla MR. (2004). Elaboración de tejido conectivo artificial
autólogo de mucosa oral y evaluación de su desempeño como cobertura biológica en
lesiones mucosas inducidas en conejos / Elaboration of artificial autologous connective
tissue of oral mucosa and evaluation of its performance as a biological coverage in induced
mucosal​ ​lesions​ ​in​ ​rabbits​ ​Revista​ ​de​ ​la​ ​Federación​ ​Odontológica​ ​Colombiana.​ ​20:21-41.

Bello SA. (2002).Desarrollo y caracterización de tejido conectivo artificial de mucosa oral.

Bogotá:​ ​Universidad​ ​Nacional​ ​de​ ​Colombia.

Brown D, Jones P, Middleton J: Experimental methods.(2004). Part a: Measuring tools and

techniques for mixing and flow visualization studies. In: Handbook of industrial mixing:
Science and practice Hoboker, NJ: Wiley-Interscience. Edited by Paul EL A-OV, Kresta SM,
editors.​ ​145-202.

Castro LA. (2009). Caracterización del Mezclado de un Biorreactor Tipo Spinner para la
Producción de Fibroblastos Soportados en Mallas de Colágeno Tipo I. BOGOTA D.C. Enero
2009. Trabajo de grado de maestría en ingeniería química. . Bogotá: Universidad Nacional
de​ ​Colombia.

Chisti Y.(2000).Animal-cell damage in sparged bioreactors. Trends Biotechnol.

18(10):420-432.

Cosmo G, Mackenzie JB, Beck P. (1961).The effect of pH on growth, protein synthesis, and
lipid-rich​ ​particles​ ​of​ ​cultured​ ​mammalian​ ​cells.​ ​J​ ​Biophys​ ​Biochem​ ​Cytol.​ ​9:141-156.
CO2/pH CONTROL WITHOUTPROBES IN SHAKEN MAMMALIANCELL CULTURES.
Disponible​ ​en:​ ​[​http://www.biogentek.com/images/cell/shakers1/pdf.pdf​].

Jianyong W, Mattheus FAG. (1995). Evaluation of the killing volume of gas bubbles in
sparged​ ​animal​ ​cell​ ​culture​ ​bioreactors.​ ​Enzyme​ ​and​ ​Microbial​ ​Technology.​ ​17:1036-1042.

Levenspiel O.(2004). Ingeniería de las reacciones químicas. In. Edited by Wiley EL. México.
200-320

Siddiqui A, Galiano RD, Connors D, Gruskin E, Wu L, Mustoe TA. (1996).Differential effects

of oxygen on human dermal fibroblasts: acute versus chronic hypoxia. Wound Repair
Regen.​ ​4(2):211-218.