FUENTES DE ADN FETAL EN SANGRE MATERNA: Material genético fetal puede encontrarse en la

circulación materna en dos formas principales: 1. Células fetales intactas: El análisis del ADN fetal
se intentó inicialmente a través el aislamiento de células fetales intactas en la sangre materna.
Diferentes tipos de células fetales se han encontrado en la sangre periférica materna, incluyendo
trofoblastos, leucocitos y eritroblastos primitivos o glóbulos rojos nucleados (nucleated red blood
cells ”NRBCs”). El enriquecimiento de las células trofoblasticas se vió obstaculizada por la falta de
anticuerpos placentarios específico y el atrapamiento de la mayoría de estas células a nivel
pulmonar. Los leucocitos podían persistir desde embarazos previos (hasta 5 años), lo que
complicaba su evaluación en embarazos posteriores y además carecían de marcadores específicos
para diferenciarlos a los de origen materno. Los eritroblastos primitivo en cambio por su vida
media corta (25 a 35 días) por lo que poco probablemente podrían persistir de embarazos previos,
su morfología celular única y un complemento cromosómico completo (información genetica
global del feto) representan el tipo celular sobre que se ha centrado la investigación en este tema.
[1,2]. Raffaele Carputo/Maria Paz Carrillo Badillo 2 Clases de Residentes año 2014 ADN fetal libre
en sangre materna La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) y la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) han demostrado que los eritroblastos primitivos: están presente en numero muy
limitado (promedio máximo de 6 células fetales/ml en sangre periférica) [3,4] y que la mayoría son
de procedencia materna. Además, la mayoría de estas células sufriendo apoptosis poseen un ADN
inestable y fragmentado que no es adecuado en cuanto tal para el análisis citogenético molecular.
Para superar estas dificultades analíticas era necesario aumentar el numero de estas células con
técnicas de enriquecimiento y posterior aislamiento. El enriquecimiento de los eritroblastos
fetales primitivos se basa en la aplicación de un gradiente de densidad tipo “Ficoll o Percoll”
separándolos de los glóbulos rojos maduros (RBC) y granulocitos [5]. Tanto el metodo Ficoll e
Percoll conllevando pasos de centrifugación y lavado pueden implicar perdida de elementos
celulares. El aislamiento de células fetales se llevó a cabo utilizando anticuerpos monoclonales
marcados con compuestos fluorescentes (“FACS” Fuorescence-activated cell sorting) o magnéticos
(“MACS” Magneticactivated cell sorting) que se dirigen a antígenos específicos de superficie de la
células fetales de interés (selección positiva) o utilizando un proceso de selección negativa, a
células que se quieren posteriormente eliminar. No obstante tanto la FACS que la MACS han
demostrado bajas tasas de recuperación. El primer estudio prospectivo multicéntrico para el
diagnostico prenatal no invasivo de aneuploidias basado en el aislamiento de eritroblastos
primitivos fetales se realizó en el 1994. El estudio que incluía 2.744 gestantes, demostró una tasas
de sensibilidad del 41,1% en la identificación de fetos euploides mientras que la sensibilidad en
caso de aneuploidias era del 74,4%. Las diferencias en las sensibilidades indica que las células
fetales son más abundantes en los embarazos aneuploides y por lo tanto más fácilmente
detectables [6]. En conclusión el NIPD basado en celulas fetales intactas en sangre materna:
aunque fue inicialmente prometedor, el escaso número en la circulación Raffaele Carputo / Maria
Paz Carrillo Badillo 3 Clases de Residentes año 2014 ADN fetal libre en sangre materna materna, la
persistencia desde embarazo previos así como el hecho de que la gran mayoría proceden de los
padres, no ha permitido su implementación exitosa [7]. Es evidente que una vez que se
desarrollará un método altamente sensible para el aislamiento de estas células se dará un paso en
adelante significativo en el diagnostico prenatal no invasivo de aneuploidias. Estas células
conteniendo el genoma fetal completo podrían permitir utilizando técnicas de de alto rendimiento
tales como los microarrays y la secuenciación masiva en paralelo (MPS) el diagnóstico de
cualquiera aneuploidías, así como de otros trastornos genómico. 2. ADN fetal libre de células (cell
free fetal ADN, cff ADN): En comparación, el cff ADN no contenido dentro de las membranas
celulares tiene un gran potencial para su uso en el diagnostico prenatal siendo abundante en la
circulación materna y representativo del embarazo actual. • ¿De donde procede el cff ADN?
Respecto al origen del ADN fetal en la circulación materna, uno de los posibles mecanismos de
liberación es la apoptosis de células fetales intactas por interacción con el sistema inmunitario
materno. La evidencia de secuencias de ADN fetal pocos días después de la implantación y la
elevación de las concentraciones plasmaticas de ADN fetal en sangre periférica de gestantes con
preeclampsia, sugieren un origen placentario, probablemente debido a la apoptosis de las células
trofoblásticas. Los eritroblastos fetales representan la fuente minoritaria de ADN fetal libre dado
el bajo porcentaje de estas células en sangre materna. Por otra parte, se han detectado secuencias
de ADN fetal en otros fluidos, como el líquido amniótico, la orina y el líquidos cefalorraquídeo
maternos, lo que ha llevado a considerar la posibilidad de una transferencia directa de ADN. Es
muy probable que los tres mecanismos coexistan, aportando la placenta la mayor parte del ADN
fetal libre en plasma materno. • ¿Cuando se encuentra el cff ADN en la sangre materna? El cff ADN
puede ser aislado en la sangre materna a partir de la 5ª semana postmenstrual, y siempre a partir
de la 9ª semana desde la fecha de la ultima Raffaele Carputo/Maria Paz Carrillo Badillo 4 Clases de
Residentes año 2014 ADN fetal libre en sangre materna regla. La concentración relativa de cff ADN
aumenta con la edad gestacional siendo este aumento moderado hasta la semana 21 (0,1% por
semana), para luego ser rápido (1% por semana) hasta el término. El cff ADN típicamente
representa el 10-15% total de cf ADN en la circulación materna durante el final de primer y el
principio del segundo trimestre, hasta llegar a un 50% del total de cf ADN circulante en sangre
materna al final de la gestación. La concentración de cff DNA fetal disminuye con el aumento de
peso de la madre pudiendo ser insuficiente para el diagnóstico prenatal en mujeres obesas. Esta
relación inversa se ha atribuido a la dilución de una cantidad relativamente constante de cff DNA
en el plasma materno y a un aumento en la concentración de cf ADN de origen materno a medida
que aumenta el peso de la gestante [8]. El tiempo de depuración materno de cff ADN es
extremadamente rápido; en mujeres embarazadas sanas, la vida media es de aproximadamente
una hora, y esencialmente todo el cff DNA es eliminado dentro de los dos primeros días tras el
parto siendo el aclaramiento renal el mecanismo más probable [9];por lo tanto el cff ADN ofrece
una instantánea en tiempo real del estado genético fetal. EXRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ADN
LIBRE EN SANGRE MATERNA: La muestra de sangre materna es extraída de forma periférica, en
tubos enriquecidos con anticoagulante, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), o bien sin
enriquecimiento del mismo. No existe consenso a la hora de especificar qué volumen de sangre es
necesario extraer. Las cantidades oscilan desde 1,6-4,2 militros. Posteriormente, los métodos
descritos para el procesado de la muestra tienen en común dos procesos de centrifugación
llevados a cabo a 4ºC de temperatura durante 10 minutos. Con este paso se consigue separar el
plasma (sobrenadante que queda en la parte superior del tubo) de los restos celulares
(precipitado). Tras estos pasos el sobrenadante se almacena a una temperatura de congelación
que oscila entre los -80ºC y -30ºC. Una vez obtenido el plasma, es necesario el aislamiento del
ADN. Para llevar a cabo esta tarea existen diversos kits en comercio producidos por distintos
laboratorios (Qiagen, Macherey-Nagel, Roche, Invitrogen). Raffaele Carputo / Maria Paz Carrillo
Badillo 5 Clases de Residentes año 2014 ADN fetal libre en sangre materna METODOS PARA
DIFERENCIAR ENTRE ADN FETAL Y MATERNO: Existen ácidos nucleicos expresados exclusivamente
por el feto, cuya detección en sangre materna permite la selección específica de una parte del
ADN y por tanto un análisis selectivo. Además, su presencia significa que pueden ser usados para
cuantificar la cantidad de cff ADN en sangre materna, independientemente del sexo. Este último
dato es relevante ya que, hasta ahora, no ha sido posible discriminar directamente entre ADN
materno y fetal para la cuantificación de cromosomas, a parte del cromosoma sexual Y presente
exclusivamente en fetos varones. Entre los métodos desarrollados para detectar marcadores
fetales universales, destacan los siguientes métodos de análisis: 1. Detección de secuencias
específicas de ADN en el cromosoma Y: es el método más fiable pero limita el diagnóstico a fetos
de sexo varón. 2. Detección de secuencias específicas de ADN en cromosomas autosómicos: solo
pueden ser útiles para demostrar la herencia paterna de determinadas características del genoma
que no estarían presentes en la circulación materna si la madre no las tiene. Se basan en en
análisis de: • Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP): Son puntos que difieren entre el genoma
paterno y materno sin implicar que se trate de una enfermedad. Específicamente, este enfoque
para aportar informaciones útiles requiere la presencia de al menos un SNP homocigoto en la
madre y heterocigotos en el feto [10]. • Polimorfismo de repeticiones cortas en tándem (STR): Son
segmentos polimórficos que pueden variar entre el genoma paterno y materno. Al amplificarlos,
teniendo en cuenta que el feto tendrá dos diferentes, uno por alelo de herencia paterna y otro por
herencia materna diferentes entre si, se obtendrán dos productos de mayor entidad (los propios
maternos y el heredado por el feto) y uno más pequeño correspondiente a la herencia paterna.
Raffaele Carputo/Maria Paz Carrillo Badillo 6 Clases de Residentes año 2014 ADN fetal libre en
sangre materna 3. Aumento de las concentraciones relativas del cff ADN: una limitación técnica
para aislar cff DNA en sangre materna es que su proporción es de tan solo del 10-15% en el
momento de la realización de la pruebas de cribado. Este porcentaje ha de ser aumentado, ya sea
a expensas del numerador (ADN fetal), o disminuyendo parte del denominador (ADN materno). •
Aumento de [cff ADN]: basado en metodos de enriquecimiento que aprovechan diferencias en
longitud entre el ADN fetal y materno. Se ha demostrado que las moléculas de ADN fetal
circulantes en sangre materna, con una longitud media inferior a 313 pares de bases (pb), son más
cortas que las maternas. Con el utilizo de la electroforesis en gel de agarosa seguido por el análisis
de los segmentos fraccionados con una longitud inferior a 300 pb con PCR en tiempo real se puede
enriquecer el cff DNA de tal manera que pueda llegar a ser el 70% del ADN total de la muestra.
Marcadores microsatélites altamente polimórficos en el cromosoma 21 se han utilizado para
discriminar rasgos genéticos fetales de origen paterno y materno. Sin embargo, este método no se
puede utilizar para el desarrollo de NIPD para aneuploidías ya que laborioso y susceptible a
contaminación de otras fuentes de ácidos nucleicos [11]. • Disminución o supresión de ADN
materno: consiste en la adición de formaldehído al plasma que estabilizando las células maternas
reduce la liberación de ADN. De esta manera, se reduce la presencia de ADN libre materno y
aumenta la cantidad relativa de cff DNA. En un estudio que incluya 60 embarazadas de las cuales 3
con fetos con trisomia 21, se clasificaron correctamente 56 de los 57 casos normales y dos de los
tres casos de trisomía 21. Aunque los resultados iniciales de este enfoque fueron prometedores,
no fueron reproducibles en los distintos grupos de investigación [12]. 4. Modificaciones
epigenéticas: son diferencias somáticas del ADN que no alteran la secuencia genética (secuencia
de nucleotidos) pero que afectan a la expresión génica (mARN, productos proteicos). El análisis de
las Raffaele Carputo / Maria Paz Carrillo Badillo 7 Clases de Residentes año 2014 ADN fetal libre en
sangre materna modificaciones epigeneticas permitiría evidenciar diferencias entre los alelos
maternos propios y los fetales heredados por vía materna. A)Métodos basados en la metilación:
Implica la individuación de patrones de metilación diferencial entre feto y madre (differentially
methylated regions “DMR”) en los nucleótidos citosina, localizados en los denominados islotes
CpG. Si una secuencia genética está hipermetilada, tenderá a no ser expresada (p.e. el segundo
cromosoma X femenino, cuya expresión génica está muy frenada). El fenomeno de la metilación
ha sido estudiado a traves del tratamiento con bisulfito de sodio (NaHSO3). Cuando se trata el
ADN con bisulfito las citosinas de los islotes CpG no metilados se convierten en uracilo mientras
que las metiladas se quedan iguales. En el 2002 Poon y cols. [13] descubrieron un pattern de
metilación diferencial entre feto y madre para el locus “maspin" localizado en el cromosoma 18
que contiene el gen SERPINB5 “inhibidor de la serin protesa 5”. El promotor de este gen no está
metilado en la placenta (feto) pero está hipermetilado en el ADN materno. Aprovechándose de la
reacción con bisulfito, diferencias en la secuencia de nucleotidos entre el ADN fetal y materno
pueden discriminarse mediante espectrometría de masas (MS) o PCR. Como el locus maspin está
en el cromosoma 18, se ha empleado para la detección de la trisomía 18. Se cuantifican 2 alelos, y
se calcula la relación, de modo que una ratio 1:1 será propia de fetos euploides y una ratio 1:2 ó
2:1 significará aneuploidía fetal. A pesar de este enfoque es muy interesante la conversión de la
citosina no metilada a uracilo no siempre es completa y el bisulfito provoca una degradación
parcial del genoma hechos que juntos complican la valoración de cantidades extremadamente
bajas de cff ADN. El metodo más moderno para el estudio de las “DMR” es la inmunoprecipitación
de ADN metilado (MeDIP) que permite el enriquecimiento de regiones fetal específicamente
hipermetiladas utilizando un anticuerpo que se dirige a los residuos de 5-metilcitosina de los
dinucleótidos CG. En un estudio realizado en 2009 para el diagnostico de trisomia 21 que
combinaba MeDIP a PCR en tiempo real se llegó a un diagnóstico correcto para todos los Raffaele
Carputo/Maria Paz Carrillo Badillo 8 Clases de Residentes año 2014 ADN fetal libre en sangre
materna casos normales y anormales, demostrando una sensibilidad y especificidad del 100% [14].
B) Análisis de la ratio alélico/Medición de la dosis cromosomica relativa (DCR): Se basa en la
diferencia existente entre el ratio alélico de un sujeto sano que es 1:1, y el de un feto afectado por
alguna aneuploidía que será 2:1, 1:2. Este método solo es posible utilizarlo si el feto es
heterocigoto para el locus diana. Se basa en este enfoque el estudio de mARN específicos que se
transcriben activamente sólo en el feto. Lo y cols. [13] identificaron con éxito una moléculas de
ARNm llamada PLAC4 (Proteina a codificación especifica placentaria 4) localizada en el cromosoma
21 que se transcribe activamente sólo en el feto pero no en la madre. Para el estudio de PLAC4 se
utilizó un estrategia llamada ARN-SNP utilizando MS. En este enfoque, los SNP informativos
(heterocigotos en el feto y homocigotos en la madre) situados en el mARN PLACA4 son valorados
midiendo la dosis cromosomica relativa (DCR) o sea la relación entre la cantidad de los distintos
alelos del ARNm en la circulación sanguínea materna. El feto lleva un cromosoma 21 de cada
progenitor y, por lo tanto, un feto normal (disomía 21) debe generar cantidades iguales de los dos
alelos. Una proporción de 2:1 o 1:2 sugiere trisomía. Con este enfoque en un estudio realizado en
2007 se identificaron 9 de cada 10 casos de síndrome de Down y se excluyeron 55 de 57 controles
sanos. [15] APLICACIONES DE DIAGNÓSTICO PRENATAL 1. Determinación del sexo fetal:
Determinar el sexo del feto es quizás el uso más directo de esta prueba de diagnostico prenatal no
invasiva. La determinación de la presencia o ausencia de loci (lugares de los genes o secuencias de
ADN en los cromosomas) específicos del cromosoma Y como el gen SRY “sex-determining region”
o la región que codifica la proteína testicular específica ligada al Y “DYS14”, permiten la
determinación del sexo del feto a partir de la 7ª semana Raffaele Carputo / Maria Paz Carrillo
Badillo 9 Clases de Residentes año 2014 ADN fetal libre en sangre materna postmenstrual con una
sensibilidad cercana al 100% a partir de la 10ª semana. La identificación de estas secuencias en la
sangre materna se realiza con PCR convencional o con PCR cuantitativa en tiempo real (RTQ)
obteniendo con la última resultados más fiables [16]: si las secuencias del cromosoma Y están
presentes, el feto es masculino; en su defecto se presume que el feto es de sexo femenino. La
sensibilidad en general aumenta con la edad gestacional: • < 7ª semana post-menstrual
(sensibilidad 74,5%, especificidad 99,1%). • 7ª-12ª semana post-menstrual (sensibilidad 94.8%,
especificidad 98,9%). • 13ª- 20ª semana post-menstrual(sensibilidad 95,5%, especificidad 99,1%).
• > 20ª semana post-menstrual (sensibilidad 99%, especificidad 99,6%). La determinación del sexo
es particularmente útil como primer paso en el diagnóstico prenatal de enfermedades recesivas
ligadas al cromosoma X (p.e. hemofilia, distrofia muscular de Duchenne, hiperplasia, Sindrome del
X frágil, etc). En estos casos, las madres portadoras de la enfermedad saben que si su feto es de
sexo femenino no necesitan someterse a técnicas de diagnostico prenatal invasivas ya que será
portador asintomático de la mutación o completamente libre de esta. Por otro lado, si se
diagnostica la presencia del cromosoma Y, existe una probabilidad del 50% que el feto padezca la
enfermedad siendo en este caso indicada la realización de una tecnica de diagnostico prenatal
invasiva. El conocimiento del sexo fetal además es útil para fetos de familias con riesgo de
desarrollar un hiperplasia suprarrenal congenita (trastorno autosomico recesivo) debido a un
deficit de la 21-0H idroxilasa. La presencia de este deficit enzimatico conlleva un acumulo de
androgenos y un deficit de cortisol y aldosterona. En fetos de sexo femenino el exceso
androgenico produce ambigüedad sexual y posible virilización que puede ser evitada con la
administración en el embarazo de dexametasona. En fetos masculino no es necesaria la
administración de corticoides. Raffaele Carputo/Maria Paz Carrillo Badillo 10 Clases de Residentes
año 2014 ADN fetal libre en sangre materna Una de las principales limitaciones técnicas del test es
la dificultad en establecer un control positivo para demostrar el éxito en el aislamiento del cff ADN
en fetos femeninos. Como el diagnóstico de sexo fetal femenino no es por detección directa, sino
que se infiere ante la ausencia de secuencias específicas del cromosoma Y, un resultado negativo
no se puede diferenciar de una falla en la amplificación del cff ADN. Para solucionar este
problema, se están utilizando simultáneamente secuencias paternas que no están presentes en el
genoma materno, o secuencias de origen placentario que tengan distinto patrón de metilación en
la placenta y en la madre. 2. Tipificación del antígéno RH: La determinación del Rh fetal constituye
la primera aplicación rutinaria de este tipo de diagnóstico prenatal no invasivo. El servicio nacional
de sangre británico (British National Blood Service) realiza esta determinación desde 2001. La
enfermedad hemolítica feto-neonatal es un patología que puede provocar secuelas en el feto,
como anemia, hidropsia, muerte fetal intrautero y necesidad de parto prematuro. Está provocada
por anticuerpos anti-D de madres Rh negativas (RhD-) que atraviesan la placenta y se unen a los
eritrocitos de fetos Rh positivos (RhD+) destruyéndolos y provocando anemia. Desde la
introducción de la profilaxis preventiva el riesgo de isoinmunización anti-RhD se ha reducido
considerablemente, disminuyendo de un 5% al 0,16%, no obstante se ha estimado que el 40% de
las mujeres caucásicas RhD negativo con pareja RhD positivas heterocigotas recibe una
administración antenatal innecesaria de inmunoglobulina anti-D, ya que son portadoras de fetos
RhD negativos. La determinación del genotipo RhD fetal en embarazadas RhD negativo
sensibilizadas en embarazo anteriores incluye procedimientos invasivos tales como amniocentesis
y análisis de vellosidades coriónicas siendo incorporadas a este grupo, pacientes cuyos fetos son
RhD negativo. Este abordaje implica riesgos para el embarazo (0,5-1%) y puede aumentar la
sensibilización, como resultado de hemorragias materno-fetales (1-2%). Raffaele Carputo / Maria
Paz Carrillo Badillo 11 Clases de Residentes año 2014 ADN fetal libre en sangre materna Por lo
tanto la posibilidad de un diagnóstico prenatal no invasivo para el gen RHD haría posible restringir
la profilaxis antenatal sólo a aquellas mujeres con riesgo de inmunización. Las ventajas de este tipo
de enfoque incluyen: • Evitar un tratamiento innecesario en gestantes no sensibilizadas. En
gestantes ya sensibilizadas en caso de nuevo embarazo evitaría la realización de técnicas invasivas
para descartar la incompatibilidad maternofetal [17]. • El coste del análisis del ADN fetal
empleando tecnología automatizada es inferior a un tercio del coste de la terapia con
inmunoglobulinas (aproximadamente 30 euro para cada dosis). Este procedimiento tiene
actualmente amplia utilización clínica tanto en Estados Unidos como en Europa (Reino Unido,
Francia y Holanda), con cifras de sensibilidad y especificidad entre el 95 y el 100%, habiéndose
extendido también la técnica al primer trimestre. Sin embargo, aún no se ha dado el paso para
sustituir la administración sistemática de gammaglobulina en el embarazo por esta determinación
a todas las gestantes, aunque la prueba ha demostrado gran fiabilidad clínica. 3. Diagnostico de
aneuploidías autosómicas El diagnostico prenatal no invasivo de aneuploidías usando cff ADN en
sangre materna se puso a disposición para su uso clínico en 2011. Los niveles globales de cff ADN
en la circulación materna se incrementan en la trisomía 13 y 21 pero no en la trisomía 18. El reto
en la detección de aneuploidías fetales es identificar una copia adicional (o la falta) del cromosoma
fetal en estudio en la sangre materna donde pero el cff ADN constituye sólo una pequeña fracción
del total cf ADN. Importantes pasos en adelante en la identificación de las aneuploidias se ha
alcanzado con la implantación de técnicas de secuenciación de ultima generación como la
secuenciación masiva en paralelo (MPS). Esta tecnica Raffaele Carputo/Maria Paz Carrillo Badillo
12 Clases de Residentes año 2014 ADN fetal libre en sangre materna permite secuenciar cortos
segmentos de cf ADN materno y fetal asignandolos a cada cromosoma. La “dosis especifica” de
ADN perteneciente a un determinado cromosoma son entonces comparados con los valores de
controles normales. A pesar de los avances tecnológicos la tecnica requiere el analisis de
aproximadamente 25 millones de fragmentos de ADN limitando este factor su uso en la practica
clinica por su coste. Algunos investigadores [18] proponen, que si se realiza el análisis selectivo del
ADN libre de los cromosomas 21 y 18, con el análisis digital de regiones seleccionadas (DANSR), se
puede mejorar la eficiencia, el costo de secuenciación, y el rendimiento de MPS. En el método
DANSR, oligonucleótidos complementarios se unen a secuencias de ADN libre específicas de los
cromosomas que se quieren evaluar. Los oligonucleótidos hibridizados son amplificados usando
primers de PCR universales, y los productos de la reacción de PCR son secuenciados. El nivel de
secuenciación que se requiere en este método selectivo es menor al 5 % del que se requiere en la
secuenciación del genoma completo. La desventaja de esta secuenciación selectiva es que no
detecta otras anomalías que no sean la trisomía 13, 18 y 21 [19]. Una serie de estudios se han
publicado para analizar la capacidad diagnostica de cff ADN en sangre materna que utilizaban
técnicas de secuenciamento de ultima generación (MPSS, DANSR) para el diagnostico de
aneuploidia para en poblaciones de alto riesgo (Tabla 1) [20]. En todos ellos se establece que ya
desde las 10ª semanas de gestación se puede detectar con fiabilidad la trisomía 21 en embarazos
únicos en poblaciones de alto riesgo (sensibilidad del 99%-100%, con tasas de falsos positivos por
debajo del 1%). Las trisomía 18 y 13 también se pueden detectar pero con menor exactitud
(sensibilidad 92%-100% y 80%-100%, respectivamente). Recientemente se ha demostrado que
estos test pueden realizarse en gestaciones únicas de bajo riesgo, también con altos niveles de
sensibilidad y especificidad [20]