Análisis Autorradiográfico en Matrices Biológicas

Gabriel Segovia
gabrielsegoviauba@hotmail.com

Resumen
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1. Introducción A esta región se le denomina ’traza latente’, posee un diá-

1.1. Autorradiografía
Dada una muestra que contiene un elemento emisor de
partículas pesadas, se puede determinar la localización
del mismo mediante técnicas autorradiográficas. Una au-
torradiografía es una imagen obtenida sobre un material
sensible en contacto con una muestra que contiene un ele-
mento emisor de radiación, y éste por acción de la radia-
ción imprime la superficie sensible revelando su distribu-
ción en la muestra [1]. Dicho material sensible consiste en
un detector de trazas nucleares (Nuclear Track Detector,
NTD); su naturaleza puede ser tanto de origen inorgá-
nico como orgánico. Sin embargo, se ha demostrado que
los detectores poliméricos presentan mayor sensibilidad,
por lo que son los más utilizados.
Al inicidir una partícula en el detector, ésta transfiere su
energía a los electrones y núcleos del material; y comien-
za a frenarse produciendo ionizaciones y excitaciones de
las moléculas del medio. (fase física, ∼ 10−13 s).
Seguidamente se crean nuevas especies químicas por la
interacción de moléculas dañadas entre sí y con zonas no
alteradas diréctamente (fase fisico-química) [2].
metro reducido (<50 A) y alta energía libre por lo que
es químicamente reactiva.
En algunos casos, este daño puede observarse directa-
mente por Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM),
aunque es más conveniente amplificarlo a nivel de Micros-
copía Óptica. Para esto el derector es sometido a un ’re-
velado’ (etching), mediante agentes químicos; el etching
consiste en la remoción del material dañado a lo largo de
la trayectoria de la particula, a una velocidad de ataque
preferencial (’velocidad de traza’, Vt) mayor que la ve-
locidad con la que se remueve la superficie no alterada
del detector (’velocidad de bulk ’, Vb). El incremento de
Vt es lo que produce la aparicion de ’canales’ o trazas
observables a nivel de Microscopía Óptica.
El desarrollo de la traza está gobernado por la relación
V = V t/V b y su visualización sólo es posible si V > 1. Vb
es característica del material, y para unas dadas condicio-
nes de ataque químico, es constante [2]. En particular, la
velocidad de ataque químico depende de la temperatura
(T) según la ecuación de Arrhenius:
B
Vb = Ae− T (1)
Mientras que Vt no es constante a lo largo de la trayecto-
ria, sino que varía según la cantidad de daño en la región
central. En la Figura 3 se esquematiza la geometría de
una traza con incidencia normal (forma cónica).
A partir de la Teoría Cinética de Trazas [3] se puede ob-
tener una expresión que relaciona el diámetro de la traza
con el espesor de la capa de detector (bulk) disuelta du-
rante el etching.

Figura 1: Representación de la trayectoria y formación de

una traza

El resultado del proceso es la formación de una zona de

daño a lo largo de la trayectoria, como se muestra en la
Figura 1, y con una intensidad decreciente desde el eje
de incidencia del proyectil hasta la región del material no
expuesto (’bulk’).
Figura 3: Geometría del proceso de etching

1
 10
Figura 2: Esquema de la reacción de captura neutrónica B(n, α)7 Li

La forma de la traza dependerá tanto de los parámetros 1.2. Terapia por Captura Neutrónica de
característicos de la partícula incidente, como del detec- Boro
tor y los procedimientos realizados al mismo.
La Terapia por Captura Neutrónica de Boro es una apli-
Para detectores poliméricos, las soluciones de ataque quí- cación de la tecnología nuclear al área biomédica, diseña-
mico deben romper las cadenas poliméricas de las regio- da para entregar selectivamente radiación de partículas
nes dañadas y remover dicho material en forma preferen- pesadas cargadas de alto LET producidas en una reac-
cial. Se suelen utilizar soluciones alcalinas como NaOH ción nuclear, en los tumores tratados [4].
y KOH, donde los grupos oxhidrilos OH − producen la
hidrólisis de las uniones éster de los carbonatos en el po- La técnica se basa en la elevada sección eficaz de 10cap-
límero. tura neutrónica, σ c , que posee el isótopo natural B.
Este núcleo interactúa con neutrones térmicos o lentos
Otra característica importante de estos detectores es su (En <0.05 eV) desencadenando una reacción de captura
umbral de detección; éste depende tanto del material de- que da lugar a dos posibles canales de salida:
tector como del ión, para unas condiciones experimenta- 10
B+n → 11
B ∗ →7 Li∗ + α + 2.31MeV (93.7 %) (3)
les determinadas [3]. La eficacia del etching (fracción de
trazas que intersectan una dada superficie y son revela- 10
B+n→ 11
B ∗ →7 Li + α + 2.79 MeV (6.3 %) (4)
das) depende escencialmente del ángulo de incidencia de
∗
la partícula en la superficie del detector. Para ángulos Cuando se desintegra el B las dos partículas (α y 7 Li)
11

mayores que el ángulo crítico (θC ) no se espera observar son emitidas en direcciones opuestas. En el caso de la
ninguna traza. emisión del 7 Li∗ este regresa a su estado fundamental a
    través de la emisión de un rayo γ.
1 Vb
θC = arsen = arsen (2)
V Vt Estas partículas emitidas tienen una trayectoria definida,
Con este criterio se pueden seleccionar detectores de acuer- independiente del espesor de la muestra.
do a las partículas que se quisiesen percibir y aquellas
interferencias que se deseen evitar. Ambas partículas poseen un alto LET (transferencia li-
neal de energía) y un rango muy corto (∼ 13 µm totales)
Los NTD presentan ventajas en comparación con otros del orden de las dimensiones celulares, apróximadamente
detectores, por el hecho de que los fragmentos de fisión a partir de la posición que se encontraba el 10 B.
10
puedan registrarse en un campo mixto de radiación de Si la posición original del átomo de B corresponde 7
a
partículas livianas no deseado, neutrones y rayos gam- una región del tejido tumoral, las partículas α y Li sólo
ma. Esto los vuelve muy útiles y han sido ampliamente dañarán la/s célula/s en un entorno reducido. Teórica-
utilizados con diferentes fines, siendo el más habitual la mente, una sóla reacción 10
es suficiente para destruir una
detección de radón, a través de la medición de las partí- célula que ha captado B.
culas alfa emitidas por diferentes isótopos del mismo (Ni-
kezic and Yu, 2004). También se han utilizado para el es- La estrategia terapéutica de BNCT consiste en adminis-
tudio de rayos cósmicos y experimentos de física nuclear, trar compuestos borados que sean incorporados selecti-
dosimetría personal de neutrones, concentración y distri- vamente en las células tumorales, tal que el contenido de
bución de una gran cantidad de elementos (siempre que boro en las células normales y en la sangre sea menor
emitan partículas pesadas), acumulación de compuestos que en el tumor. De esta manera, al irradiar posterior-
en organismos, caracterización de haces de partículas, en- mente con neutrones, las reacciones de captura que ocu-
tre otros campos [1]. rren entre los neutrones térmicos y los átomos de 10 B
se producirán mayormente en las células tumorales. Esta
Particularmente la autorradiografía puede hacer uso de modalidad terapéutica permitiría dañar los tejidos tu-
estas características de los NTD’s y emplearse para de- morales sin producir daño significativo al tejido normal,
terminar la distribución local de 10 B en muestras biológi- e incluso eliminar las células infiltrantes en el tejido sano.
cas provenientes de protocolos de BNCT (Boron Neutron
Capture Therapy).

2
El pequeño tamaño del átomo de Boro permite su ubi- En la Figura 4 se muestran las estructuras de los com-
cación en reemplazo del Carbono en muchas estructuras puestos de interés mencionados y utilizados durante esta
orgánicas, permitiendo que las mismas actúen biológica- práctica.
mente, simulando los compuestos de los que derivan. De esta manera, el efecto final del tratamiento BNCT
De esta manera pueden sintetizarse muchos compuestos depende fuertemente de la concentracion de boro en el
borados, pero sólo son de utilidad los que cumplen con tumor, relativa al tejido circundante; por lo que es nece-
los siguientes requerimientos: sario el mapeo cuantitatico de los agentes borados admi-
nistrados al paciente. El conocimiento de la distribución
• Alta relación tumor:tejido sano (T:N) y de 10 B e estructuras tumorales, tejido circundante y ór-
tumor:sangre (T:B) ganos representativos, como riñón o hígado, tiene una
• Concentración absoluta de boro en tumor de 20-35 ppm importancia superlativa al planificar el tratamiento.
• Estabilidad química
El análisis de las muestras biológicas se basa en la cuan-
Los primeros compuestos borados utilizados para aplicar tificación de los elementos que intervienen en la reacción
BNCT a pacientes con tumores cerebrales fueron boratos de captura; tanto el 10 B como las partículas α, 7 Li y
de sodio y Ácido Bórico, así como sus derivados. Estos rayos γ (94 %), son utilizados por las diferentes técnicas
compuestos son altamente difusivos y no son retenidos de medición. Entre las posibles:
en el tumor en forma diferencial con respecto al tejido
sano, por lo que se llegó al fracaso en estos intentos [5]. Análisis por Activación Neutrónica de radiación
Gamma Instantáneo (PGNAA): aplicada a BNCT
A lo largo de los años otros compuestos borados se han se basa en el estudio espectroscópico de los γ emitidos
desarrollado, entre ellos: en la reacción de captura donde el 7 Li queda en un es-
tado excitado y decae emitiendo estos rayos de 478 keV;
Aminoácidos con boro: El ideal de estos compuestos a través de la intensidad del γ detectado se obtiene una
surge de que las células tumorales tienen mayor capa- correlación con la concentración de 10 B [8].
cidad proliferativa, y por lo tanto mayor necesidad de
sintetizar proteínas y péptidos. De esta manera, los ami- Espectrometría por plasma acomplado inductiva-
noácidos que sean captados por las células quedarían re- mente, tanto de Emisión Óptica como de Masas (ICP-
tenidos en las matrices celulares de las mismas. De este OES e ICP-MS) son técnicas multielementales de alta
tipo de compuestos, el más estudiado y utilizado es la sensibilidad. En ambos se utiliza el plasma como medio
borofenilalanina (BPA), un derivado del aminoácido fe- de atomización de la muestra, produciendo átomos exci-
nilalanina, precursor de la síntesis de melanina, por lo que tados que emiten radiación al volver al estado fundamen-
es captado en mayor proporción por las células tumora- tal con una longitud de onda característica del elemento
les donde esta síntesis se ve considerablemente aumenta- cuya intensidad es proporcional a la concentración del
da [6]. Además posee la capacidad de llevar cantidades elemento emisor. El ICP-MS en particular, logra discri-
abolutas significativas de 10 B al tumor con una buena minar los isótopos determinando las concentraciones de
10
relación tumor/tejido sano y tumor/sangre. B y 11 B directamente [9].

Boranos pilédricos: Estos compuestos están formados
por clústers de boro, por lo que contienen una mayor
cantidad de boro por molécula. El más conocido es el de-
cahidrodecaborato de sodio (Na2 10 B10 H10 , GB-10), una
sal de sodio con el anión closo-B10 H2−
10 ; de alta esta-
bilidad, soluble en agua y con muy baja toxicidad. Es
un compuesto difusivo que no atraviesa la barrera he-
matoencefálica (BHE), por lo que fue propuesto para el
tratamiento de tumores de cerebro, asumiendo una incor-
poración preferencial a tumor debido a que los tumores
de cerebro estan rodeados de una BHE defectuosa que
permite la incorporación de GB-10. Actualmente se suele
utilizar en combinación con BPA en distintos protocolos
[7].
Espectrometría Alfa: se utiliza para la determinación
de la concentración media de 10 B basándose en el es-
pectro de las partículas alfa emitidas en la reacción de
captura, estudiado con un multicanal [10].
Estas son técnicas que determinan concentración en for-
ma global. Dado que esta varía en cada tipo de tejido
debido a las diferencias metabólicas, su valor medio so-
bre toda la muestra puede diferir con respecto al tejido
necrótico o al normal, dependiendo del porcentaje de cé-
lulas tumorales. Para evaluar la absorción de compuestos
borados en el tejido es necesario determinar no sólo la
concentración global de Boro sino su distribución espa-
cial e incluso su concentración local.

La arquitectura de un tumor sólido es muy diferente a la

de uno sano: con una vasculatura caótica, grandes vasos,
elevado metabolismo, etc [11]. Por lo que el estudio de
la distribución del compuesto borado a una escala semi-
microscópica es esencial para comprender la probabilidad
del control tumoral en BNCT.

Figura 4: Estructura de distintos compuestos borados

3
La Autorradiografía Neutrónica puede proveer datos esen- Referencias
ciales, sobre la captación del compuesto y su distribución
espacial en el ambiente tumoral. Determinando de esta [1] Portu, A., 2012. Autorradiografía Neutrónica para
manera la concentración local de 10 B, donde las partí- determinar la distribución Espacil de B-10 - Tesis
culas que potencialmente generarían trazas son los pro- Doctoral.
ductos de la reacaciónd e captura, las partículas α y los
[2] Enge, W., 1995. On the question of nuclear track for-
iones de 7 Li.
mation in plastic material. Rad. Meas. 25(1-4):11-26.
Al revelar el detector pueden contarse las trazas en for- [3] Somogyi, G., Grabisch, K., Scherzer, R., Enge, W.,
ma directa, la comparación entre imágenes histológicas 1976. Revision of the concept ofregistration threshold
y autorradiográficas permite una ubicación localizada de in plastic track detectors. Nucl. Instrum. Methods
los átomos de boro en la muestra de tejido. La concen- 134:129-141.
tracion de 10 B en las diferentes regiones de un corte de
tejido puede iferirse midiendo la densidad de trazas en el [4] Pozzi, E., 2016. Estudios radiobiológicos de la Tera-
detector. La expresión analítica que relacion al densidad pia por Captura Neutrónica en Boro (BNCT) para el
de trazas y la concentración de boro en la muestra es tratamiento de cáncer bucal y metástasis hepáticas a
[12]: nivel experimental - Tesis Doctoral.
[5] Soloway, A.H., Wright, R.L., Messer, J.R., 1961. Eva-
Nv σ B φ luation of boron compounds for use in neutron captu-
ρ = C(B) (Rα cos2 θα + RLi cos2 θLi ) (5)
4 re therapy of brain tumors. I. Animal investigations.
J. Pharmacol. Exp. Ther. 134:117-22.
Donde C(B) es la concentración de los átomos de Boro,
Nv la densidad atómica volumétrica, σB sección eficaz [6] Soloway, A.H., Tjarks, W., Barnum, B.A., Rong, F.,
de captura neutrónica y φ la fluencia de neutrones tér- Barth, R.F., Codogni, I.M, Wilson, G., 1998. The
micos. Rα y RLi los alcances o rango de las partículas α Chemistry of Neutron Capture Therapy. Chem. Rev.
y fragmentos de Li y θα y θLi los ángulos críticos respec- 98:1515-1562.
tivamente.
[7] Trivillin, V., Heber, E., Nigg, D., Itoiz, M., Calzetta,
Alternativamente, otra aproximación para determinar la O., Blaumann, H., Longhino, J., Schwint, A., 2006.
10
concentración de B en una dada muestra es la utiliza- Therapeutic success of boron neutron capture the-
ción de algún material de referencia que tengan una can- rapy (BNCT)
tidad conocida de 10 B. El material standard, con con- [8] Fairchild, R.G., Gabel, D., Laster, B.H., Green-
centración Cs , producirá una densidad de tracas ρs en berg, D., Kiszenick, W., Micca, PL., 1985. Micro-
el área del detector en contacto con él, mientras que una analytical techniques for boron analysis using the
densidad ρu será medida en el área del detector adyacente 10B(n,alpha)7Li reaction. Med. Phys. 13(1):50–6.
a la muestra bajo investigación. Cumpliendo la relación:
[9] Laakso, J., Kulvik, M., Ruokonen, I., Vähätalo, J.,
ρu ρu
= (6) Zilliacus, R., Färkkilä, M., Kallio, M., 2001. Ato-
ρs ρs mic Emission Method for Total Boron in Blood
En esta práctica se llevó a cabo el recorrido a través during Neutron- Capture Therapy. Clinical Chem.
de la técnica sobre muestras provenientes de protocolos 47(10):1796-1803.
BNCT, tanto en autorradiografía convencional como no
convencional. Se estudiaron algunos de los compuestos [10] Roveda, L., Prati, U., Bakeine, J. 2004. How to
mencionados, incorporados en modelos animales así como study Boron Biodistribution in Liver Metastases from
también en cultivos celulares. Colorectal Cancer. J. Chemotherapy 16(5):15-18.

[11] Munn, L.L., 2003. Aberrant vascular architecture in

tumors and its importance in drug-based therapies.
Drug Discov. Today 8(18):827-828.
[12] Fleischer, R.L., Price, P., Walker, R.M., 1975. Nu-
clear Tracks in Solids. University of California Press,
Berkeley.