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1534887501.fluorescencia para 2011 PDF
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Introducción
La luz puede ser absorbida y emitida por ciertos compuestos y a este proceso se lo
denomina luminiscencia. Existen dos tipos de luminiscencia: la fluorescencia y la
fosforescencia. En la fluorescencia el tiempo entre la absorción y emisión de la luz es del orden
de 10-8 segundos, mientras que el proceso de fosforescencia es mucho más lento y toma
alrededor de 10-3 a 1 segundo en ocurrir. Así, la fluorescencia dura únicamente mientras dura el
estímulo, es un fenómeno virtualmente instantáneo, mientras que la fosforescencia puede durar
hasta minutos luego de desaparecido el estímulo.
Fluoróforos
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lantánidos, por ejemplo europio o terbio, cuya fluorescencia resulta de la transnición electrónica
entre orbitales ƒ.
Los fluoróforos se pueden dividir en dos clases generales: extrínsecos e intrínsecos. Se
denomina fluoróforo intrínseco a aquel que por si mismo presenta fluorescencia. Por ejemplo el
grupo indol del triptofano en las proteínas. Fluoróforo extrínseco es aquel que se agrega a una
muestra que no presenta fluorescencia. Por ejemplo el 1,6-difenil- 1,3,5 hexatrieno (DPH) que se
utiliza para medir fluidez de membranas, las cuales no presentan fluorescencia.
Fundamento
Cuando el fluoróforo absorbe luz uno de sus electrones pasa a un estado excitado (de
mayor energía) que es inestable y al retornar a su estado basal, el exceso de energía se libera en
forma de luz pero de una longitud de onda mayor (menor energía) a la de excitación. Este
proceso es representado por el diagrama de Perrin-Jablonski (Figura 1).
Decaimiento
vibracional
Cruce
intersistema
Ac Decaimiento
ti vibracional
tér vaci
mi ó n
ca
ia
nc
ce
ón
ia
s
ci
nc
re
ta
ce S0 + hνexc → S1 Excitación
uo
ci
s
ore
Ex
Fl
sf
Fo S1 → S0 + hνem Fluorescencia
S1 → T1 Cruce intersistema
T1→ S0 + hνem´ Fosforescencia
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A = ε . l. c
donde A es la absorbancia, l es el paso óptico y c la concentración del fluoróforo.
En fosforescencia el electrón excitado sufre una transición a un estado más estable (T1), y
la emisión con energía hνem´ resulta mantenida por un tiempo prolongado. En fluorescencia el
estado excitado dura un tiempo finito, normalmente entre 10-9 a 10-8 segundos. En este tiempo el
fluoróforo sufre cambios conformacionales y esta sujeto a múltiples interacciones con el medio
ambiente molecular. Estos procesos tienen dos consecuencias importantes (Figura 1): 1) debido a
la energía que se disipa durante el tiempo de vida del estado excitado, el fotón de energía emitido
hνem, es de menor energía que el fotón que el fluoróforo absorbió previamente, por lo tanto la
longitud de onda de emisión es mayor que la de excitación; 2) no todas las moléculas que se
excitaron inicialmente por absorción retornan al estado basal de energía por emisión de
fluorescencia. Otros procesos como por ejemplo: “quenching” colisional, transferencia de
energía de fluorescencia por resonancia (RET), conversión interna o desactivación no radiativa y
formación de un fotoproducto pueden disminuir la cantidad de moléculas en el estado excitado y
por lo tanto disminuyen el rendimiento cuántico de fluorescencia (Figura 2).
El rendimiento cuántico de fluorescencia, ΦF es la razón entre la cantidad de fotones
emitidos y la cantidad de fotones absorbidos por una molécula:
10-8 segundos
Estado
Estado
excitado*
basal
Quenching o transferencia
de energía de fluorescencia
por resonancia
Figura 2: Esquema del paso al estado excitado y de los posibles procesos de disipación de energía
Espectro de fluorescencia
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espectros de excitación y emisión de fluorescencia es que para algunas moléculas estos son
imágenes especulares uno del otro, a esto se llama “regla del espejo” (Figura 3). Alteraciones de
esta regla se pueden deber a impurezas fluorescentes de la muestra o, en muestras muy diluidas,
a una banda “Raman” que es la banda de vibración del agua. Además existen muchas sustancias
que no siguen esta regla (Figura 4) y esto se debe a una diferencia de arreglos geométricos del
núcleo en el estado excitado si se compara con el estado basal.
Intensidad de fluorescencia
Intensidad de fluorescencia
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El espectro de emisión de fluorescencia varía marcadamente con la estructura química
del fluoróforo y del solvente en el que esta disuelto.
Intensidad de fluorescencia
Quenching
El “quenching” o atenuación de fluorescencia puede ser definido como cualquier proceso
que disminuye la intensidad de fluorescencia de un determinado fluoróforo sin cambiar el
espectro de emisión. Puede ser el resultado de interacciones del estado excitado con otras
moléculas, por ejemplo el solvente (quenching colisional) o por la formación de complejos del
estado basal no fluorescentes. El auto quenching (self-quenching) es la disminución de la
fluorescencia debida a la alta concentración del fluoróforo, el cual al disminuir su concentración
aumenta la fluorescencia, por ejemplo: calceina o carboxifluoresceina, los cuales se los emplea
para medir perdida de contenido de liposomas o de organelas. Cuando el fluoróforo se ha
incorporado en el interior de vesículas en altas concentraciones, no fluoresce, pero si por alguna
razón, se altera la permeabilidad de la membrana, sale al medio, se diluye y fluoresce.
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Fuente luminosa
Longitud de onda
de exitacion del
donante
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la proteeína, ya que normalmente está en un número mayor. La fluorescencia de la tirosina puede
ser fácilmente transferida si se encuentra cerca del triptófano.
La fenilalanina, con sólo un anillo bencénico y un grupo de metileno es débilmente
fluorescente. La sensibilidad experimental (el producto de rendimiento cuántico y absortividad
molar) es especialmente baja para este residuo. La fluorescencia de la fenilalanina se observa
sólo en ausencia de tirosina y triptófano.
Los espectros de fluorescencia y el rendimiento cuántico son generalmente más
dependientes del medio ambiente que los espectros de absorción y los coeficientes de extinción
molar. En las proteínas los residuos de Trp se encuentran generalmente formando parte del
núcleo hidrofóbico de las mismas y por lo tanto está en regiones donde las moléculas de agua
tienen poco acceso, el espectro de emisión del mismo, se corre hacia el ultravioleta (corrimiento
hacia el azul) con el máximo de emisión generalmente en 330 nm. Esto se debe a que la energía
emitida es mayor que cuando la cadena lateral se encuentra en contacto con el solvente, donde
parte de la energía absorbida es transferida a las moléculas de agua y por lo tanto la longitud de
onda del máximo de emisión es mayor (340-350). Esto también sucede cuando una proteína se
desnaturaliza. Por ejemplo, cuando al péptido MccJ25-Trp se lo resuspende en concentraciones
crecientes de dioxano, se ve un corrimiento hacia menores longitudes de onda y un aumento de
la fluorescencia (Figura 7).
100 %
80 %
40 %
20 %
0%
333 nm 351 nm
7
Aminoácido) Proteína
Solvente
λem (nm ΦF λem (nm) ΦF
H2O 340 0,12 333 0,02
Trp
DMSO 340 0,81 333 0,67
H2O 303 0,21 --- ---
Tyr
DMSO 306 0,27 309 0,06
Phe DMSO 282 0,02 284 0,006
El modelo vigente sostiene que cada fibra presenta un diámetro entre 75-80 Ǻ y se
encuentra formada por protofibras de 25-35 Ǻ (Figura 8). En esta estructura la cadena peptídica
forma hojas β cruzadas (paralelas o antiparalelas) que se disponen de forma perpendicular al eje
fibrilar.
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La formación de fibras amiloides pueden también ser inducidas “in vitro” bajo
condiciones fisicoquímicas adecuadas, permitiendo el estudio de los mecanismos que gobiernan
el proceso. Se sabe que ciertas proteínas solubles a pH ácido y en un entorno hidrofóbico pueden
formar rápidamente estos agregados. También pueden ser formados en presencia de fosfolípidos
ácidos como fosfatidil serina (PS), cardiolipina (CL) o fosfatidil glicerol (PG). Estudios
realizados “in vitro” demostraron que proteínas como albúmina, lisozima, insulina,
gliceraldehido- 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), mioglobina, transtiretina, citocromo c,
histona H1, y R-lactoalbumina forman fibras amiloides.
La inhibición o reversión de la formación de fibrillas amiloides se insinúa como un
posible mecanismo preventivo de las enfermedades amiloides y a la fecha, distintos compuestos
orgánicos pequeños han demostrado capacidad de inhibición del proceso “in vitro”.
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Instrumentos utilizados para detectar fluorescencia
Los elementos esenciales en los sistemas de detección de fluorescencia son cuatro: 1) una
fuente de excitación (luz blanca), 2) un lugar apropiado para poner la muestra, 3)
monocromadores o filtros para discriminar entre los fotones de emisión de los fotones de
excitación y 4) un detector para registrar la emisión de los fotones, el cual produce una señal
generalmente eléctrica. Para mejorar la visualización de los resultados generalmente está
acoplado al equipo un amplificador de la señal.
Existen distintos tipos de equipos que utilizan los aspectos básicos de la fluorescencia,
entre ellos:
Otros tipos de instrumentos que usan la detección por fluorescencia son los sistemas de
electroforesis capilar, de HPLC y los equipos de secuenciación de DNA.
Espectrofluorómetro
Un espectrofluorómetro (Figura 10) consta de una lámpara de arco de Xenón la cual emite
luz blanca en un amplio rango de longitudes de onda que abarcan desde el UV, ~ 240 nm, hasta
el infrarrojo, ~ 900 nm. Este rayo de luz es colectado por el monocromador primario o de
excitación (M1) el cual selecciona la longitud de onda (λex) que va a incidir sobre la muestra y es
determinada por el espectro de absorción de cada fluoróforo. El rayo de luz con la longitud de
onda λex incide sobre la cubeta que contiene a la muestra, la cual puede estar termostatizada. Las
cubetas pueden ser de diferentes tipos (cuarzo, vidrio, etc.) dependiendo de la longitud de onda
en la cual leamos. La emisión de fluorescencia generalmente es detectada a 90° del rayo de luz
de excitación. Es colectada por un sistema de lentes y pasa a través de un Monocromador
secundario o de emisión (M2) el cual separa la fluorescencia emitida por la muestra de la luz de
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excitación, con una longitud de onda determinada (λem). La luz incide en un fotodetector que
convierte los fotones de fluorescencia en una señal eléctrica.
Otro componente muy importante es el canal de referencia que es un sistema que crea una
señal electrónica proporcional a la intensidad de luz incidente en la muestra. En el
espectrofluorómetro se pueden colocar filtros en los trayectos ópticos que impiden el paso de la
luz de ciertas longitudes onda que interfieran con la medición.
Monocromador Cubeta de
primario de excitación muestra
λ ex
Lámpara de arco
de Xenón
Monocromador secundario
de excitación
de emisión
λ em
Detector / Fotomultiplicador
amplificador
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Parte experimental
Objetivo del Trabajo Práctico:
*Determinar la fluorescencia intrínseca de distintas proteínas y como dicha fluorescencia
varía según el medio en que se encuentran.
*Estudiar in vitro la capacidad de formación de fibras amiloides de la albúmina.
Determinación de la fluorescencia intrínseca de proteínas
1) Determinación del espectro de excitación y de emisión de albúmina,
gammaglobulina, tripsina, lisozima, insulina y mioglobina: a) en buffer Tris-HCl 20 mM
pH 7,4, b) en dioxano al 50% y c) en urea 8M y d) en cloruro de guanidina 6M. A partir
de soluciones madres de la proteína (2mg/ml) se realizaran diluciones 1/10 en los
distintos medios con un volumen final de 1,5 ml. Se incuban durante 30 min a
temperatura ambiente.
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Determinación: Se inducirá la formación de fibras amiloides de la albúmina por calentamiento a
65ºC. Se estudiará la cinética de formación de agregados de la albúmina (2mg/ml) en buffer Tris-
HCl 20 mM pH 7,4. Se tomarán alícuotas a distintos tiempos: 0, 10, 30, 60 y 90 min. Para
detener la agregación se pondrán los tubos en baño de hielo. Para la lectura se diluye las
proteínas a una concentración final de 0.1 mg/ml y se les agrega ThT a una concentración final
de 25 µM.
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1) Proteína:
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
260 280 300 320 340 360 380 400
λexc 275
λem 300 λem 350 KI
Tyr -----
Tyr-Trp
4)
Fluorescencia 1
(UA)
0 0, 8
10 0, 6
30
60 0, 4
90
0, 2
0 20 40 60 80 100
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