Bacteriología Dr.

César Cevallos Columbus

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN–TACNA

FACULTAD DE CIENCIAS: E.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA
Curso: Bacteriología
PRÁCTICAS DE LABORATORIO Nº 07

BACILOS GRAM NEGATIVOS: FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

INTRODUCCIÓN

Los bacilos Gram negativos conforman un grupo compuesto por múltiples familias bacterianas
entre las que destacan la familia Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Pseudomonadaceae y otras.

La familia Enterobacteraceae constituye el conjunto mayor y más heterogéneo de bacilos Gram

negativos. Se han descrito al menos 27 géneros y 7 grupos entéricos con más de 110 especies.
Estos géneros se han clasificado en función de la homología del ADN, propiedades bioquímicas,
reacciones serológicas, susceptibilidad a bacteriófagos específicos y patrones de sensibilidad a
los antibióticos. Son bacilos Gram negativos, facultativos que fermentan glucosa, son oxidasa
negativos, reducen nitratos a nitritos y no requieren ni su desarrollo se acrecienta con NaCl.
Pueden ser móviles o inmóviles, estas características sirven para diferenciar miembros de esta
familia de otros bacilos Gram negativos facultativos fermentadores de glucosa pertenecientes a la
familia Vibrionaceae.

Excepto las especies de Shigella, que rara vez causan infecciones fuera del tracto gastrointestinal,
la mayoría de las Enterobacterias son capaces de producir una variedad de infecciones
extraintestinales. Sin embargo, un pequeño número de especies incluyendo Enterobacter
aerógenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoneae, Proteus mirabilis y
Serratia marcescens dan cuenta de la gran mayoría de las infecciones. Las infecciones del tracto
urinario (más del 70%) principalmente cistitis son las más comunes, heridas por infecciones
respiratorias, de heridas, del torrente sanguíneo y del SNC. Así mismo Escherichia coli es un
contaminante de agua potable por lo que se le emplea como un indicador de contaminación fecal
y se determina la potabilización del agua haciendo un recuento de coliformes fecales. De igual
forma especies de Salmonella se pueden contraer vía la ingesta de alimentos, por la cual es
necesario hacer pruebas de detección de Salmonella.

OBJETIVO
1. Que el alumno identifique las características culturales y bioquímicas de las especies más
representativas de la Familia Enterobacteriaceae.
2. Que el alumno aprenda las técnicas de aislamiento, identificación y conservación de los
bacilos entéricos

MATERIAL PARA LA PRÁCTICA:

1. Placas de agar Mac Conkey REACTIVOS:

2. Placas de agar EMB 1.- Reactivo de Ehrlich
3. Placas de agar SS 2.- Reactivo de Kovacs
4. Tubos con TSI 3.- Tiras de papel filtro
5. Tubos con LIA OTROS MATERIALES:
6. Tubos con Citrato de Simons  Asas bacteriológicas en anillo y en punta
7. Tubo con caldo Selenito  Mecheros
8. Agua peptonada  01 cámara de anaerobiosis
 Incubadora

MUESTRAS DE TRABAJO: Heces humanas, aguas residuales o cloacales, orina (infección

urinaria).

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PROCEDIMIENTO

PRIMER DIA.
1. Sembrar la muestra, para su aislamiento, en placas con agar Mac Conkey, agar EMB y/o SS.
Incubar a 37ºC por 24 horas.
2. Sembrar el tubo con caldo Selenito o caldo Tetrationato con aproximadamente un 1g de heces
e incubar a 37ºC por 24 horas.

SEGUNDO DIA.
1. De las placas incubadas seleccionar las colonias de bacterias que muestren características
diferentes y, con cada colonia inocular en los tubos de TSI, LIA, Citrato de Simmons, Agua
peptonada (caldo Triptófano). Medio MR/VP, Incubar a 37ºC por 24 horas.
2. Del tubo de caldo Selenito inocular las placas con agar Mac Conkey y agar SS e incubar a
37ºC por 24 horas.

TERCER DIA:
1. Interpretar las pruebas bioquímicas de acuerdo a las instrucciones de su profesor e identificar
las bacterias de acuerdo a la tabla para identificación de Enterobacterias.
2. Realice la lectura de las placas inoculadas del caldo Selenito.

TABLA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

Indol
SimonsCitrato de

Sacarosa

Ureasa

Lactosa

Licuqcuón de la

Glucosa
Gas

H2S

Lisina

Ornitina
Motilidad

Enterobacterias

Gelatina
Citrobacter + + v v - + v v v v - +
Edwardsiella - + + + + + + - - v - +
Enterobacter + + - - v + + + v v -/v +
Escherichia V + - + + v v v - v - +
Klebsiella V v - v v - - v v v - +
Morganella - v - + - + + - + - - +
Proteus V v v v - + v v + - + +
Providencia + v - + - + - v v - - +
Salmonella V v v - V + v - - - - +
Serratia + v - v V + V v - v V/+ +
Shigella - - - v - - v - - - - +
Yersinia - v - v - - v v v V -/v +
SÍMBOLOS: - , menos del 9% cepas positivas; v, 10 a 89 % de cepas positivas; +, mas del 90% de
cepas positivas. Tomado de Manual de Microbiología Clínica 4° Edición. Lennette.
Adaptado de Murray F.R. ( et. al . ) pag 484.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

1. Prueba de oxidasa: Esta prueba sirve para la determinación de la presencia de la enzima

citocromo oxidasa en preparaciones de microorganismos.

Procedimiento:
1. Levantar con el ansa una colonia del cultivo puro.
2. Aplicar dicha colonia sobre la tira de papel de filtro embebida con el reactivo de Kovacs,
asegurándose de extender bien el material.
3. Esperar 5-10 segundos y observar la coloración.

Interpretación de resultados:
 Prueba positiva: color azul por oxidación de dicho compuesto a azul de indofenol.
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 Prueba negativa: el color de la tira de papel de filtro no se modifica.

2. Prueba de catalasa: Esta prueba sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en
preparaciones de microorganismos.

Procedimiento:
1.- Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio.
2.- Colocar dos asadas del cultivo a probar sobre la gota de agua y hacer una suspensión espesa
(no dejar secar).
3.- Agregar 2 o 3 gotas de agua oxigenada fresca.
4.- Observar los resultados.

Interpretación de resultados:
 Prueba positiva: formación inmediata de burbujas bien visibles (desprendimiento de O2).
 Prueba negativa: no hay formación de burbujas (no se forma O2).

3. TSI (TRIPLE SUGAR IRON)

Introducción: El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar
la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único
medio. También permite la detección de la producción de H2S.

Procedimiento:
Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm
del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y
otro lado. Incubar a 35 °C durante 18-24 horas, pero no más de 24 horas.

Interpretación y Controles
Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, producción de gas y
H2S.

Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-)

No hay fermentación de azúcares. Característica de bacterias no fermentadoras. Ej.
Pseudomonas sp

Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S-)

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción de gas ni de H2S.
Ej. Shigella spp.

Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S+)

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción de gas, si de H2S.
Ej. Salmmonella typhi.
Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+)
Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de gas y producción de ácido
sulfhídrico. Ej. Salmonella spp. (la mayoría de las especies de Salmonella).

Pico ácido/fondo ácido (A/A)

Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. E.coli (A/A/H2S -)
A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.

4. LIA (LYSINE IRON AGAR)

Introducción
Este ensayo permite diferenciar los m.o. que producen descarboxilación o desaminación de la
lisina. Se puede detectar además la producción de H 2S. Es muy utilizado en las técnicas de
búsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de
aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.

Principio
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Durante las primeras etapas de la incubación el fondo virará el indicador de pH del medio al ácido
(amarillo) por la fermentación de glucosa. Luego, si el aminoácido es descarboxilado se formarán
aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al básico (color
violeta).
En la desaminación se produce un ácido carboxílico y NH3 y se visualiza en la superficie la
aparición de un color rojo intenso. La producción de H 2S a partir de tiosulfato se visualiza por la
precipitación de sulfuro ferroso de color negro.

Interpretación y controles
 Pico alcalino/fondo alcalino/H2S+, descarboxilación de lisina positiva. Ej.: Salmonella
choleraesuis.
 Pico rojo/fondo ácido/H2S-, desaminación de lisina positiva, descarboxilación de lisina
negativa. Ej.: Proteus mirabilis.
 Pico alcalino/fondo ácido/H2S- descarboxilación de lisina negativa. Ej. E. coli
 Pico alcalino/fondo ácido/H2S+ descarboxilación de lisina negativa, producción de H2S. Ej.
Citrobacter freundii.

5. INDOL
Introducción
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las
bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con
producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica
importante para la identificación de muchas especies de m.o.

Procedimiento
Inocular el caldo triptófano con el m.o. en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al
finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo.

Interpretación
El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de
añadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva.

6. ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP)

Principio
Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de
enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan
por la fermentación de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentación ácido-mixta y
la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente
láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman
cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol,
etanol, H2 y CO2.

El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo),
que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.

El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol.

En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en
presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.

Procedimiento
Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a
35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 mL del caldo a un
tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo
de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%.
Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10
a 15 minutos.

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Interpretación
La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la producción de
ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. fermentó la glucosa por la vía de
ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como
positivo.
La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la
presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína.

Controles: RM positivo, VP negativo: Escherichia coli

RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes

Pruebas Medio de cultivo Reactivos a usar Reacción positiva

Indol Caldo 523 1 ml reactivo Kovack* Color rojo
al medio cultivo
Rojo de Metilo Caldo peptonado 5 ml cultivo Color rojo
5 gotas rojo de metilo
Voges- Caldo peptonado 1 ml cultivo Color rojo
Proskauer 0,6 ml naftol 5% luego de 5-10 min
0,2 ml KOH 40%
Agar- citrato Agar-citrato Ninguno Desarrollo
(tubos) acompañado de
cambio de color

7. UTILIZACIÓN DE CITRATO
Introducción

La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con
citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este
aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Procedimiento
Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24
horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir
falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4
días.

Interpretación
Es positivo: cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje
del indicador al azul.

CUESTIONARIO:

1.- ¿Cuál es la razón del empleo de medios selectivos indicadores en el coprocultivo. Explique las
bondades de cada uno de los medios solicitados para la práctica.
2.- ¿Qué germen podría ser si presentará las siguientes características bioquímicas: lactosa
negativo; H2S positivo, sin gas, y que no aglutina con suero polivalente de Salmonella?
3.- Además del TSI, LIA y Citrato de Simons, qué otras pruebas bioquímicas puede nombrar.
4.- En qué consiste la prueba de Widal? ¿Cuáles son sus parámetros serológicos?
5.- ¿Cuál es la importancia de hacer un recuento de coniformes fecales? ¿Cómo se realiza?
6.- En la prueba de detección de Salmonella que medios utilizaría usted? ¿Cuál sería su
procedimiento?
7.- Procedería un hemocultivo en el caso de una salmonelosis alimentaria? Explique por qué.

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Tacna, octubre 2016