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CIANOBACTERIAS

TAXONOMIA
Nombre comn :
Cianobacterias
Dominio: Eubacteria
Reino: Mnera
Filo: Cianobacterias
Dimensiones: Desde
0.5-1mm de dimetro
hasta 60 mm
Hbitats: Terrestres y
acuticos (aguas
continentales y mar).

CARACTERISTICAS DE LAS
CIANOBACTERIAS

Morfologa variada:
unicelulares y filamentosas
mviles por deslizamiento
Presentan diferenciaciones
celulares: Heteroquistes y
Acinetos
Realizan Fotosntesis
Oxignica. Presentan
Ficobilisomas
Fijan Nitrgeno, producen
Geosmina y Toxinas
Se dividen por fisin
binaria, gemacin o fisin
mltiple

CARACTERISTICAS DE LAS
CIANOBACTERIAS

Estn presentes en
numerosos hbitat:
Superficie e interior de
rocas, suelos desrticos,
estanques y lagos, en
simbiosis con Hongos,
Protozoos y plantas...
Son componentes bsicos
de los Estromatolitos. Hay
restos fsiles de mas de
3000 millones de aos de
antigedad. Probablemente
fueron los primeros
organismos productores de
Oxgeno

ORIGEN DE LAS CIANOBACTERIAS

Utilidad del microorganismo

Para la identificacin microscpica de las cianobacterias en


vivo, se recogieron 100 mL de agua en cajas de cultivo de
tejidos de tapa ventilada.

Para la identificacin microscpica y recuento, se recogieron


100 mL de muestra, a la que se aadi inmediatamente formol
al 1% tamponado con PBS (Phosfate Buffer Saline).
Las muestras empleadas para la identificacin de las
cianobacterias se analizaron en vivo y sin conservantes en un
plazo inferior a 24 horas desde su recogida para evitar
cualquier alteracin.

Mtodos analticos e instrumentacin utilizados

Inspeccin de la zona de muestreo, indicando si apareca


alguna coloracin verde o azul
verdosa, o bien espuma en las orillas.

Para la identificacin microscpica de las cianobacterias en


vivo, se recogieron 100 mL de agua en cajas de cultivo de

Para medir la clorofila a, se recogieron 100 mL de muestra


en cajas de cultivo de tapa ventilada.
Para recoger materia celular para los bioensayos en ratn,
se filtraron de 100 a 500 mL de agua (en
funcin
de la cantidad de partculas disueltas en el agua) por un filtro
de red.
Para medir la cantidad de toxinas en el agua, se recogieron
50 mL en una caja de cultivo de tapa ventilada
Por si fuera necesario repetir algn anlisis, se recogieron
dos litros de agua a una profundidad mxima de 25 cm.
Todas las muestras de agua se transportaron en
condiciones de oscuridad y bajo refrigeracin (unos 4 C)
en una nevera porttil hasta el laboratorio, donde quedaron
almacenadas para su estudio en una cmara frigorfica a 4
C

Se Determinacin
tomaron 1,5 mL de muestra.
el fin de separar
deCon
clorofila
a
las clulas se centrifug, en oscuridad y fro (4 C) a
3.000 rpm durante 10 min.
Se cubrieron con 1 mL de solucin extractora (N, Ndimetilformanmida (DMF)) las muestras congeladas.
Mediante un sonicador se sometieron las muestras a
tres pulsos de 5 segundos a 60 MHz en intervalos de
40 segundos. A continuacin, se aadi el volumen
necesario de solucin extractora para alcanzar un
mnimo de 1,5 mL de volumen de extracto.
La extraccin de pigmentos se llev a cabo en oscuridad y fro (4C)
mediante la adicin de 1 mL de DMF a las muestras congeladas que se
mantuvieron 12 horas para favorecer la extraccin.
Para la medida de las absorbancias se utilizaron cubetas de
espectrofotmetro de cuarzo, de 1,5 mL de volumen y de 1 cm de
recorrido. El blanco se realiz rellenando la cubeta con DMF y se midi la
absorbancia a diferentes longitudes de onda (750, 646,8 y 663,8 y 480
nm).
La absorbancia de 750 nm estima la turbidez de la muestra. Por ello, si
dicha absorbancia era superior a 0,015 se volva a centrifugar el

Extraccin de toxinas

Para ello, se tomaron 1,5 ml de muestra en un bote Eppendorf, donde fue


sonicado, manteniendo en todo momento el Eppendorf dentro de una
cubeta de hielo picado. La pauta de sonicacin fue de 3 pulsos de 20
segundos a 60 MHz. Finalmente, las muestras fueron centrifugadas
durante 5 minutos a 15.000 rpm.

Para extraer las posibles toxinas de los ventrculos, cada uno de


ellos se coloc encima de una placa de Petri y se aadieron en su
interior 2 ml de PBS. De esta mezcla se recogi 1 ml que fue
trasvasado a un bote eppendorf, donde se procedi a la
sonicacin de la muestra con 3 pulsos de 20 segundos a 60 MHz,
manteniendo el eppendorf dentro de una cubeta de hielo picado.
Finalmente, las muestras fueron centrifugadas durante 5 minutos
a 15.000 rpm.
Para la extraccin de las posibles toxinas de los hgados, se
homogenizaron 2,5g de muestra con 2,5 mL de PBS,
homogenizndose todo el contenido. Del homogenizado, se
tomaron 1,5 ml y se trasvasaron a un bote eppendorf, donde se
snico la muestra con 3 pulsos de 20 segundos a 60 MHz,
manteniendo el Eppendorf dentro de una cubeta de hielo picado.
Finalmente, las muestras fueron centrifugadas durante 5 minutos
a 15.000 rpm.

ratn en ratn
La tcnica Bioensayo
empleada paraen
el bioensayo
se basa en la inyeccin intraperitoneal de un
extracto de muestra.
Se utilizaron machos de ratn sanos con un peso de
20 g. Los grupos de machos se dividieron
aleatoriamente en grupos de tres y fueron inyectados
intraperitonealmente con 0,5 ml de la muestra
problema. Despus de la inyeccin, los ratones
fueron observados de forma continua. Los sntomas y
tiempos de supervivencia fueron anotados en todos
los experimentos.
En los bioensayos de ratn para deteccin de microcistinas se
consider que cuando el ratn mora en las primeras 24 horas el
bioensayo era positivo. El ndice establecido para determinar los
resultados del bioensayo en ratn fue el siguiente: 3+ tres
ratones muertos en las primeras 24 horas; 2+ dos ratones
muertos en las primeras 24 horas; 1+ un ratn muerto en las
primeras 24 horas y 0 cuando los tres ratones se encontraban
con vida 24 horas despus de la inyeccin. As como, un grupo

ratn en ratn
La tcnica Bioensayo
empleada paraen
el bioensayo
se basa en la inyeccin intraperitoneal de un
extracto de muestra.
Se utilizaron machos de ratn sanos con un peso de
20 g. Los grupos de machos se dividieron
aleatoriamente en grupos de tres y fueron inyectados
intraperitonealmente con 0,5 ml de la muestra
problema. Despus de la inyeccin, los ratones
fueron observados de forma continua. Los sntomas y
tiempos de supervivencia fueron anotados en todos
los experimentos.
En los bioensayos de ratn para deteccin de microcistinas se
consider que cuando el ratn mora en las primeras 24 horas el
bioensayo era positivo. El ndice establecido para determinar los
resultados del bioensayo en ratn fue el siguiente: 3+ tres
ratones muertos en las primeras 24 horas; 2+ dos ratones
muertos en las primeras 24 horas; 1+ un ratn muerto en las
primeras 24 horas y 0 cuando los tres ratones se encontraban
con vida 24 horas despus de la inyeccin. As como, un grupo

Descripcin de los sucesos


de mortandad y necropsias

Los cadveres de animales fueron mantenidos


en refrigeracin hasta la realizacin de la
necropsia.
Las muestras de hgado y contenido ventricular
fueron congeladas hasta su anlisis.

ESTIMACIN DE LA REPETIBILIDAD, REPRODUCIBILIDAD Y


PRECISIN EN LA DETECCIN DE LAS
TOXINAS

La repetibilidad fue determinada mediante la concordancia


de medir tres veces las medidas de la misma muestra de
cianobacterias, de los controles de microcistina-LR (Sigma
Aldrich Qumica) entre 0.8 y 4 ppb y los controles de
saxitoxinas (R-Biopharm AG) entre 2.5 ppb y 50 ppb.

La reproducibilidad fue determinada mediante la


concordancia entre tres bateras de observaciones
realizadas por tres observadores distintos, utilizando tres
alcuotas de muestras de cianobacterias, tres lotes de
reactivos de microcistina-LR controles a 0.8 y 4 ppb.

ANLISIS ESTADSTICO
Para poder evaluar y analizar estadsticamente los datos
de aparicin de mortandades masivas de fauna salvaje
en Doana hemos realizado, por un lado, un anlisis
estadstico de los datos histricos con todas las
referencias bibliogrficas que se han podido recopilar y,
por otra parte, un anlisis estadstico de datos actuales
equivalentes, con el fin de realizar una comparacin
directa
entre
ambos
periodos
temporales.
Adicionalmente, se ha realizado un anlisis estadstico
detallado de los datos actuales en el que se han incluido
otros parmetros complementarios obtenidos, como la
presencia de cianobacterias, cianotoxinas, niveles de
nitratos, niveles de fosfatos y valores de clorofila.

Anlisis estadstico de datos


histricos:
N mortandades/N aos estudiados x 100

Anlisis estadstico bsico de datos


actuales:
N mortandades/N aos estudiados x 100

Anlisis estadstico detallado de datos


actuales:

N aos con presencia de cianobacterias


txicas /N aos estudiados x 100.
N meses con presencia de cianobacterias
txicas /N meses estudiados x 100.
N aos con presencia de cianotoxinas
txicas /N aos estudiados x 100.
N meses con presencia de cianotoxinas
txicas /N meses estudiados x 100.

COMENTARIO SOBRE EL RESULTADO


DEL TRABAJO
1.

2.

3.

En la mortandad de junio de 2004, . La mayora de los animales


necropsiados mostraban una buena condicin corporal, a excepcin de
las limcolas que presentaron todas distintos grados de caquexia.
En la mortandad de octubre de 2004 los hallazgos de necropsia ms
significativos siguieron dos patrones. Por un lado, los animales
procedentes de Veta de la Palma, Por el contrario, los animales
procedentes del Lucio del Lobo mostraban una mala condicin corporal,
careciendo, incluso, de grasa subdrmica.
En Junio de 2005 se produjo la aparicin de una proliferacin
monoespecfica de Anabaena circinalis, as como unas 30 Tm de peces
muertos en el Cao del Guadiamar, Parque Natural de Doana.

Anlisis de datos histricos


1. Estudio de la probabilidad de aparicin de mortandades masivas en
Doana, La probabilidad de aparicin de una mortandad masiva, es de
0,4545 (45,45 % anual). Cianobacterias txicas y mortandades en masa
de fauna salvaje en las Marismas de Doana
2. Estudio de la distribucin espacial de las mortandades masivas
ocurridas en Doana, La localizacin de los resultados obtenidos de la
distribucin espacial de las mortandades masivas del rango de aos que
se va de 1969 a 2001.
3. Estudio de la distribucin espacial y temporal de cianobacterias
txicas en Doana La abundancia de cianobacterias txicas surgidas en
Doana (colonias /ml). En el ao 2002 aparecieron cianobacterias
txicas en cuatro cuadrculas, en el ao 2003 en cinco cuadrculas, en el
ao 2004 en cuatro cuadrculas y en el ao 2005 en una sla cuadrcula.

DISCUSIN
Uno de los objetivos principales de esta tesis es demostrar
que el suceso descrito por AlonsoAndicoberryet al. (2002) no
representa un hecho aislado y casual sino, por el contrario,
que las proliferaciones de cianobacterias son una
circunstancia frecuente e, incluso, predecible .
Los gneros de cianobacterias txicas que muestran una
amplia distribucin espacial en el entorno de Doana son
Microcystis, Anabaena y Pseudanabaena y su presencia se
produce en muchas ocasiones con elevadas densidades
aportando, por tanto, grandes cantidades de produccin
primaria al ecosistema.
Todas las cianobacterias encontradas en los muestreos son
capaces de producir potentes toxinas(Lawton et al., 1999). La
toxicidad que generan est directamente relacionada con su
tipologa.
La clorofila a es un parmetro que permite tambin valorar la
produccin
primaria
de
los
organismos
acuticos

CONCLUSIONES

La probabilidad de aparicin de floraciones de cianobacterias en las


Marismas de Doana es claramente estacional y abarca un periodo
que comprende desde el mes de mayo hasta octubre.

La distribucin de las proliferaciones de cianobacterias txicas en


las Marismas de Doana se produce de forma agregada, siendo
recurrente en los mismos sitios a lo largo de los cuatro ltimos aos.

La distribucin de las proliferaciones de cianobacterias txicas est


fuertemente asociada con las mortandades masivas ocurridas en
las Marismas de Doana durante los ltimos cuatro aos.

A la vista de los resultados obtenidos, se considera de gran


importancia para la conservacin de la fauna salvaje el desarrollo
de protocolos de alerta temprana que permitan la deteccin de
proliferaciones de cianobacterias txicas en el medio natural,
especialmente en los espacios naturales protegidos.

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