Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.

Práctica:
Vías de Inoculación
Las rutas más comúnmente empleadas para la inyección de productos biológicos en
animales de experimentación son la intravenosa, subcutánea, intradérmica,
intraperitoneal e intracerebral.

VÍA VENOSA
En el conejo se practica la inoculación en la vena marginal de la oreja. Para realizarlo, un
asistente debe inmovilizar al animal o bien será colocado en una caja que presente una
abertura por la cual se hace salir únicamente la cabeza.

La cabeza se desinfecta con alcohol yodado presionando en su base sobre la vena, con el
fin de lograr el abultamiento o dilatación de ésta, procediéndose a introducir la aguja
calibre 26, en la dirección de la corriente sanguínea, inyectándole lentamente el material
biológico. Invariablemente todas las inoculaciones deben ser hechas en la misma oreja,
dejando la otra para la sangría.

En el ratón esta inoculación se realiza en la vena del rabo o en la vena dorsal del pene, y
en los cuyes se realiza en las venas de las patas posteriores, introduciéndole la aguja entre
los dedos.

VÍA INTRAPERITONEAL
Para realizar esta inoculación, sea en conejo, cuy o ratón, se depila y desinfecta la zona
del abdomen escogida, un asistente sujeta al animal y lo mantiene con la cabeza
ligeramente inclinada hacia abajo.

Se introduce la aguja perforando la piel en sentido oblicuo y luego con un movimiento

rápido se atraviesa la capa muscular y el peritoneo, y se inocula.

VÍA SUBCUTÁNEA
En los animales pequeños las inyecciones subcutáneas, generalmente se realizan bajo la
piel del vientre o cara interna del muslo. En animales de gran porte como el caballo se
acostumbra hacerlo en el cuello o en cualquier otro sitio de fácil acceso.

VÍA INTRADÉRMICA
Se hace en el vientre o en el dorso, después de haber depilado y desinfectado el área se
introduce la aguja en dirección casi paralela a la piel y con el bisel hacia arriba, luego se
rota la jeringa a fin que el bisel de la aguja quede hacia abajo y se procede a inocular el
material. La formación de una ampolla indica que la inoculación se ha hecho
correctamente.

VÍA INTRACEREBRAL
Esta ruta es de gran aplicación en el trabajo con virus. El animal debe ser anestesiado
para lograr una perfecta inmovilización. Con animales grandes es necesario trepanar la
cabeza craneana previo a la introducción de la aguja hipodérmica; para cuyes y ratones se
hace uso de agujas resistentes, inoculándose en una sutura entre el ojo y la oreja.
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Objetivo: Entrenar al investigador en las diferentes vías de inoculación en animales de

experimentación ya sea para investigar las propiedades patogénicas de un
microorganismo o sus productos, o para la obtención de sueros inmunes.

Sustancia Biológica:
 Solución Salina Fisiológica (SSF) estéril.

Material:
 Guantes, mascarilla, gorro, protector visual
 Mechero con ron de quemar y fósforo
 Jeringas descartables de 20 mL, 10 mL, 5 mL y de tuberculina
 Alcohol de 70º con 1% de tintura de yodo
 Algodón
 Navaja nueva
 Animales de laboratorio: Conejos, Cuyes, Ratas, Ratones

Cantidad de inoculo a inyectar:

VÍA CONEJO COBAYO RATA RATÓN

Subcutánea 20,0 mL 10,0 mL 5,0 mL 1,5 mL
Intramuscular 8,0 mL 5,0 mL 2,0 mL 0,5 mL
Endovenosa 10,0 mL 5,0 mL 3,0 mL 0,5 mL
Intraperitoneal 10,0 mL 5,0 mL 3,0 mL 2,0 mL

Tipos de agujas hipodérmicas para diferentes propósitos:

CALIBRE LONGITUD
Inyección Intravenosa (conejo) 25 - 27 ½”
Inyección Intraperitoneal (conejo) 20 - 24 1”
Inyección Subcutánea (conejo) 20 - 24 1”
Inyección Intradérmica (cuyes) 27 - 28 ½”
Inyección Subcutánea e intrabdominal de material
18 1,5”
viscoso o sangría de conejo del corazón
Punción cardiaca (cuyes) 22 1” – 1,5”

Procedimiento:
Cualquiera que sea la vía de inoculación, debe tener en cuenta lo siguiente:
 Depilar y desinfectar la zona elegida
 Elegir la aguja apropiada y acoplarla adecuadamente a la jeringa a utilizar cerca de un
mechero
 Cargar la jeringa cerca de un mechero teniendo en cuenta las medidas de asepsia
 Bajo la supervisión del instructor se procede a inocular en las diversas vías
mencionadas
 Esquematice los diversos métodos de inoculación practicados por usted en el
laboratorio.
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Esquemas o dibujos:

Cuestionario:
1. ¿Para qué pueden ser usados los gallos en inmunología?
2. ¿En que vaso se realiza la sangría en las aves?
3. ¿Qué es un esquema de inmunización?
4. Cuál es el mecanismo por la cual una inyección subcutánea o intraperitoneal
desensibiliza un animal que se encuentra en estado de anafilaxia?
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Práctica:
Shock anafiláctico
El shock anafiláctico es una de las más dramáticas manifestaciones de interacción
antígeno – anticuerpo “in vivo”. Es una reacción sistémica que depende de la liberación
de histamina y otras sustancias biológicamente activas. El shock anafiláctico es
producido en numerosos animales pero el cobayo responde más dramáticamente. En el
hombre se observará en casos de sensibilización a la penicilina, vacunas tíficas etc.

En la producción de la reacción anafiláctica existen 2 periodos marcados. El primero

llamado “sensibilizante” es producido por la inyección de un antígeno generalmente
inyectado por vía intraperitoneal o subcutánea seguido de un periodo de latencia que
permitirá al anticuerpo formado, fijarse en los tejidos.

En el segundo periodo o “desencadenante” es producido 2 a 3 semanas después de la

sensibilización con una dosis de antígeno mayor e inyectado en el torrente circulatorio
(por vía endovenosa o vía intracardiaca).

Objetivo: Entrenar al estudiante en el reconocimiento de manifestaciones de la reacción

de Shock anafiláctica.

Muestra Biológica:
 Muestra de albúmina de huevo al 1% o seroalbúmina bovina al 0,1%.

Material y Medio de cultivo:

 Guantes, mascarilla, gorro.
 Mechero con ron de quemar y fósforo
 Jeringas y agujas hipodérmicas (tuberculina)
 Alcohol yodado.
 Navaja.
 Antihistamínico.

Procedimiento:
 Inocular por vía intraperitoneal 1 mL de solución de albúmina de huevo al 1% ó 0,5
mL de seroalbúmina bovina al 0,5% a dos cobayos.
 Después de un periodo de 15 días o 3 semanas de la primera inyección, inocular por
vía intracardiaca 1 mL de solución de albúmina de huevo al 5% ó 0,5 mL de
seroalbúmina bovina a 0,5% a un cobayo (cobayo Nº 1)
 Al otro cobayo (Nº 2) aplicarle por vía endovenosa 10 mg. De antihistamínico y
luego 1 mL de la solución de albúmina ó 0,5 mL de la seroalbúmina bovina.
 Observar los síntomas característicos de la anafilaxia en el cobayo Nº 1; erizamiento
del pelo, se rasca la nariz, expande las fosas nasales, se presentan convulsiones, la
respiración se va haciendo cada vez más lenta, abriendo la boca en cada uno de los
esfuerzos inspiratorios, hay relajamiento de esfínteres y el animal puede llegar a
morir. Observar también el segundo cobayo y anotar las diferencias entre ambos.
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Resultados:
Anote las manifestaciones presentadas en el animal Nº 1 y en el Nº 2.

MANIFESTACIONES
ANIMAL Erizamiento Rascado de Relajación
Convulsiones Otros
del pelo la nariz de esfínteres

COBAYO Nº 1

COBAYO Nº 2

Haga la representación gráfica de lo observado.

Cuestionario:
1. ¿Tiene el shock anafiláctico alguna aplicación práctica?
2. ¿Cuál es el mecanismo del shock anafiláctico?
3. ¿Cuáles son los casos más frecuentes de shock anafiláctico en el hombre?
4. ¿Qué papel cumplen las células cebadas y las basófilas en la reacción anafiláctica?
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Práctica:
Fagocitosis
La fagocitosis es el principal mecanismo de defensa por el cual el cuerpo se protege
de partículas extrañas, incluyendo bacterias que entran en él. En este proceso, hay dos
formas de agentes de trabajo, la “celular” y la “humoral”. El elemento celular consiste en
la fagocitosis celular, los cuales son comúnmente clasificados como micrófagos y
macrófagos.

La demostración de la acción de los macrófagos es más dificultoso en los ejercicios de

laboratorio, pero el polimorfismo, una de las células tipo, incluyendo los micrófagos si es
fácilmente observable.

Objetivo: Demostrar la habilidad fagocitaria de los leucocitos polimorfonucleares frente

a microorganismo.

Muestra Biológica:
 Cultivos de 24 horas de Staphylococcus aureus y Bacillus cereus (vivos y calentados)
ajustado al tubo Nº 3 del nefelómetro de Mc Farland.

Material:
 Guantes, mascarilla, gorro, protector visual
 Mechero con ron de quemar y fósforo
 Cuy o ratones previamente inoculados con S. aureus o B. cereus
 Cuy sin previa inoculación
 Éter
 Torundas estériles
 Tijeras y pinzas de disección
 Láminas portaobjetos
 Solución de colorante de Leishman
 Pipetas o goteros

Procedimiento:
 2 a 4 horas antes de iniciar la práctica inocule un cuy o ratón con el cultivo muerto
(calentado) de S. aureus o B. cereus
 Inicie la práctica inoculando intraperitonealmente 0,5 mL de cultivo vivo de
S. aureus o B. cereus al cuy o ratón anterior (al previamente inoculado)
 Inocule cultivo vivo de S. aureus o B. cereus similarmente a otro cuy o ratón no
preparado previamente
 A un tercer cuy o ratón no inocular (servirá como testigo)
 A las 2 horas del paso anterior, sacrifique ambos cuyes o ratones inoculados y al
tercer cuy o ratón testigo, poniéndolo en una cámara de éter
 Abra la cavidad abdominal y humedezca una torunda en el líquido peritoneal
 Rote cuidadosamente la torunda sobre una lámina portaobjeto, seque al aire o
ambiente y coloree con Leishman
 Observe la presencia de bacterias libres y la existencia de células mostrando bacterias
englobadas.
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Resultados:
Registre los resultados utilizando el siguiente cuadro:

OBSERVACIÓN BACTERIAS BACTERIAS

ANIMAL LIBRES FAGOCITADAS
Cuy o Ratón preinoculado S. aureus
+ cultivo vivo de: B. cereus
Cuy o Ratón S. aureus
+ cultivo vivo de: B. cereus
Cuy o Ratón testigo

Esquematice las observaciones microscópicas.

Cuestionario:
1. Defina: a) Inmunidad Celular, b) Opsonización
2. ¿Se realizará fagocitosis si inocula a un ratón con toxina tetánica?
3. ¿Qué papel cumple el complemento en la fagocitosis?
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Práctica:
Reacciones Serológicas
Las dos principales reacciones serológicas (Ag-Ac) que se estudiaran son la
aglutinación y la precipitación.

Ambos resultan de la unión fisicoquímica del antígeno y el anticuerpo. Si el antígeno esta

en forma soluble la reacción se llama precipitación y si es particulado como bacterias,
glóbulos rojos o antígenos observados en bentonita, látex, etc., se llama aglutinación.

Reacciones de Aglutinación
Se realizará la aglutinación bacteriana y la hemaglutinación directa.

Aglutinación Bacteriana
Constituye uno de los métodos de diagnóstico de mayor importancia en enfermedades
tales como la tifoidea, fiebres paratíficas, brucelosis, etc., entre todas ellas tienen
importancia fundamental para nosotros la Reacción de Widal, para el diagnóstico de la
fiebre tifoidea y fiebres paratíficas; la de Huddleson, para el diagnóstico de la brucelosis.

Objetivo: Adiestrar en la aplicación de un método diagnóstico para la detección de

anticuerpos febriles.

Muestra Biológica:
 Suero de un paciente que padece un proceso febril, sospechoso de tifoidea.

Material y Reactivos:
 Guantes
 Suspensiones comerciales con antígeno: Tífico “O”, Tífico “H”, Paratífico “A”,
Paratífico “B” y Brucella abortus
 Lámina escavadas para aglutinación con varios espacios marcados
 Pipetas Pasteur
 Pipetas de 0,2 mL
 Mondadientes
 Marcador indeleble

Procedimiento:
TECNICA CUALITATIVA
 Rotule la lámina escavada en los cinco espacios con las letras: O, H, A, B, Br
 Con la pipeta de 0,2 mL coloque una gota de 0,08 mL de suero problema en cada uno
de los cinco espacios marcados en la lámina
 Agregar una gota de cada uno de los reactivos (antígenos) correspondientemente a
cada gota de suero problema
 Mezcle uniformemente con palito mondadiente (distinto palito para cada lugar).
Rotar la lámina por unos 5 minutos
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 La aglutinación se observa por la aparición de grumos de tamaño variable, que

tienden a agruparse en la periferie de la gota
 Anote los resultados y continúe con la cuantificación del título del anticuerpo

TECNICA SEMICUANTITATIVA
 Con la pipeta de 0,2 mL coloque 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 y 0, 005 del suero problema y
del suero control sobre los espacios de la lámina de aglutinación
 Seleccione el antígeno cuya prueba cualitativa haya resultado positiva y agregue una
gota del antígeno seleccionado a cada alícuota del suero previamente dispuesto
 Mezcle con un mondadiente empezando por la dilución mayor y continuando con las
diluciones menores. Mezcle con movimientos rotatorios la placa por 5 minutos
 La presencia de grumos indica una reacción positiva
 La lectura se efectuará de acuerdo a la equivalencia siguiente:
0,08 mL = 1 : 20 de título
0,04 mL = 1 : 40 de título
0,02 mL = 1 : 80 de título
0,01 mL = 1 : 160 de título
0,005 mL = 1 : 320 de título

INTERPRETACIÓN
Títulos mayores de 1:80 tienen significación diagnóstica. Pruebas más exactas de
aglutinación se realizan en tubo.

Resultados:
TÍTULO
SUERO DEL PACIENTE
SUERO CONTROL

Realice la representación gráfica de lo observado.

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Hemaglutinación directa (grupo sanguíneo)

El empleo más evidente de la reacción de antígeno – anticuerpo por este procedimiento,
es la determinación de grupos sanguíneos. Los glóbulos rojos humanos tienen en la
superficie antígenos que determinan el tipo sanguíneo: A, B, AB, y los que no poseen
estos antígenos se les llama grupo “O”

El mayor porcentaje de la población posee el antígeno D (factor Rh).

Objetivo: Adiestrar en la determinación de grupos sanguíneos e interpretar

correctamente el resultado.

Muestra Biológica:
 Sangre

Material y Reactivos:
 Guantes
 Sueros comerciales anti A, anti B, anti D (Rh)
 Alcohol yodado
 Algodón
 Lancetas estériles
 Láminas portaobjetos
 Palitos mondadientes
 Marcador indeleble

Procedimiento:
 Rotule la lámina portaobjeto con las letras: A, B y D (o Rh)
 Limpiar cuidadosamente la yema del dedo medio con algodón humedecido en
alcohol yodado. Deje que seque la región desinfectada
 Coloque una gota de cada reactivo (anticuerpos) según lo marcado
 Punzar (pinchar) con la lanceta la yema del dedo preparado y deje caer
separadamente tres gotas de sangre en una lámina portaobjetos
 Mezcle con palito mondadiente (distinto palito para cada lugar) y luego rote la lámina
portaobjeto durante uno o dos minutos y observar la presencia de grumos que indica
aglutinación

Resultados:
1. Tipo sanguíneo:
2. Factor Rh:

Realice la representación gráfica de lo observado.

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Cuestionario:
1. Defina: a) Título, b) Hemólisis
2. ¿Qué colorante vital puede ser empleado para tener antígenos para aglutinación y
cuáles son sus ventajas frente a los colorantes comunes?
3. ¿Puede una reacción de aglutinación dar resultados positivos cuando n hay infección
aparente?
4. ¿Dónde están localizados los isoantígenos hemáticos?
5. ¿Puede cambiar durante su vida el grupo sanguíneo de una persona?
6. ¿Qué factores pueden explicar las reacciones falsas positivas o negativas en la
clasificación de los grupos sanguíneos?
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Reacción de Precipitación
Reacción de V. D. R. L. (Cualitativa)
Innumerables técnicas diferentes han sido propuestas y descritas para el diagnóstico
sexológico de sífilis; tales como, la reacción de Waserman, Hinton, Kolmer, Tagle,
Meinicki, Kabin etc., todas basadas en el mismo principio; sin embargo, una de ellas
tiene especial interés para nosotros debido a ser, dentro de todas la que proporciona
resultados con un menor número de falsos positivos; es la reacción de V. D. R. L.
(Veneral Disease Research Laboratory), razón por la cual únicamente nos ocuparemos de
ella.

Objetivo: Adiestrar en la Prueba de Reacción de V.D.R.L. e interpretar correctamente el

resultado.

Muestra Biológica:
 Suero de paciente sifilítico

Material y Reactivos:
 Guantes
 Reactivo comercial V. D. R. L. (antígeno)
 Solución Salina Bufferada (forma comercial)
 Lámina de vidrio escavada
 Rotador de Manzini (no indispensable)
 Frasco vacío de más o menos 20 mL de capacidad con tapa
 Jeringa con aguja Nº 22

Procedimiento:
A. Preparación del Suero
Proceder en forma igual que para la reacción Kahn (inactivar a 56º C por 30 minutos)
B. Preparación del Antígeno
 Colocar en el fondo del frasco: 0,4 mL de la solución salina bufferada
 Añadir 0,5 mL de antígeno sobre la solución salina ya medida, mientras
simultáneamente se da al frasco un movimiento de rotación sobre una superficie lisa
 La mezcla debe efectuarse en 6”
 Soplar la última gota de antígeno y continuar rotando durante 10”
 Agregar 4,1 mL de solución salina con una pipeta de 5 mL
 Tapar el frasco y agitar vigorosamente durante 10”. La emulsión de antígeno así
preparada se puede usar durante un día
C. Verificación de la Prueba
 Colocar en la lámina excavada 0,05 mL de suero problema ya inactiva
 Añadir una gota de la emulsión de antígeno usando para este fin la jeringa que lleva
la aguja Nº 22 con el bisel dirigido hacia abajo y en posición horizontal
 Llevar las láminas al rotador de Manzini durante 4’
 Hacer la lectura de la prueba inmediatamente
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D. Lectura e informe de los resultados

Se realiza microscópicamente a 100X

Resultados e interpretación:
NO REACTIVO: Ausencia de grumos
REACTIVO: Grumos grandes, medianos o pequeños.

REACCIÓN CUANTITATIVA
De todas aquellas pruebas cualitativas cuyo resultado haya sido positivo, se preparan
diluciones dobles del suero en cuestión que abarquen desde 1/2 hasta 1/1024 en solución
salina al 9,0%, se prueba cada una como si fuera una reacción cualitativa y se observa al
microscopio. El resultado será la mayor dilución del suero que de una reacción positiva,
debiéndose desechar aquellos positivos débiles ejemplo:
1/2 (P); 1/4 (P); 1/8 (PD); 1/16 (N); ……
P : positivo
PD : positivo débil
N : negativo
Resultado = Positivo 4 dilución o positivo 1/4
Cuando la reacción cuantitativa da un resultado negativo en todas las diluciones se
informará: POSITIVO EN SUERO SIN DILUIR

Realice la representación gráfica de lo realizado.

Cuestionario:
1. ¿Cuál es la composición química de la cardiolipina?
2. ¿A qué cree Ud. que se debe el que la emulsión final del antígeno sea turbio, mientras
que la solución madre es totalmente transparente?
3. ¿Puede presentarse en el V.D.R.L. una reacción de zona y como podría ser evitada?
4. ¿Por qué razón cuando un suero precipitante se diluye pierde rápidamente su título?