CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

INTRODUCCIÓN

Los métodos más usados en la separación de moléculas son la ultracentrifugación, la

electroforesis y la cromatografía (Cardella-Hernandez, n.d.). Esta técnica incluye una
serie de métodos analíticos de separación que tienen como característica general el
de estar constituidos por una fase estacionaria y una fase móvil, entre las que se
distribuyen diferencialmente las sustancias a separar. Cuando la fase móvil, la que
arrastra a las partículas que se van a separar, es un liquido (solvente o mezcla de
solventes) se denomina cromatografía de líquidos. Si la fase móvil es un gas se
denomina cromatografía de gases (Gonzales et al, 2008).

La cromatografía en papel (cromatografía en la que la fase estacionaria es papel), es

una técnica en la que se aplica un pequeño volumen de la muestra cerca de uno de
los extremos de una hoja de papel filtro. Este tipo de cromatografía puede ser
ascendente, en la que el papel se sujeta a la parte superior de la cámara y se
sumerge en el solvente, que se encuentra en el fondo, entonces el solvente se
mueve hacia arriba por capilaridad. Al realizarse la separación, los solutos de la
mezcla original migran a lo largo del papel con diferentes velocidades, dependiendo
de la solubilidad en el solvente. La relación de migración de una sustancia (Rf) puede
expresarse de acuerdo con la siguiente fórmula (Gonzales et al, 2008):

distancia recorrida por la muestra

Rf =
distancia recorrida por la mezcla eluyente

La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas pequeñas

como lípidos, nucleótidos, vitaminas, fármacos y aminoácidos; debido a que cada
sustancia exhibe un valor Rf particular, es posible separar aminoácidos y péptidos,
ya que estos presentan características particulares, de solubilidad, polaridad y
tamaño, por la composición química de sus grupos R (Koolman & Roehm, 2005).
OBJETIVO GENERAL

Determinar la presencia de un edulcorante artificial en una muestra problema

mediante su Rf, y ver sus propiedades de solubilizacion comparándolo con los Rf de
los aminoácidos que los componen.

OBJETIVOS PARTICULARES

- Separar aminoácidos y péptidos mediante el uso de la cromatografía en papel.

- Determinar el corrimiento cromatográfico de un aminoácido polar y uno no
polar, comparando el Rf de cada uno de ellos.
- Separar e identificar, por medio de la cromatografía en papel, el aspartame
presente en un refresco dietético, comparando su Rfcon el del Canderel.

HIPÓTESIS

Si se utiliza la técnica de cromatografía es posible separar las sustancias en sus

componentes esenciales.

MATERIAL Y MÉTODO
Primero, se recortó un rectángulo de papel de whatman con medidas de 20x9cm con
guantes de látex puestos para no contaminarlo. Enseguida se coloco encima de un
pliego de cartulina para su fácil manipulación.

Después, se marcaron seis puntos sobre el papel, los cuales se colocaron a un

centímetro de la base del papel y a unos 0.5 cm entre punto y punto,
aproximadamente. Posteriormente, en los espacios comprendidos entre cada punto
se pusieron las muestras de cinco sustancias diferentes: Fenilalanina, Acido
Apartico, Canderel, Refresco Normal (sin colorante) y Refresco de Dieta (sin
colorante).

Estas muestras se tomaron con un capilar para cada substancia y se pusieron cinco
gotas de cada solución entre cada espacio del papel (entre cada aplicación de las
muestras se secaba con una secadora).

Después se coloco dentro de la cámara para cromatografía que tenía una mezcla
eluyente de Butanol, Acido Acético y agua, que se encontraba dentro de la campana
de extracción con una parrilla magnética con una temperatura de 250C, ahi se dejo
por una hora y media aproximadamente.

Después se marcó con un lápiz hasta donde llego la fase móvil en el papel de
whatman, enseguida se dispuso a dejar secar dentro de la campana de extracción y
con una parrilla eléctrica se mantenía la temperatura deseada.

En el momento en el que se seco se aplico ninhidrina con un atomizador para poder

revelar el lugar donde se encontraban las muestras, solo hasta donde se marco con
el lápiz.

RESULTADOS
En el corrimiento cromatográfico (figura 1) se observan 5 bandas teñidas de color
purpura correspondientes a las 5 muestras utilizadas, en las cuales es posible
identificar manchas de diferentes tamaños y a diferentes distancias.

Figura 1: Corrimiento cromatográfico. De izquierda a

derecha: Fenilalanina, ácido aspartico, refresco dietético
y no dietético y Canderel. Pueden observarse manchas
de diferentes tamaños y distancias recorridas diferentes,
lo que permite calcular el Rf de cada una de ellas.
De acuerdo a la relación de migración para las sustancias aquí utilizadas
(aminoácidos, refrescos y canderel) se obtuvieron los valores de Rf para cada una de
ellas utilizando la fórmula siguiente:

distancia recorrida por la muestra

Rf =
distancia recorrida por la mezcla eluyente

Como la distancia recorrida por la mezcla eluyente fue de 8.8 cm y las distancias
recorridas por las muestras fueron diferentes, los Rf quedan:

Tabla 1: valores de Rf para las muestras de aminoácidos, refrescos y canderel

Distancia recorrida por Distancia recorridas Rf de las

Muestras
la mezcla eluyente por las muestras muestras
Fenilalanina 7.0 cm 0.7955
Acido aspártico 1.5 cm 0.1705
1 cm 0.113636
Refresco
dietético 8.8 cm 3 cm 0.340909
Refresco no 2.5 cm 0.2840
dietético
3cm 0.340909
Canderel
8 cm 0.909090
R.F. de la sustancias trabajadas en el laboratorio

ANÁLISIS DE RESULTADOS
Ninguna muestra estudiada presentó el mismo Rf, ya que la tendencia relativa de las
moléculas en la mezcla (aminoácidos) para asociarse con mayor fuerza a una o a
otra fase no es la misma (Murray et al, 2007).

Aunque las muestras de canderel (aspartame, compuesto formado por fenilanina y

acido apartico) y del refresco dietético no tengan precisamente el mismo Rf, estas
presentan la misma tendencia a disociarse en dos manchas, la mancha con un valor
mayor de Rf parece ser la fenilalanina y la otra el ácido aspártico, tal como lo
muestran las dos primeras columnas de la imagen 1 del corrimiento cromatográfico
para la fenilalanina y el ácido aspártico, respectivamente. Puesto que los dos tipos de
refresco no presentan el mismo Rf, ni el patrón de disociación es el mismo, queda
determinado que el aspartame está presente en el refresco dietético, no así en el
refresco normal.

CONCLUSIÓN
Debido a que cada sustancia exhibe un Rf característico, diferente a las demás,
debido a sus propiedades de solubilizacion, es posible la separación de aminoácidos
presentes en muestras problema, como la fenilalanina y ácido aspártico, en forma de
aspartame, presentes en los refrescos dietéticos, mediante la técnica de la
cromatografía en papel.

BIBLIOGRAFÍA

- Cardella-Hernández. Bioquímica médica, tomo I: Biomoléculas. n.d.

- González-Soto, E.; L. Bucio-Ortiz; P. Damián-Matzumura; F. Díaz de León-
Sánchez; E. Cortés-Barberena; L.J. Pérez-Flores. (2009) Manual de
bioquímica 1. 3ª ed. México.
- Koolman, J. & K.H. Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry. 2ª edición.
Thieme. New York. EU.
- Murray, R. K.; D.K. Granner; V.W. Rodwell; P.A. Mayes (2007) Harper.
Bioquímica ilustrada. 14ª ed. México, Manual Moderno

ANEXO (CUESTIONARIO)

1.- ¿que son la fase estacionaria y la fase móvil de un sistema

cromatografico?
La fase estacionaria de una cromatografía, consta de un sólido o un líquido
adherido a un sólido, por el cual se hace pasar un fluido.

La fase móvil de una cromatografía, consta de un líquido o un gas que es capas

de moverse a través de la fase estacionaria, a diferentes velocidades
dependiendo de su afinidad.

Cromatografía sobre papel y capa fina.smith ivor.madrid,alambra.1979

2.- ¿como se puede modificar la fase móvil de un sistema cromatografico?
Dependiendo del eluyente que se utilice en la cromatografía, la fase móvil debe
elegirse de forma que se eluyan todos los componentes de la muestra y no se
produzca una acumulación en la base de la cromatografía.

Cromatografía sobre papel y capa fina.smith ivor.madrid,alambra.1979

3.- ¿Qué es el Rf de una sustancia?

Se define Rf como el cociente entre la distancia recorrida por una sustancia
desde el origen y la distancia recorrida del eluyente.

El Rf es una cifra útil porque es constante cuando se reproduce el experimento en

todas las condiciones además de ser tan característico y descriptivo de un
compuesto como puede serlo el punto de fusión. Por supuesto, el Rf de un
compuesto dado será diferente para distintos disolventes, pero ello constituye una
ventaja, puesto que así es posible caracterizar a un compuesto más
específicamente registrando sus Rf en varios disolventes.

Algunos factores que afectan al Rf son: el grado de pureza del adsorbente, la

concentración del ambiente de la cámara y la temperatura.

Cromatografía sobre papel y capa fina.smith ivor.madrid,alambra.1979

4.- investigue las características de los aminoácidos utilizados en esta

práctica y como se clasifican.

Aminoácidos Esenciales vs. No Esenciales

No esenciales Esenciales

Alanina Arginina*

Asparagina Histidina

Aspartato Isoleucina

Cisteina Leucina
 Glutamato Lisina

*Los aminoácidos arginina, metionina y fenilalanina se consideran esenciales por

razones no directamente relacionadas por la falta de síntesis. La arginina es
sintetizada por las células de mamíferos pero en un rango que es insuficiente
para resolver las necesidades de crecimiento del cuerpo y la mayoría que es
sintetizada es procesada para formar urea. La metionina es requerida en grandes
cantidades para producir cisteina, si el último aminoácido no es provisto
adecuadamente en la dieta. Igualmente, la fenilalanina se necesita en grandes
cantidades para formar tirosina, si este último aminoácido no es adecuadamente
provisto en la dieta.

La fenilalanina: Es un aminoácido esencial aromático (junto con el triptófano y la

tirosina) cuyo grupo R contiene un anillo bencénico (Ruta 2). Uno de los aspectos
más relevantes de su biosíntesis es el mecanismo a través del cual los anillos
aromáticos se forman a partir de precursores alifáticos. También se le clasifica,
junto con el triptófano, como un aminoácido hidrofóbico con estructura cíclica.
Según los últimos estudios sobre los aminoácidos esenciales parece que en la
fenilalanina, la estructura carbonada sería su parte considerada esencial ya que
esta estructura es transaminada con rapidez por el organismo.

La mayor parte de este compuesto se transforma, por medio de hidroxilación, en

tirosina que es otro aminoácido, en este caso considerado como semiesencial.

Además la fenilalanina es el precursor de las catecolaminas en nuestro cuerpo, si

bien acortamos el mecanismo en la síntesis de catecolaminas utilizando la
tirosina como precursor (ver Ruta 3). También es un constituyente importante de
los neuropéptidos cerebrales, como la somatostatina, vasopresina,
melanotropina, encefalina, ACTH, angiotensina, sustancia P y colecistoquinina.
Muchas drogas de las que conocemos como psicotrópicas, contienen fenilalanina.

La fuente más importante de fenilalanina son los alimentos ricos en proteínas,

como es la carne y los productos lácteos. La fenilalanina tiene utilidades en la
industria de la alimentación, por ejemplo, en la elaboración de edulcorantes
artificiales.

Acido aspártico: Aminoácido glucogénico (puede convertirse en glucosa y

glucógeno) cuyo grupo R posee carga negativa a pH 7,0. Se trata de un
compuesto muy hidrofílico, y como tal se encuentra casi siempre en la superficie
externa de las proteínas globulares. Es un compuesto metabólicamente activo
debido a su interconversión con los ácidos dicarboxílicos tetracarbonados del
ciclo de los ácidos tricarboxílicos, después de sufrir una transaminación. Es el
precursor de la asparagina. También interviene en otras reacciones como dador
de aminos en la síntesis de urea y de purinas, y como precursor de los anillos
pirimidínicos a través de la formación de carbamoilaspartato en el citosol. Es,
junto con el glutámico, el principal neurotransmisor excitatorio de la corteza
cerebral.

http://www.biopsicologia.net/fichas/page_592.html

http://themedicalbiochemistrypage.org/spanish/amino-acid-metabolism-sp.html

5.- investigar los Rf reportados en la literatura para los aminoácidos aquí

utilizados. Anote el sistema de fase móvil y fase estacionaria utilizado para
obtenerlos.

Rf de los aminoácidos de referencia

Aminoácido
Rf
Lisina 0.24
Ácido glutámico 0.47
Glicina 0.49
Cisteina 0.12
Serina 0.31
Metionina 0.59
Fenilalanina 0.66
Arginina 0.28
Valina 0.59
 Triptófano 0.60
Histidina 0.29
Treonina 0.39

http://www.doschivos.com/display.asp?ID=625&f=135478

6.- hacer una investigación sobre el uso actual del aspartame. Anote
posibles beneficios y perjuicios del uso de este producto.

Comunicado de la FDA sobre el Estudio Europeo de aspartame

CFSAN / Oficina de Seguridad Alimentaría de aditivos
20 de abril 2007

La FDA ha concluido su examen sobre el estudio de carcinogenicidad a largo

plazo de aspartame titulado, "a largo plazo de carcinogenicidad bioensayos para
evaluar el potencial de los efectos biológicos, en particular cancerígenos, del
aspartame administrado en la alimentación de ratas Sprague-Dawley", realizado
por el Ramazzini Europea Fundación (ERF), con sede en Bolonia, Italia. La FDA
revisó los datos del estudio puestos a su disposición por el ERF y considera que
no es compatible con la conclusión de la ERF que el aspartame es un agente
carcinógeno. Además, estos datos no proporcionan evidencia para alterar la
conclusión de la FDA que el uso del aspartame es seguro.

El aspartame fue aprobado por primera vez en los Estados Unidos en 1981 y es
uno de los edulcorantes artificiales más utilizados. Cuando metabolizado por el
organismo, el aspartame se descompone en dos aminoácidos comunes, ácido
aspártico y fenilalanina, y una tercera sustancia, el metanol. Estas tres sustancias
están en cantidades similares o mayores al comer alimentos comunes.

Al primero de aprendizaje de los resultados del estudio ERF, la FDA pidió a los
datos de la ERF para evaluar los resultados. El 28 de febrero de 2006, la agencia
recibió sólo una parte de los datos del estudio solicitado. En junio de 2006, la FDA
pidió ERF para proporcionar el resto de los datos del estudio solicitado
inicialmente y también se ofreció a revisar muestras de patología del estudio. ERF
no presentó datos adicionales a la FDA y no está de acuerdo a la revisión de la
FDA de las muestras de patología.

La FDA no pudo llevar a cabo una revisión completa y definitiva del estudio
porque ERF no proporcionó los datos del estudio completo. Con base en los
datos disponibles, sin embargo, hemos identificado deficiencias significativas en
el diseño, realización, presentación de informes, y la interpretación de este
estudio. La FDA considera que la fiabilidad y la interpretación de los resultados
del estudio se ve afectada por estas deficiencias y variables no controladas, tales
como la presencia de la infección en los animales de experimentación.

Además, los datos que fueron proporcionados a la FDA no parecen apoyar los
hallazgos relacionados con el aspartame informado por el ERF. Basado en
nuestra revisión, los cambios patológicos fueron incidentales y apareció
espontáneamente en el estudio, los animales, y ninguno de los cambios
histopatológicos informó parecen estar relacionados con el tratamiento con
aspartame. La FDA considera que una visión adicional sobre los resultados del
estudio podrían ser proporcionadas por una patología a nivel internacional de
trabajo respaldado por el examen conjunto de las muestras de tejido apropiado en
el estudio.

Teniendo en cuenta los resultados de la gran cantidad de estudios sobre la

seguridad del aspartame, incluyendo cinco con anterioridad a cabo estudios
negativos carcinogenicidad crónica, un estudio recientemente la epidemiología
grande con asociaciones negativas entre el uso de aspartame y la aparición de
tumores, y los resultados negativos de una serie de transgénicos tres ensayos del
ratón, la FDA no encuentra ninguna razón para modificar su conclusión anterior
de que el aspartame es seguro como edulcorante de uso general en los
alimentos.