UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA

Citometría de flujo: Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

Milena Salgado Lynn

Curso de Métodos en Biotecnología

Semestre 2002-2
Coordinador: Dr. Roberto Stock

27 de mayo de 2002
 Índice

Página

Introducción 3

Historia del Instrumento 5

Descripción y funciones de los componentes del aparato

Sistema de Flujo 7

Sistema Óptico 7

Sistema Eléctrico 8

Obtención de los datos e interpretación 10

Aplicaciones 12

Bibliografía 18

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Introducción

Actualmente, la mayoría de las preguntas en el campo de la biología celular se enfocan en

saber qué es lo que sucede con las células integrantes de un sistema, cómo son las
interacciones dentro del mismo y, sobre todo, cuáles son las propiedades individuales de
cada una. Estas preguntas han llevado a la necesidad de aislar y/o purificar
subpoblaciones y subcomponentes celulares, generalmente para (1) enriquecer poblaciones o
para (2) eliminarlas. Para alcanzar estos objetivos, el primer paso en el proceso de
aislamiento es la identificación y clasificación de las células. La clasificación de las
células puede basarse en propiedades fisicoquímicas, inmunológicas y funcionales. Los
métodos de clasificación que se basan en propiedades funcionales utilizan características
tales como afinidad, adherencia o crecimiento. La clasificación inmunológica se basa en la
utilización de anticuerpos dirigidos contra epítopes celulares. En la práctica, las
características fisicoquímicas son las más utilizadas para la separación o “sorteo celular”;
se incluyen características como tamaño, volumen, densidad, propiedades de dispersión de
la luz, potencial de membrana, pH, carga eléctrica y contenido celular de diferentes
compuestos como ácidos nucléicos, enzimas y otras proteínas (Orfao, et.al.; 1996).

En los últimos años ha habido un incremento en las técnicas que utilizan más de una
característica celular para clasificar y separar diferentes subconjuntos celulares y
componentes subcelulares. Estas técnicas pueden agruparse básicamente en (a) separación
gruesa y (b) separación de células individuales. La separación gruesa se refiere a métodos
tales como la filtración celular, la centrifugación o sedimentación y el cultivo celular. La
separación de células individuales se refiere principalmente a la citometría de flujo que,
enriquecida con el “sorteo celular”, es la mejor técnica para proveer información en cuanto al
análisis y separación de poblaciones celulares.

La citometría de flujo es un proceso que permite que las células (500 – 4000/ seg) pasen en
fila dentro de un flujo a través del aparato (Beckton Dickinson Immunocytometry
Systems; 1995). Mientras esto sucede, se puede hacer la medición simultánea de múltiples
características físicas de una sóla célula. La ventaja analítica de la citometría de flujo tiene

3
como base la habilidad de hacer mediciones cuantitativas y multiparamétricas en un
número estadísticamente adecuado de células para definir las propiedades de una población
celular o de las subpoblaciones que la componen. El análisis multiparamétrico hace posible
evaluar poblaciones celulares particulares dentro de una mezcla compleja, ya que aprovecha
propiedades intrínsecas de la célula como la dispersión de la luz, y características
controladas como la fluorescencia. Al mismo tiempo, es posible separar las poblaciones
definidas por éste análisis (Parks D.R., et.al.; 1984). Estas ideas son la base de la técnica
conocida como FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting).

El FACS proporciona datos tales como el tamaño relativo de la célula, granularidad o

complejidad interna y la intensidad relativa de fluorescencia. Para llevar a cabo lo anterior,
el aparato necesita (como cualquier citómetro de flujo) de un sistema combinado de flujo,
óptica y electrónica (Figura 1). El sistema de flujo introduce y restringe a las células para
su análisis individual, el sistema óptico excita la muestra y colecta las señales de luz
provenientes de la misma y el sistema electrónico convierte la señal óptica en una señal
electrónica y la digitaliza para el análisis en computadora (Beckton Dickinson
Immunocytometry Systems; 1995). El sistema de citometría de flujo está compuesto por
cinco unidades principales: una fuente de luz (lámpara de mercurio o láser), flujo celular,
unidad de filtros ópticos para la detección de longitudes de onda específicas, fotodiodos o
fotomultiplicadores para la amplificación de la señal y una unidad de operación y
procesamiento de datos.

El funcionamiento del FACS es relativamente sencillo y se describe, brevemente, a

continuación. Una suspensión celular se inyecta al flujo laminar donde las células pasan
una después de la otra a través de un capilar y llegan hasta un rayo láser. Cuando este
rayo incide en una célula, la luz de excitación sale hacia delante y hacia los lados de la
célula y esto genera información. La luz dispersada hacia delante provee información sobre
el tamaño de la célula. La luz dispersada hacia los lados provee información sobre la
granularidad, tamaño y morfología celular. Si la célula va marcada con un fluoróforo, la
luz fluorescente se procesa, a través del fotomultiplicador, en el sistema procesador de datos
y los resultados son analizados por el software del citómetro. El FACS posee una unidad de

4
“sorteo” que ofrece la posibilidad de separar subpoblaciones seleccionadas. Las células se
cargan eléctricamente y las gotas resultantes se desvían al pasar a través de un campo
eléctrico. ¿Cómo sucede todo esto y cuáles son las bases de esta tecnología?

Cristal Piezoeléctrico

Reservorio
Presurizado Señal Analizador de
De Células electrónica Pulsos y
Contador
(Procesamiento
Pulsos
de datos)
De carga
Reservorio Presurizado
De flujo externo
Flujo Filtros
celular ópticos

Fotomultiplicador

- 1kV + 1kV

Láser
(fuente de luz) Colector de células

Figura 1. Esquema generalizado de los componentes de un citómetro-sorteador; la función de los componentes,

el procesamiento de la señal y la electrónica detrás del sorteo se describen más adelante en el texto (Bonner WA,
et.al.; 1972)

Historia del Instrumento

El FACS nació en el laboratorio de L.A. Herzenberg en 1968, se le llamó así por primera vez
en 1972, y se basó en las técnicas de separación de Sweet y en el sistema de flujo coaxial de
Crossland-Taylor (Bonner W.A., et.al.; 1972). Los instrumentos para medir y contar en
un flujo se tenían desde mediados del siglo pasado, pero la reproducibilidad y la confianza
en los resultados no se alcanzó sino hasta que se aplicó un flujo laminar que guiaba la
corriente de células en un flujo estable y por un canal relativamente largo (Crossland-
Taylor P.J.; 1953). Para ese entonces ya se habían desarrollado sistemas basados en la
microscopía para medir la dispersión y absorción de la luz, así como la fluorescencia usando
iluminación de mercurio y el principio de epifluorescencia. En 1965, Sweet desarrolló la
inyección de tinta y con ella surgió la idea del sorteo electroestático, estabilizando la

5
formación y carga eléctrica de gotas individuales (Sweet R.G.; 1965). En cuanto a
tecnología de fluorescencia, en 1961 Moller demostró que las células vivas de cultivos en
suspensión podían marcarse específicamente con anticuerpos conjugados a fluoresceína
(Coligan, J.F., et.al.; 2001).

Estas técnicas se conjuntaron y dieron origen al FACS. El láser se introdujo al FACS

después de los resultados de Van Dilla et.al. en 1969, además se introdujeron medidas
ópticas en el flujo del sorteo en vez de en el flujo celular y en 1972 se añadió un canal para
la dispersión de la luz del láser que hizo posible la detección de células no fluorescentes y
que ha servido para medir el tamaño de la célula y para discriminar entre vivas y muertas.
El primer instrumento comercial de esta naturaleza fue el FACS I de Becton Dickinson y se
basó en el sistema descrito (Parks D.R., et.al.; 1984). A partir de ahí, se han introducido
pocos cambios que tienen que ver con las mediciones multiparamétricas y con la generación
de softwares de análisis más sofisticados y potentes.

Originalmente, el FACS medía sólo un tipo de fluorescencia pero conforme se desarrollaron

nuevos fluoróforos y se mejoró la producción de anticuerpos monoclonales, se abrieron
nuevas perspectivas en cuanto a la capacidad de detección del aparato. En el laboratorio de
Herzenberg, la habilidad de acoplar los anticuerpos monoclonales a diferentes fluoróforos
generó la inquietud de hacer análisis multicolores por lo que se adaptó el aparato para poder
hacer lecturas de dos diferentes espectros de emisión a partir de un mismo rayo láser. La
aparición de mejores monoclonales y mejores fluoróforos estimuló el desarrollo del FACS de
doble láser ya que se volvió interesante aumentar el número de marcadores que podían
medirse simultáneamente en una sóla célula. Actualmente, los FACS de un sólo láser se
utilizan para medir tres diferentes anticuerpos marcados con diferentes fluoróforos y los
FACS de doble láser se usan para medir hasta 5 colores de fluorescencia al mismo tiempo.
Además, el mismo grupo, desarrolló recientemente un aparato con tres lásers que permite la
medición simultánea de hasta 11 colores de fluorescencia (Herzenberg L.A., et.al.; 2000).

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Descripción y función de los componentes del aparato

Sistema de flujo
El sistema de flujo del FACS posee un capilar a través del cual se hace pasar un líquido
isotónico, a manera de una funda, con una velocidad y presión constante; estas
características son necesarias para la formación de un flujo laminar (sin turbulencia). Al
mismo tiempo, por el centro del capilar se hace pasar la suspensión celular, con
aproximadamente de 5 x 105 a 2 x 107 células/mL y a una presión mayor que la del flujo
acarreador. Este enfoque hidrodinámico (Figura 2) se asegura de que las células
permanezcan centradas y viajen una tras otra en el chorro de inyección. Este
confinamiento es necesario para hacer mediciones precisas, es decir para el análisis
individual de las células (Bonner W.A., et.al.; 1972. Beckton Dickinson
Immunocytometry Systems; 1995).
Muestra
Flujo acarreador

Fig. 2. Sistema de flujo del FACS. La muestra pasa

por un flujo laminar producido por otro líquido Capilar
isotónico y esto hace que las células viajen
ordenadas una tras otra. Enfoque hidrodinámico

Sistema óptico
La fluorescencia y la luz dispersada se producen cuando una célula contenida en el líquido
inyectado pasa por el rayo enfocado de un láser (Figura 3). La luz dispersada hacia el
frente es colectada por un detector que capta la luz difractada entre 1 y 10º arriba o abajo del
punto de incidencia del láser. La luz dispersada lateralmente y la fluorescencia son
colectadas por un lente que está a 90º del eje de incidencia del láser. Esta luz lateral y la
fluorescencia son divididas por un “beamsplitter” (Divisor del rayo) para separar entre la luz
difractada y la fluorescencia. La fluorescencia es a su vez dividida por un espejo dicróico
que permite distinguir entre diferentes longitudes de onda. Cada detector de fluorescencia
tiene otros filtros ópticos para excluír la luz del láser dispersada y para dejar pasar la luz con
la longitud de onda deseada para ese detector (Bonner W.A., et.al.; 1972. Park D.R., et.al.;
1984).

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 Detector de
Fluorescencia 1

Detector de Filtro
Fluorescencia 2
Espejo Dicróico
Filtro

Detector de
Luz dispersa Divisor del Rayo
lateral
Lente colector
Expansor
Del rayo
Rayo Detector de
láser Lente de Luz dispersa
enfoque frontal

Punto de enfoque
(célula)
Fig. 3. Sistema Óptico del FACS. El láser incide en la célula y esta dispersa la luz de manera lateral y frontal
al tiempo que emite fluorescencia. La luz y la fluorescencia son detectadas por separado (Beckton Dickinson
Immunocytometry Systems; 1995. http://www.icnet.uk/axp/facs/davies/flow.html).

Sistema eléctrico
Para la obtención física de las poblaciones celulares, es necesario que las células vayan en
gotas aisladas y con un marcaje que permita distinguir y separar una población de otra.
Cuando una célula atraviesa el rayo láser, se ilumina por varios microsegundos y durante
ese tiempo emite un pulso fluorescente. Si este pulso cae en los límites de amplitud
predeterminados, se genera eléctricamente un pulso cargado. Este pulso toma en cuenta la
demora que hay entre el evento de la célula estando incidida por el láser y la célula estando
en el lugar donde debe formarse la gota. Este pulso llega a un cristal piezoeléctrico que está
conectado a la estructura por la que pasa el capilar. Este artefacto se expande y contrae
ligeramente cuando se aplica un voltaje y este movimiento guía a un oscilador que hace
vibrar la estructura por donde pasa el capilar. La vibración lleva una frecuencia cercana a la
frecuencia con la que naturalmente el flujo se rompe en una gota. Esto estabiliza la
formación de la gota en esa frecuencia, resultando en una gota de tamaño uniforme y una
demora de tiempo bien definida entre la detección de una célula por el rayo del láser y la

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incorporación de la célula a una gota libre. Si la célula se va a sortear, un potencial en el
orden de los 100 V se aplica, mediante un electrodo, al fluido (isotónico) que va dentro del
capilar. La conductividad eléctrica del fluido asegura que cualquier gota que se separa de la
inyección, mientras se aplica el voltaje, llevará una carga eléctrica. La duración del voltaje
aplicado se escoge para cargar una o más gotas que puedan contener a la célula deseada. Se
pueden sortear dos poblaciones de células al mismo tiempo al aplicar una carga positiva a
gotas que contengan una población y una carga negativa a gotas que contengan otra
población. La hilera de gotas pasa entre dos placas cargadas a más o menos varios miles de
volts, separando las gotas cargadas de las no cargadas. Las gotas que no se desplazan se
remueven por una aspiradora y las que se desplazan se colectan en los recipientes adecuados
(Figura 4a) (Bonner WA, et.al.; 1972. Park DR, et.al.; 1984).

El sistema electrónico también está involucrado con la amplificación de las señales que
salen de los detectores, tanto de fluorescencia como de luz dispersa, y con el procesamiento de
los datos para su evaluación (Fig. 4b)

a) F1
F2
Cristal Dispersión (D)
Piezoeléctrico
Señal para la
Formación de la gota
Fotomultiplicador
Fluorescencia 2 (F2) Muestra
Líquido acarreador

Señal para carga

Capilar De la gota

Detector de
Fotomultiplicador Luz dispersa
Fluorescencia 1 (F1)

Rayo
de Placas
láser separadoras

Aspiradora

Muestras
separadas

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 b) F1
Amplificadores Sistema
F2 Lineales y/o Almacenamiento De
Logarítmicos de En computadora y presentación
D La señal Análisis

F1 F2 D

Evaluación Digitalización Decisión

De señal Análoga o
análoga Sorteo digital

Señal para formación de gota

Oscilador

Coincidencia y
Señal para Amplificador de Cronometraje de la
La carga de Carga de la gota
Carga de gota La gota

Fig. 4. Sistema eléctrico del FACS. a) Las señales luminosas son colectadas y transformadas en pulsos
eléctricos que regresan a la estructura central y forman y dan carga eléctrica a la gota; al estar cargadas las
células pueden separarse. b) Procesamiento de las señales luminosas en las señales eléctricas necesarias para la
separación de las muestras y su análisis (Parks DR, et.al.; 1984).

Obtención de los datos e interpretación

El aparato de FACS va acompañado por una computadora que adquiere los datos
proporcionados por el sistema eléctrico y hace una presentación gráfica. La computadora
produce un histograma o un despliegue de dos parámetros (dot plot o contour plot) a partir de
la luz dispersada por las células o a partir de la fluorescencia (Fig. 5). El análisis de los
datos generalmente se complica porque el volumen de la muestra puede ser variable y por la
complejidad de ésta, por lo que es escencial que la forma de interpretación se diseñe
específicamente para contestar a las preguntas que se formularon en la investigación. Sin
embargo, existe una interpretación generalizada para este tipo de gráficas y aquí se muestra
un ejemplo.

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 Rojo

a) b) c)

Fig. 5. Interpretaciones gráficas por el Software del FACS. a) Histograma. b) Dot Plot. c) Contour Plot.
(http.//www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/FACS.html. Coligan, J.F., et.al.; 2001)

En la figura 5a tenemos representada en el eje de la abscisa la intensidad de la fluorescencia

roja o verde y en la ordenada tenemos el número de células con cada nivel de fluorescencia.
En esta figura podemos ver que hay el doble de células clasificadas como rojas que de células
clasificadas como verdes o como células sin fluorescencia, sin embargo, la intensidad de luz
fue mayor en las células “verdes” que en las células “rojas”. Este despliegue de datos es el
mejor si las células son “rojas”, “verdes” o no marcadas y ninguna tiene una doble tinción.
En el eje de las X de la figura 5b tenemos la intensidad de la fluorescencia verde y en el eje
de las Y tenemos la intensidad de la fluorescencia roja. Los puntos individuales representas
células individuales y la idea es ver la densidad relativa de los puntos en cada cuadrante.
De esta gráfica se puede concluir que no hay células marcadas doblemente (cuadrante
arriba-derecha) y que había muchas células no marcadas (abajo-izquierda). El número de
células marcadas con un fluoróforo de emisión en verde (abajo-derecha) es más o menos el
mismo que el de células no marcadas, también vemos que el número de células marcadas
con un fluoróforo de emisión en rojo es casi el doble que el de las otras dos categorías (arriba-
izquierda). Aquí también se puede ver que la intensidad de las “verdes” fue mayor que la
de las “rojas”. Este método es muy útil cuando ha habido una doble tinción, el cual es el
caso en la figura 5c. En esa figura, el cuadrante de arriba a la derecha presenta una
población muy pequeña (2.1%) de células marcadas doblemente. Los porcentajes
presentados en la figura 5c son determinaciones de frecuencia que muestran el número de

11
células que presentan una característica definida (Coligan, J.F., et.al.; 2001.
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/FACS.html).

En la interpretación de estos resultados, el establecimiento de controles negativos y positivos

es crítico, ya que definirán la localización de la población de interés. Por ejemplo, si se
quiere distinguir una población de células positiva para cierta fluorescencia, el límite
mínimo del área de interés deberá definirse de manera que incluya únicamente a ese típo de
células. Para lograr esto, es necesario tener un control positivo que sirva como base para la
definición del área positiva. Si el límite mínimo se establece cerca de la zona donde se
encuentran las células negativas, la frecuencia de las positivas podría sobreestimarse o
subestimarse dependiendo de la señal de fondo que den los marcadores. Después de tener
todos los controles positivos se pueden seleccionar ventanas donde se analicen experimentos
individuales (Coligan, J.F., et.al.; 2001).

Aplicaciones

En general, el FACS se utiliza para analizar y separar células según características

definidas. En un principio el FACS se utilizó para analizar células linfoides murinas,
especialmente para separar entre células B y células T y para ver su viablilidad. También se
utilizó para aislar poblaciones que estaban involucradas en la respuesta inmune y que
estuvieran funcionalmente activas (Julius, M.H., et.al.; 1975). Actualmente, el desarrollo
y uso de anticuerpos monoclonales específicos para moléculas de superficie hacen posible la
definición y estudio de subpoblaciones de linfocitos que no son posibles utilizando otras
técnicas.

Además del análisis de linfocitos específicos, el FACS se ha vuelto una herramienta en la

farmacología, la toxicología, la bacteriología, virología, ciencias ambientales y en el
monitoreo de bioprocesos. A través de la dispersión de la luz, la fluorescencia y la
absorbancia de las células teñidas o no teñidas, se pueden medir un gran número de
parámetros celulares (Tabla 1).

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Con respecto a la medición utilizando la luz dispersada, en el citómetro, la luz que se
dispersa hacia el frente se utiliza para determinar el tamaño de la célula. Para lograrlo se
necesita calibrar el aparato con cuentas de poliestrireno que tengan tamaños definidos.
Aún así, el error puede ser grande ya que las mediciones están influenciadas por el índice
de refracción de las partículas. Además de medir el tamaño, se pueden combinar otras
características para determinar a un grupo de células. Por ejemplo, se han monitoreado
juntos el tamaño y el contenido de DNA en cultivos de E. coli, así como también se han
monitoreado al mismo tiempo el tamaño y la producción de CO2 en cultivos sincronizados
de Saccharomyces cerevisiae. En estudios como el último que se menciona, los tamaños
muestran la distribución de subpoblaciones de células madre en un ciclo del cultivo
sincronizado (Rieseberg, M., et.al.; 2001).

Características celulares Componentes celulares

Tamaño DNA
Granularidad del citoplasma RNA
Forma de la célula Proteína (total)
Potencial de membrana Lípidos
pH intracelular Antígenos
Viabilidad Actividad enzimática
Autofluorescencia Carbohidratos de superficie
Estado Redox intracelular Receptores de superficie
Contenido de PHB
Calcio intracelular
Contenido de ergosterol
Tabla 1. Características y componentes celulares que pueden determinarse vía FACS (Rieseberg, M., et.al.;
2001)

La mayoría de las aplicaciones de la citometría de flujo se basan en el monitoreo de la

fluorescencia. Los parámetros celulares que pueden medirse se caracterizan en extrínsecos o
intrínsecos, dependiendo del reactivo que se necesite. Para los ensayos de fluorescencia
intrínseca no se necesita un pretratamiento como fijación, tinción o lavados. Los estudios
sobre componentes celulares específicos utilizando fluoróforos (fluorescencia extrínseca)
requieren una tinción previa al análisis de las células. En la tabla 2 se muestran los
fluoróforos más comunes para tinciones específicas en el FACS.

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 Fluorocromo Longitud de Longitud de Aplicación principal
excitación (nm) emisión (nm)

BCECF-AM 503 528 (pH 9.0) pH intracelular

DAPI 345 455 Ácidos nucléicos

DiOC6(3) 484 501 Potencial de membrana

EGFP 489 508 Productos intracelulares

FITC 495 519 Detección de proteínas

Hoechst 33342 343 483 Ácidos nucléicos

Nile Red 540 610 Lípidos

PerCP 490 675 Conjugado de anticuerpos

Ioduro de Propidio 536 617 Ácidos nucléicos

R-Ficoeritrina 480, 565 578 Conjugado de anticuerpos

SNARF-1 AM 548 635 Potencial de membrana

Sytox Green 490 525 Ácidos nucléicos

Tabla 2. Fluorocromos más utilizados en FACS, aplicación más común, y longitudes de emisión y excitación.
(Rieseberg, M., et.al.; 2001. http://www.icnet.uk/axp/facs/davies/multi.html)

Algunas de las aplicaciones más comunes utilizando fluoróforos son la viabilidad y el

estado fisiológico, la apoptósis, el análisis del ciclo celular y el contenido de ácidos nucléicos,
el crecimiento celular y los índices de mortalidad y la concentración de calcio intracelular.
La concentración de células viables en un cultivo es uno de los parámetros más importantes
en la evaluación de bioprocesos. Una de las formas de evaluar la viabilidad es determinar la
integridad de la membrana y para ello existen colorantes de exclusión o colorantes de
retención. Los colorantes de exclusión tiñen los ácidos nucléicos de las células con
membranas defectuosas y los de inclusión generalmente utilizan sustratos fluorescentes
que son degradados por las enzimas intracelulares y que generan productos fluorescentes.
Como indicador del estado fisiológico puede usarse el pH intracelular ya que es un factor
importante para la regulación de diferentes procesos celulares y para la actividad metabólica
de células en cultivo. Existen derivados de diacetato de fluoresceína y ciertos sustratos
fluorescentes que se utilizan para medir el pH intracelular como el BCECF-AM y la
Calceína-AM. Otro indicador de daño celular es el potencial de membrana. Los cambios de

14
intensidad de la fluorescencia relacionada al potencial de membrana se han utilizado para
detectar e indicar daño fisiológico en bacterias (Rieseberg, M., et.al.; 2001).

En los estudios sobre apoptosis, se han utilizado conjugados fluorescentes de Anexina-V ya

que este anticoagulante es una proteína que se une a fosfolípidos, especialmente a fosfatidil
serina. Uno de los indicadores de apoptosis es la externalización de fosfatidil serina porque
este fosfolípido se encuentra en la cara interna de la membrana de células normales,
mientras que en células apoptóticas se transloca hacia la cara externa. De esta manera, la
diferencia en intensidad de fluorescencia de los complejos de anexina-V – fosfatidil serina
entre células apoptóticas y normales puede detectarse por medio del FACS. Para el estudio
del ciclo celular, se utilizan colorantes para ácidos nucléicos como el ioduro de propidio, el
Sytox Green, Hoechst, etc. En aplicaciones biotecnológicas, el análisis del ciclo celular y de
RNA se han utlizado para monitorear el estado fisiológico y el comportamiento de
crecimiento de varios microorganismos en cultivo. Los índices de crecimiento celular
pueden medirse usando bromodeoxiuridina (BrdU – análogo de Timidina) y una tinción
con ioduro de propidio. Las células que están sintetizando DNA incorporan BrdU y con
anticuerpos fluorescentes específicos contra esta base se hace la detección. Después de eso, se
hace una tinción con ioduro de propidio para medir el contenido total de DNA. Los índices
de mortalidad de una población pueden determinarse usando un método basado en la
exclusión de ioduro de propidio según la integridad de la membrana. Con respecto a la
concentración de calcio intracelular, se han desarrollado colorantes para medir calcio y su
aplicación ha sido principalmente clínica (Rieseberg, M., et.al.; 2001). En general, hay un
gran número de aplicaciones del FACS para el área de biotecnología y se resumen en la
tabla 3.

Aplicaciones Énfasis Microorganismo/

Célula
Contenido de DNA Control de productividad CHO
( ciclo celular) Control de productividad BHK
Investigación de Mecanismos S. cerevisiae
Relación Ciclo celular/IgG de superficie Hibridoma
Proliferación S. cerevisiae

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 pH intracelular
Tamaño celular
Contenido de RNA
Proteína total
Investigación de PHB
Productos intracelulares
Apoptosis
Calcio Intracelular
Potencial de membrana
Viablilidad
Tabla 3. Resumen de aplicaciones del FACS en el área de biotecnología (Rieseberg, M., et.al.; 2001)
Estudios de apoptósis Hibridoma
Validación de metodologías Hibridoma
Monitoreo del cultivo S. cerevisiae
Monitoreo del cultivo E. coli
Estudios de apoptosis Células de mamífero
Producción de goma Xantana Xantomonas campestris
Monitoreo del cultivo s. cerevisiae
Producción de goma Xantana X. campestris
Limitación y exceso de sustrato Ralstonia eutropha
Acetinobacter calcoacetius
Methylobacterium rhodesianum
Optimización de la produccion de Ab Hibridoma
Comparación de GFP mutantes CHO
Anexina-V CHO
Toxicidad H2Os Lineas celulares de mamífero
Pruebas de daño en bacterias Acinetobacter calcoaceticus
Comparación de diferentes cromóforos para el U937
potencial de membrana mitocondrial
Esterasa Linfocitos
Pruebas de suceptibilidad a antibióticos Bacterias
Efecto de metales pesados A. johnsonii
Limitación de glucosa E. coli

De 1972 a la fecha, se han ampliado las aplicaciones del FACS y han dado base a nuevas
ideas como es la tecnología de las microesferas o el MACS (Magnetic-Activated Cell
Sorting). Además de células se pueden analizar microesferas, o micropartículas, que lleven
un marcaje fluorescente. Estas microesferas se utilizaron en un principio para estudiar la
fagocitósis de macrófagos y ahora se utilizan para detectar proteínas virales, como
estándares de calibración para análisis cuantitativos y para estudios de cinética enzimática
en tiempo real. Como la mayoría de las microesféras son paramagnéticas, se pueden
inmobilizar en un campo magnético fuerte (MACS) y durante el tiempo que están
inmobilizadas dan tiempo a procesos de lavado o liberación de sustancias, lo que es
interesante para el estudio de ácidos nucléicos y otros componentes(Wedemeyer, N., et.al.;
2001. Scheffold, A., et.al.; 2000).

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De 1968 a la fecha, el FACS ha crecido como instrumento y como método gracias al impulso
que han dado los usuarios de esta tecnología. Este aparato, que medía sólo tres parámetros y
era usado sólo en la inmunología, ahora ha llegado a niveles de complejidad que parecen
difíciles de superar, ya que pueden medirse hasta 13 parámetros diferentes y ha encontrado
aplicaciones en casi todas las áreas de la biotecnología. De hecho, las nuevas aplicaciones
están limitadas por la imaginación de los investigadores y por el desarrollo de nuevos
anticuerpos, fluoróforos y sustratos fluorescentes que permitan detectar nuevos
componentes celulares. En definitiva, las ventajas que ofrece el FACS en cuanto a la
separación de componentes subcelulares o subpoblaciones celulares son difíciles de superar
ya que, además de hacer la separación física de las células de interés, se puede hacer una
medición cuantitativa y multiparamétrica de ciertas características celulares en una
mezcla compleja y estadísticamente adecuada de células. En general, el FACS es una
herramienta muy útil que puede dar muchos más datos sobre las poblaciones celulares y que
no ha llegado al límite de su aplicabilidad.

17
Bibliografía
Beckton Dickinson Immunocytometry Systems. 1995. FACS Training Manual.
Modulos: 1, 5-6.
Bonner, W. A.; Hulett, H.R.; Sweet, R.G. y Herzenberg, L.A. 1972. Fluorescence Activated
Cell Sorting. The Review of Scientific Instruments, 43(3): 404-409.
Coligan, J.F.; Kruisbeek A.M.; Margulies, D.H.;Shevach, E.M.; Strober, W. 2001. Current
Protocols in Immunology. National Institutes of Health. Ed. John Wiley & Sons, Inc.
Capítulo 5: Cell Sorting.
Crossland-Taylor, P.J. 1952. A Device for Counting Small Particles Suspended in a Fluid
through a Tube. Nature, 171: 37-38.
Herzenberg, L.A.; De la Rosa, S.C.y Herzenberg, L.A. 2000. Monoclonal Antibodies and
the FACS: complementary tools for the immunobiology and medicine. Immunology
Today, 21(8): 383-390.
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/FACS.html
http.//www.icnet.uk/axp/facs/davies/flow.html
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