Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Madrid, 2009
Madrid, 2008
Universidad
Complutense
de Madrid
Departamento Facultad
de Qumica de Ciencias
Analtica Qumicas
Todocomenzhaceseisaos,allporel2002,cuandoenquintodecarrera
decidcogerlaasignaturaProyecto,enaquellosmomentossentalacuriosidadde
conocerloqueeratrabajarenunlaboratoriodeInvestigacin.Lorecuerdocomo
sifueraayercuandoAracelimefuepresentandoacadaunadelaspersonasque
unoyquetcnicaempleaba.Todomesonabararsimo,peroasuvezmesupona
ungranreto,debaaprendercadaunadeesastcnicasqueseempleaban,utilizar
cadaunodeesosaparatosqueparecantandistintos,ydisearunosdispositivos
que fueran capaces de medir concentraciones muy bajas con el fin de obtener
buenosresultados,queenunfuturopodranpublicarse.Eracomounjuego,enel
dependiendodeuntalndicedeimpacto.
En estos momentos parece como si el juego que comenc hace seis aos
llegar a su final, sintiendo por un lado una gran alegra porque por fin veo
reflejado todo el esfuerzo realizado durante este tiempo, y por otro miedo e
incertidumbreporlasdecisionesqueahorahedetomar.
Duranteestetiempohansidomuchoslosmomentosbuenosquehevivido,
perotambinhahabidomomentosdedesesperacinydeagobio,sintindomeen
ocasiones como en un tiovivo con los altibajos que ello conlleva. An as, me
quedo con un buen recuerdo, porque tanto en los buenos como en los malos
momentossiemprehepodidocontarcondiferentespersonas,capacesdealegrarse
queparecanimposibles.Porestemotivo,megustaraagradeceratodoslosque
deunamanerauotrahanestadoamiladoduranteestetiempoysinloscuales
palabras.
Por ello, me gustara agradecer a mis directores de Tesis la Dra. Araceli
dedicacin durante este tiempo, sin la cual no hubiera sido posible sacar esta
Tesisadelante.
Ana, Bea, Loli, Susana, Mara, Javi, Vane, Oscar y Marcos, por toda vuestra
ayudaycomprensinporquesindudasoislosquemejorentendislosaltibajos
que una Tesis conlleva, y sobretodo por haberme demostrado que no slo sois
compaerosdetrabajo,sinoamigosconlosquesiemprepodrcontar.Muchas
graciasatodos!!
A Lourdes, por aportar sus toques de creatividad a esta Tesis, por sus
ayudarme.
sacarmesiempreunasonrisayporhacermeverlopositivodelascosas.
empezamoslacarrera.Lastreshemosseguidocaminosidnticos,porloquecasi
noshemosvueltoinseparables.Juntashemoscompartidomomentosinolvidables
yseguiremoscompartiendoyaquedesdehaceapenasunosmesessoistestigosde
todosmispasos,ggg.
Amisamigosdelpueblo,especialmenteaDavid(elchirri),Asun,Alberto
(tamayito), Esther (ricillos) y a Juanje (mi cuaooo) por todos los buenos
momentos que hemos compartido, por haber crecido juntos y poder contar
siempreconvosotros.
Amispadresyhermana,portodosuapoyoycarioalolargodemivida,
momentosdeagobioenlosquemevuelvoinsoportable.Osquiero!
mi lado, por hacerme sonreir incluso en los malos momentos y por la vida que
juntosvamosacompartir(Twop).
Yporltimo,agradeceralMinisteriodeEducacinyCiencialaconcesin
delabecaPredoctoraldeFormacindePersonalInvestigadoryalafinanciacin
delProyectoBQU:200300365.
Pgina
I.INTRODUCCIN
I.2. CARACTERSTICASGENERALESDELAS
NANOPARTCULASDEORO .............................................................7
I.3. ELECTRODOSMODIFICADOSCON
NANOPARTCULASDEORO .............................................................13
I.4.BIOSENSORESELECTROQUMICOSBASADOSENEL
EMPLEODENANOPARTCULASDEORO(nAu).........................19
I.5.ANALITOSYANTECEDENTESBIBLIOGRFICOS......................48
I.5.2. Antecedentesbibliogrficossobrela
determinacindecompuestosfenlicoscon
biosensoresamperomtricos..................................................50
I.5.3. Progesterona.............................................................................61
I.5.4. Antecedentesbibliogrficossobrela
determinacindeprogesteronaempleando
inmunosensoreselectroqumicos .........................................62
I
ndice
Pgina
I.5.6. Antecedentesbibliogrficossobrela
determinacindeinmunoglobulinas
empleandoinmunosensoreselectroqumicos .....................66
II.PROCEDIMIENTOSEXPERIMENTALES
II.1. BIOSENSORDETIROSINASABASADOENUN
ELECTRODODECARBONOVITRIFICADO
MODIFICADOCONNANOPARTCULASDEORO ..................75
II.1.1. Preparacindelelectrododecarbonovitrificado
modificadoconnanopartculasdeoroyTirosinasa ....................75
II.1.2.1.Determinacindelrecubrimiento....................................................79
II.1.2.2.Espectroscopiadeimpedanciaelectroqumica(EIS) .................... 79
II.1.2.3.Microscopiaelectrnicadebarrido .................................................83
II.1.3 Medidadelndicebioelectroqumicode
polifenolesenvinoempleandounbiosensorde
TirnAuGCE .......................................................................................85
II.1.4. Medidadelndicedepolifenolesenvinomediante
elmtodoespectrofotomtricoFolinCiocalteau..........................85
II
ndice
Pgina
II.2. PREPARACINDEUNBIOSENSORCOMPSITO
DEGRAFITOTEFLNMODIFICADOCONORO
COLOIDALYTIROSINASAPARALA
DETERMINACINDELCONTENIDODE
POLIFENOLESENMUESTRASAMBIENTALES.........................87
II.2.1. PreparacindelbiosensorcompsitoTirAucol
grafitoTefln........................................................................................ 87
II.2.3. Clculodelreaelectroqumicadeloselectrodos
grafitoTeflnygrafitoTeflnorocoloidalmediante
mediantevoltamperometracclicay
cronoamperometra .............................................................................90
II.2.4. Clculodelcoeficientededifusindelfenol...................................92
II.2.5. Clculodelcoeficientedetransferenciaelectrnica
paraelfenol ..........................................................................................92
II.2.6. Estimacindelcontenidototaldecompuestos
fenlicosenaguas................................................................................92
II.2.7. Estimacindelcontenidototaldecompuestos
fenlicosenmuestrasdealpechn....................................................96
III
ndice
Pgina
II.3. DESARROLLODEINMUNOSENSORES
COMPSITOSGRAFITOTEFLN
MODIFICADOSCONOROCOLOIDALPARALA
DETERMINACINDEPROGESTERONAEN
MUESTRASDELECHE.......................................................................96
II.3.1. Preparacindelinmunosensorbasadoenun
electrodoAucolgrafitoTefln ..........................................................97
II.3.2. Realizacindelinmunoensayocompetitivo
simultneo ............................................................................................98
II.3.4. Clculodelcoeficientedetransferenciaelectrnico
delnaftol ...............................................................................................99
II.3.5. Preparacindelinmunosensorbasadoenelempleo
deunbiosensordeTirAucolgrafitoTeflncomo
transductor............................................................................................101
II.3.6. Determinacindeprogesteronaenleche.........................................102
II.4. INMUNOSENSORAMPEROMTRICOPARA
INMUNOGLOBULINAGUTILIZANDOCOMO
TRANSDUCTORUNBIOSENSORDE
TIROSINASAOROCOLOIDALGRAFITO
TEFLN................................................................................................104
IV
ndice
Pgina
II.4.2. Realizacindelinmunoensayotiposndwich...............................105
III.RESULTADOSYDISCUSININTEGRADA
III.1. BIOSENSORESDETIROSINASABASADOS
ENELEMPLEODEDIFERENTES
SUPERFICIESELECTRDICAS
MODIFICADASCONNANOPARTCULASDE
ORO .........................................................................................................109
III.1.1.Biosensordetirosinasabasadoenelempleodeun
electrododecarbonovitrificadomodificadocon
nanopartculasdeoroelectrodepositadas......................................111
III.1.1.2.AspectosmsrelevantesdelbiosensorTirnAu
GCE........................................................................................................117
III.1.2.Biosensordetirosinasabasadoenunelectrodo
compsitodegrafitoteflnmodificadocon
nanopartculasdeoro.........................................................................123
III.1.2.1.Caracterizacindelasuperficieelectrdica
mediantetcnicaselectroqumicas.................................................123
V
ndice
Pgina
III.1.2.2.AspectosmsrelevantesdelbiosensorTirAucolGT................... 132
III.1.3.ComparacindelosbiosensoresTirnAuGCEyTir
AucolGT ...............................................................................................143
III.2 DESARROLLODEINMUNOSENSORES
BASADOSENSUPERFICIESCOMPSITAS
NANOESTRUCTURADAS .............................................................146
III.2.1. INMUNOSENSORESCOMPSITOSPARALA
DETERMINACINDEPROGESTERONA .................................147
III.2.1.1.Inmunosensorbasadoenelempleodeun
electrodocompsitodegrafitoTefln
modificadaconnanopartculasdeoro.........................................147
III.2.1.1.1.Estudiosdelaoxidacinelectroqumicadel
naftolsobreloselectrodosgrafitoTeflnygrafito
Teflnmodificadoconnanopartculasdeoro..............................147
III.2.1.1.2.Aspectosmsrelevantesdelinmunosensor
basadoenunelectrododeAucolgrafitoTefln........................... 151
III.2.1.2.Inmunosensorbasadoenunasuperficiede
grafitoTeflnmodificadaconnanopartculasde
oroyTirosinasa................................................................................154
VI
ndice
Pgina
III.2.1.2.1.Caracterizacindelassuperficieselectrdicas
medianteespectroscopiadeimpedancia
electroqumica ...................................................................................154
III.2.1.2.2.Aspectosmsrelevantesdelinmunosensor
basadoenunelectrodoTirAucolgrafitoTefln ........................156
III.2.1.3.Comparacindelosinmunosensoresbasadosen
unasuperficieelectrdicaAucolgrafitoTeflny
TirAucolgrafitoTefln.....................................................................159
III.2.2. INMUNOSENSORCOMPSITOPARALA
DETERMINACINDEINMUNOGLOBULINAG
ENSUERO ...........................................................................................161
III.2.2.1.Aspectosmsrelevantesdelinmunosensor
basadoenunbiosensorTirAucolgrafitoTefln
comotransductor .............................................................................161
III.3.PUBLICACIONES ......................................................................................165
VI.GLOSARIODEABREVIATURAS ...........................................259
VII
INTRODUCCIN
Introduccin
I.1.OBJETIVOYPLANDETRABAJO
ElOBJETIVOprincipaldeestetrabajohasidoaprovecharlasventajasdel
inters.
ProyectosdeInvestigacinsubvencionados:Desarrollodenuevosbiosensores
BQU200300365;Desarrollodebiosensoresbasadosenelectrodosdesuperficie
deteccindemolculasbioactivasenalimentos,CTQ200602905/BQU.
ElPLANDETRABAJOdesarrolladoparaalcanzarelobjetivomarcado,
constadelassiguientesetapas:
nanopartculasdeoro.
disolucinagitada,comparndoselosresultadosconlosobtenidosempleando
medidas,ascomoenlaestabilidaddelosdispositivospreparados,permitirn
3
Introduccin
nanomaterial,ascomosuadecuacinparainmovilizarmolculasbiolgicassin
producirseprdidasapreciablesdesubioactividad.
determinacindecompuestosfenlicos.
electrodepositadas,yseconstruirnbiosensoresenzimticoscompsitos,donde
tridimensional.
Enamboscasosseoptimizarnlasvariablesexperimentalesqueafecten
lmitesdedeteccinycuantificacinparaloscompuestosestudiados.
electroqumicosynoelectroqumicos.
4
Introduccin
compsitananoestructurada.
granvariedaddeconfiguracioneselectrdicas,presentandoventajastalescomo
especiesparamejorarlaselectividadosensibilidaddelmaterialelectrdico,as
caractersticasanalticasascomoeltiempodevidatildelosinmunosensores.
enelempleodeelectrodoscompsitosconteniendonanopartculasdeoro,con
elfindeaprovecharlasventajasdeestenanomaterial,estudindoseparacada
seguimiento,medianteespectroscopiadeimpedanciafaradaica,decadaunade
relacionadasconlarealizacindelinmunoensayocorrespondiente.Finalmente
inmunosensores.
desarrolladosalanlisisdemuestrasreales.
aplicarnaladeterminacindeanalitosdeintersenmuestrasreales.
5
Introduccin
muestras,conelfindeproporcionarunndicedelcontenidototaldefenoles,
quepermitaestimardeunaformarpidayfiablesidichocontenidoessuperior
oportunasenelmenortiempoposible.
vitrificado,seaplicaraladeterminacindepolifenolesenvinos,mientrasque
losproporcionadosporunmtododereferencia.
previamenteenriquecidasconloscompuestosestudiados,conelfindeevaluar
laexactituddelosmtodos,ascomolaexistenciadeefectomatriz.
6
Introduccin
NANOPARTCULASDEORO
despertadoungranintersdebidoalasinteresantespropiedadesestructurales,
propiedadesdependenengranmedidadesutamaoydesuforma,loscuales
partculasdelmetal.
Cuandounhazderadiacinincidesobrenanopartculasdemetalescomo
metal,loquesetraduceenlaabsorcinderadiacinelectromagnticaporparte
que sus electrones estn en niveles de energa discretos; por otra parte, el oro
metlicopresentaunaabsorcincontinuaenlareginUV/Vis/IR.Enelcasode
lasnanopartculasdeoro,estaabsorcincontinuadecaedrsticamente,excepto
enunazonaconcretadenominadabandadeabsorcindelplasmn.
7
Introduccin
Elcomportamientoplasmnicodelasnanopartculasdeorovienetambin
absorbanciadelplasmnparacaracterizarlasnanopartculas.
Unodelosproblemasasociadosalasnanopartculasdeoroeslaelevada
evitarlaformacindeagregadososuprecipitacin.
reduccinqumicadeunasaldeoroenmedioacuosouorgnico,enpresencia
deunagenteestabilizanteoprotectoradecuado,elcualseunealasuperficiede
electrostticas.Lasdispersionesdelasnanopartculaspreparadasenpresencia
deunestabilizadorsonestablesatemperaturaambientedurantelargotiempo,
noobservndoseprecipitacindelcoloidealcabodevariosmeses.
probablementedebidoasusencillezylosbuenosresultadosqueproporciona,
estabilizante,impidiendolaformacindeagregados[Cai,2001].Adems,esde
gran importancia destacar que las partculas sintetizadas por reduccin con
disolucindecitratoal1%adicionadoenlasntesis.
8
Introduccin
Volumendedisolucinde Dimetro,nm
citratosdicoal1%,mL (medidosporSEM)
1.0 16
0.75 25
0.5 41
0.3 72
0.21 98
0.16 147
SEM:microscopiaelectrnicadebarrido
tienelugarcuandoseaadeelreductor.
Nucleacin
Sobresaturacin
Crecimiento de partculas
Figura1Reduccindeoroinicoparaformarpartculasdeoro
situacindesobresaturacin.Despusdeesteprocesotienelugarelcrecimiento
9
Introduccin
aparicindeagregados.
laspartculasdeoroobtenidas.As,unacantidadelevadadereductordalugar
tamao.
tamao(monodispersas).
Elcolordelasuspensinobtenida,rojorub,essealdelacalidaddelas
uniformidadeneltamaoesesencialenlafabricacindedispositivosbasados
reproducibles.
Lasnanopartculasaspreparadasposeencargasuperficialnegativacomo
consecuenciadeladbiluninalcitrato,empleadocomoreductor.Debidoala
indefinidamente.
Comoyasehacomentado,lalongituddeondadelmximodeabsorcin
delplasmndependetantodeltamaocomodelaformadelananopartcula.
10
Introduccin
Porotraparte,laposicindelabandadelplasmnvaraconlafuncionalizacin
partculasde15nmdedimetropresentanunmximoa520nm.
Otrosprocedimientosparalaobtencindenanopartculasdeoroimplican
nanopartculasfuncionalizadasconunagranvariedaddeligandosorgnicosy
coloidales.EstaadsorcinocurreporlaformacindeenlacescovalentesAuS,
segnlareaccin:
Au+RSHAuSR+H2
qumicadelgrupotiolporlostomosdeoro.
faseacuosa,enelinteriordemicelasinversaspresentesenmicroemulsionesola
dispersindelasmismasenmatricespolimricas.
Apesardelosgrandesprogresosenlasntesisdenanopartculasdeoro,
anseestndiseandonuevosprocedimientosquepermitanunmayorcontrol
habidacuentadesusnumerosasaplicacionesencampostanimportantescomo
laobtencindelosnanosensores,biosensores,catlisisynanoelectroqumica.
Por otra parte, cabe destacar el inters creciente que han recibido la
preparacindebioconjugados,basadosenlamodificacindelasnanopartculas
11
Introduccin
nanopartculasdeorodetamaoyformacontroladosque,adems,puedenser
anticuerpos,ADN,etc.
12
Introduccin
DEORO
Lapreparacinyelempleodesuperficieselectrdicasnanoestructuradas
superioraladeloselectrodosconvencionales,yconlaventajadequepueden
obtenerseseriesordenadasdenanoelectrodosenunaovariasdimensiones.
electrdicasesaplicabletantoalaconstruccindesensoresqumicoscomode
biosensores.Enelprimercaso,lasnanopartculas,funcionalizadasono,actan
puedenmonitorizarseempleandotcnicaselectroqumicas[HernndezSantos,
nanopartculasdeoroconloselementosdereconocimientobiolgico,permiten
construirfasessensorasconpropiedadesmejoradas.
entre las que cabe destacar: a) la unin de las nanopartculas a los grupos
13
Introduccin
electrodoenunadisolucindeorocoloidalduranteuntiempodeterminado,c)
electrodoscompsitos.
atractivascaractersticasfsicoqumicas.Adems,lafacilidaddepreparaciny
comodesustanciastxicas[Renedo,2007].
nanoestructuradosencontradosenlabibliografa,dondeseaprovechaelefecto
presentanencuantoalascaractersticasanalticasdelsensor[Cai,2001].
unsensorparaladeterminacindemetionina,enelquelasnanopartculasde
modificadoconunamonocapadecisteamina.Lamodificacindelasuperficie
14
Introduccin
presenciadeotrosaminocidosovitaminas[Ag,2004].
paralaobtencindeunsensordeperxidodehidrgeno.Esdedestacarelbajo
inmovilizadas[Maduraiveeran,2007].
OtrodiseoreportadoporJenaycolaboradoresparaladeterminacinde
glucosa,sebasaenelempleodenanopartculasdeoroautoensambladasalos
[Jena,2006].
aumentodelasensibilidad,reproducibilidadytiempodevidatilconrespecto
aotrasconfiguracionesencontradasenlabibliografa[LiM.,2008].
15
Introduccin
monocapadecisteamina.Losresultadosobtenidosmediantevoltamperometra
sensibilidadyselectividadobtenidaparaambasespeciesconrespectoalempleo
0.13M.[Raj,2003].
pelculapolimricadepoli(3,4etilendioxitiofeno)(PEDOT)ynanopartculasde
presenciadecidoascrbico.Enestedispositivo,ladopamina,mshidrofbica,
interaccionapreferentementeconlareginnoconductoradelpolmero(forma
reducida),mientrasqueelcidoascrbico,mshidroflico,interaccionaconla
sobrelasnanopartculasdeoro,atravsdeldbilenlacedelosgruposamino,
dalugaraunsignificativoaumentodelacorrientedeoxidacin,obtenindose
unmarcadoaumentodelasensibilidaddeladeterminacin[Kumar,2005].
Otroejemplodesensornanoestructuradoparaladeterminacindeeste
electrocatalticodiferenciadorqueejercelamonocapadecolinamodificadacon
16
Introduccin
ascrbicoycidorico,permite,porunaparte,unaumentodelasensibilidad
[WangP.,2007].
preparacindelsensorimplicaelempleodeunasuperficieelectrdicadexido
detitanioeindio(ITO)modificadaconnanopartculasdeoroquimisorbidas.El
llevanacaboporvoltamperometradiferencialdeimpulsos,comparndoselos
superficiesnanoestructuradas,yaqueelefectoelectrocatalticoejercidoporlas
[Goyal,2007].
Jinycolaboradoreshandesarrolladounsensorparaladeterminacinde
electrodepositadonanopartculasdeoro.Elefectoelectrocatalticoejercidopor
permitidollevaracaboladeterminacindeambasespeciesdeformaselectiva,
observndoseunaseparacinde183.5mVentreambospicosdeoxidacin[Jin,
2002].
17
Introduccin
Sehanencontradoenlabibliografadiferentessensoresmodificadoscon
As,loselectrodosserigrafiados(screenprinted),carbonovitrificado,platino,
ydegrafitohansidoampliamenteempleadosparaladeterminacindeespecies
talescomoarsnico[Song,2006],antimonio[Renedo,2007],xidodenitrgeno
ehidrazina.
cistenasobrelaqueseunencovalentementelasnanopartculasdeoro.Eneste
250mVrespectodelasealobtenidasobreelmicroelectrodosinmodificar.La
recubriendolasuperficiesensoraconunapelculadeNafion[ZhuM.,2002].
potencialdeoxidacindelahidrazinadeaproximadamente800mV,ascomo
de200pM[Jena,2007].
18
Introduccin
EMPLEODENANOPARTCULASDEORO(nAu)
I.4.1.Biosensoresenzimticos
electrnicas y catalticas nicas de este material [Liu S., 2003a y Katz, 2004].
actividadbiolgica,loquenoocurresobreotrosmaterialeselectrdicos,como
orientacinqueposeenlasbiomolculasinmovilizadassobrelasnanopartculas
[LiuS.,2003b].
electrnicoentreelgrupoprostticodelasenzimasylasuperficiedelelectrodo,
llamadosdetercerageneracin,enlosquelasnanopartculasdeoroposibilitan
sensibilidad[YnezSedeo,2005yLiuS.,2003a].
funcionamientoylascaractersticasanalticasobtenidasencadacaso.
Unodelosdiseosmssimplesconsisteenladeposicindirectadelas
19
Introduccin
inmovilizacindelaenzimaacetilcolinesterasa.Elbiosensorobtenidoseutiliz
[Shulga,2007].
Enuntrabajorealizadoennuestrogrupodeinvestigacin,seinmoviliza
laenzimaxantinaoxidasa(XOD)porentrecruzamientoconglutaraldehdo.La
preparacindelbiosensorimplicalaelectrodeposicinpreviadenanopartculas
inmovilizacindelaenzimaporentrecruzamientoconglutaraldehdoyBSA.El
interferenciascomoelcidoascrbico.Ellmitededeteccinobtenidoalaplicar
estepotencialesde0.22M,siendodelmismoordenquelosencontradosenla
bibliografa,conbiosensoresqueoperanapotencialesmuchomselevados.
20
Introduccin
empleodemonocapasautoensambladasproporcionan,engeneral,unaelevada
relacinseal/ruidoyunabuenareproducibilidaddelasmedidasrealizadas,
ascomodelosprocedimientosdefabricacin.
obtenidaincorporandoorocoloidalyGOxsobreunamonocapadecisteamina
respuestaelectrocatalticaparalareduccindeH2O2sinnecesidaddemediador
[Yi,2000].Recientemente,Linycol.hanpreparadounbiosensoramperomtrico
nanopartculasdeoroyposteriorcoinmovilizacindelaenzimaperoxidasayel
mediadortetrametilbencidina[Lin,2007b].
nanopartculasdeoroananoesferasporosasfuncionalizadascongrupostioles
depoli(divinilbencenococidoacrlico)paralapreparacindeunbiosensorde
peroxidasa,consiguindosebuenascaractersticasanalticas[XuS.,2007].
21
Introduccin
matrizelectrdicasinnecesidaddeenlacescovalentes.Adems,constituyenun
depsitotridimensionaldeenzimacuyasuperficiepuederenovarseporsimple
pulido.
distintasenzimas.Conestediseosehaconstruidounbiosensordeglucosade
elevadasensibilidadsinnecesidaddemediador[LiuS.,2003b],unbiosensorde
[Liu S., 2003a], todos ellos preparados mezclando la enzima, el oro coloidal y
modificandomicropartculasdecarbonovitrificadoconnanopartculasdeoroy
laenzimaXODparaladeteccindexantinaehipoxantina.Estedispositivose
empleparaladeterminacindehipoxantinaenatn[ubuku,2007].
Unatendencianovedosaparalapreparacindebiosensoreseselempleo
desuperficiesnanoestructuradasdenanotubosdecarbono(CNT)modificadas
exhibenefectoselectrocatalticosintensoshacialaoxidacindemolculastales
22
Introduccin
afinidadenzimasustratodebidoaladecuadomicroambientequeproporcionan
enlainclusindelaenzimaalcoholdeshidrogenasa(ADH)enlamismamatriz
compsita,observndoseunmarcadoincrementoenlarespuestadeoxidacin
determinacindeetanolconunlmitededeteccinde4.7M[Manso,2008].
Otraposibilidadesinmovilizarselectivamentelasnanopartculasdeoro
superficie[Jiang,2003].Deestemodo,lasnanopartculasdeoropuedenunirse
empleado por Liu y col. [Liu Y., 2005] para la inmovilizacin covalente de
electrnicadirectaentrelaenzimayelelectrodo,sinobservarseprdidadesu
23
Introduccin
2007].
materialessolgelinorgnicossonparticularmenteatractivosparalafabricacin
medidas,lasencillezdelprocedimientoempleado,ascomosubajocoste[Du,
2008].
del solgel, incrementndose, de esta forma, el rea activa del electrodo. Las
24
Introduccin
quepermitedeterminacionesdegransensibilidadbasadoenelempleodeuna
conunamonocapa.Lasnanopartculasdeoroseunenalamatrizatravsdelos
nanoelectrodosautoensambladosaunaredtridimensional.Lasnanopartculas
deorocatalizanlaoxidacindelNADH,loquehapermitidolaobtencindeun
lmitededeteccinde5nMenausenciademediador.Elelectrodomuestrauna
excelenteestabilidadoperacionalyseaplicaladeteccindelactatoyetanola
desarrollado por Zhong y col. que se basa en la formacin de una doble capa
nuevamenteenunadisolucindeMPSduranteunanoche.Lasnanopartculas
obtenindoseunintervalolinealde4.0x1010a5.3x108M[Zhong,2005].
25
Introduccin
unbiosensoramperomtricodeglucosabasadosenlaformacindemulticapas
deglucosaoxidasa,chitosanynanopartculasdeoroempleandolatcnicaLBL.
glucosa,demostrndosequelasnanopartculasdeoromejorannotablementela
delelectrodo[Wu,B.Y.,2007].OtrodiseosimilarqueemplealatcnicaLBLse
basaenlaformacindemulticapasdeglucosaoxidasa/nanopartculasdeoro
sobreunasuperficiedeoromodificadaconcisteamina.Enestecasoseobserv
inmovilizadasobreelelectrodo[Yang,2006a].
deteccinamperomtricadeglucosasellevacaboaplicandounpotencialde0
Vvs.SCE[Crespillo,2006].Sunycololaboradoresmodificaronunelectrodode
oroconmulticapasdesulfonatomodificadasconnanopartculasdeoro/tionina
superestructurasproporcionanunamatrizidealparalafabricacindesensores
transferenciaelectrnica.Lasenzimasglucosaoxidasaoxidadaconperiodatoy
26
Introduccin
aumentaconformeaumentaelnmerodecapasdetionina[Sun,2007].
Acontinuacinsedescribendeformaesquemticaalgunasaplicaciones
nanopartculasdeoro.
27
Introduccin
Tabla2.Biosensoresenzimticosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
28
Introduccin
Tabla2.Biosensoresenzimticosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
ENZIMA/ TCNICA CARACTERSTICAS DE ANALITO/ CARACTERSTICAS
DETECCIN REF.
ELECTRODO INMOVILIZACIN FUNCIONAMIENTO MUESTRA ANALTICAS
Inmov. de GOx por
entrecruzm. con GA y BSA m
sobre superf. mod. con nAu Amperom. K app = 2.03mM Inter. Lineal: < 1.5 mM -2 [Crespilho,
GOx / ITO mod. con dendrimeros de (Eap: 0.0 V Reg. Fosfato 0.1 M + NaCl Glucosa Sensibilid.: 33.6 0.2 nA mM cm
PANAM con hexaciano- vs. SCE) LD: 17 M 2006]
0.05 M, pH 7.0
ferrato de Co alternando
capas de PVS
Inmov. de GOx por
entrecruzam. con GA
sobre superf. mod. con Amperom. Inter. lineal : Hasta 1.5 mM
m -2
GOx / ITO PVS y dendrimeros de (Eap: 0.0 V vs. K app = 2.03 mM Glucosa Sensibilidad:33.6 0.2 nA mMcm [Brett, 2006]
PAMAM con hexaciano- SCE) LD: 17 M
ferrato de cobalto como
mediador
Inmov. de GOx y TTF
Inter. lineal : 0.01 10 Mm
(mediador) por Amperom. Sensibilidad: 1.02 0.06 mA/M
GOx / GCE entrecruzamiento con GA Reg. fosfato 0.05 M pH 7.4 Glucosa [Mena, 2005a]
(Eap: 0.2 V) LD.: 0.7 x 10-5M
sobre superf. mod. con
Tiempo de vida til: 28 das
cisteamina MPA y nAu.
Inmov. mezcla de GOx-
Amperom. Repetib.: 8.3% (RSD) Inter. lineal : 1.0x10-6 - 1.6x10-3 M
Chitosan-nAu sobre Glucosa /
GOx / GCE Reg. fosfato 0.05 M pH Suero humano Sensibilidad: 69.26 A mM-1 cm2 [Xue, 2006]
superf. mod. con pelcula (Eap: -0.05 V)
7.0+ 0.1 M KCl LD: 6.9x10-7 M
de azul de prusia.
m
K app = 4.6 mM
CV Inter. lineal : 6 mM
Inmov. de GOx sobre superf. Amperom. Reg. fosfato 0.1 M pH 6.82 Sensibilidad: 6.5 A mM1 cm2
GOx / GCE mod. con nAu. y
+ 0.25 mM Glucosa [Zhao, 2006]
recubrimiento con Nf. (E ap: 0.27 V LD. 3.4105 M
vs. Ag/AgCl) ferrocenometanol (como Tiempo de vida til: 2 semanas
mediador)
Inmov. de GOx mediante Inter. Lineal: 1.0x10-6-8.0x10-4 M
Amperom. Repet.= 4.8 % (n=7) Glucosa/
composito de nAu y n- Sensibilidad: 2.3 mA/M
GOx / GCE Suero y [Xian, 2006]
fibras conductoras de (Eap: +0.5 V) Reg. fosfato 0.1 M pH 6.9 LD: 5.0x10-7 M
sangre
polyanilina. Tiempo de vida til: 2 semanas
29
Introduccin
Tabla2.Biosensoresenzimticosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
30
Introduccin
Tabla2.Biosensoresenzimticosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
31
Introduccin
Tabla2.Biosensoresenzimticosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
Inmov. de HRP sobre superf. Repetib.: 2.4% (RSD) Inter. lineal : 0.020 - 8 mM
Amperom.
HRP / ITO mod con APTMS y Au col. (n=8) H2O2 LD: 8.0 M [Wang L. 2004]
(Eap: -0.25 V)
Reg. fosfato 0.05 M pH 7.0 Tiempo de vida til: 90 das
CV m
Inmov. de HRP y TMB K app = 2.2 mM
Inter. lineal : 0.005 - 1.5 mM
HRP / ITO (mediador) sobre superf. mod. Amperom.
Repetib.: 2.7% (RSD) H2O2 [Lin, J., 2007b]
LD: 1 M
con MPTS y nAu (Eap:-0.7 V) (n=8)
Inmov. de HRP sobre superf.
Repetib.: 4.7% (RSD) Inter. lineal : 1.60105 -
mod. con nanocompsito
HRP / GCE CV (n=5) H2O2 1.10103 M [Li X., 2006a]
L-cisteinanAu sobre
Reg. fosfato 0.1 M pH 7 LD: 5.50106 M
membrana de Nf.
Unin covalente de CNTs y
nAu sobre pelcula de Amperom.
politionina electropolim. sobre Inter. lineal: 5M-7.0 mM
HRP / GCE GCE. Inmov. de la enzima por (Eap:+0.4 V vs. Reg. Fosfato 0.1 M, pH 7.0 H2O2 [Feng, 2007]
LD: 3 M
incub. en disolucin 15 mg/mL SCE)
de HRP durante 12 h. a 4 C.
Electropolim. de p-ABSA Cronoamperom. Repet.: 2.8 % Inter. lineal: 2.6 M-8.8 mM
HRP / GCE sobre GCE. Adsor. de tionina y Reproducib.: 3.9 % H2O2 [Gao, 2007]
nAu e inmov. de HRP (Eap: -0.45 V) Regulador acetato pH 7 LD: 0.64 M
32
Introduccin
Tabla2.Biosensoresenzimticosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
33
Introduccin
Tabla2.Biosensoresenzimticosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
Abreviaturas:AChE:acetilcolinesterasa,ADH:alcoholdeshidrogenasa,ASV:voltamperometradestrippingandico,CitC:citocromoC,
CNT: nanotubo de carbono, CPE: electrodo pasta de carbono, CV: Voltamperometra cclica, DPV: Voltamperometra diferencial de
impulsos, EIS: espectroscopia de impedancia electroqumica, GA: glutaraldehdo, GC: carbono vitrificado, GCE: electrodo de carbon
vitrificado,GCPE:electrodopastadecarbonovitrificado,GA:glutaraldehdo,Hb:hemoglobina,HRP:peroxidasa,ITO:xidodeindioy
m
titanio, K app : constante aparente de MichaelisMenten, LBL: layerbylayer, LD: limite deteccin, MPTS: (3
mercaptopropil)trimetoxisilano,MWNT:nanotubosdecarbonodeparedmltiple,nAu:nanopartculasdeoro,pABSA:paminobenzene
sulfonicacid,PCQ:piezoelectricquartzcristal,PDDA:clorurodepoli(dialildimetilammonio),pPy:polipirrol,PVB:polivinilbutiral,PVS:
cidopoli(vinilsulfonico),SCE:electrodosaturadodecalomelanos,TMB:tetrametilbencidina,TTF:tetratiafulvaleno;Tir:tirosinasa,XOD:
xantinaoxidasa.
34
Introduccin
I.4.2.Inmunosensoreselectroqumicos
importanteherramientaanalticaendiferentescampos,talescomoelanlisisde
alimentos,clnicoymedioambiental[Lei,2003].Lasdiversasconfiguracionesde
inmunosensoreselectroqumicosconstituyenexcelentesalternativasporsualta
sensibilidad,bajocosteyfacilidaddeminiaturizacin.
comoelectrodosserigrafiados(screenprinted).Encuantoalainmovilizacin
covalente,adsorcinoelatrapamientodelbiomaterialenlamatriz.
ambientesimilarasuentornonatural.Ademslaspartculasmetlicasactan
comomediodeconduccinelectrnico,facilitandolatransferenciaelectrnica,
2004a].
35
Introduccin
conorocoloidalypolivinilbutiral[Tang,2004b].Estudiosrealizadosmediante
superficieespecficadelbiosensor,consiguindosemejoreslmitesdedeteccin.
LadeterminacindeestemismoantgenofuellevadaacaboporWangycol.,
conuninmunosensorbasadoenelempleodeunasuperficiedeoromodificada
conunamonocapade4aminotiofenolyorocoloidal.Lacinticadelprocesode
M.,2004].
inmunosensoresparaladeteccindelantgenodelaHepatitisB.Enlaprimera
modificadaconnanopartculasdeorounidasalosgrupostiolesdeunapelcula
solgelpreviamentemodificada,seobtuvieronmejorescaractersticasanalticas
amperomtricopreviamentepreparadoporelgrupodeLiangycol.enelcual
obtenindoseuninmunosensorconuntiempodevidade30dassinobservarse
nanopartculas[Liang,2005].Otrodiseoencontradoenlabibliografaparala
36
Introduccin
delanticuerposobreunelectrododeoromodificadoconnanopartculasdeoro
yperoxidasa(HRP)[Zhuo,2005a].EsteinmunosensorempleaHRPenlugarde
superficieelectrdica,consiguindosedeestemodo,ademsdeevitarposibles
antgenoanticuerpo.
combinadoparalainmovilizacindelanticuerpodeladifteriaylapreparacin
antgenoanticuerpo,poniendodemanifiestoqueelinmunosensorbasadoenel
preparadosempleandounslonanomaterial[Tang,2005a].
comomarcadordeclulastumorales.Enlaprimeradelaestrategiasutilizada,
37
Introduccin
amperomtricobasadoenelempleodemulticapasdenanopartculasdeoroy
inespecficas[Zhuo,2006].
inmovilizacindelanticuerpo,parallevaracaboladeterminacindelantgeno
carcinoembrinico[LiX.,2006b].
celulosa.Lacombinacindelasnanopartculasdeoroylamembranadeacetato
inmunosensorsensibleyselectivoparaestetipodeantgeno[WuL.,2006].Este
mismoanticuerpohasidoinmovilizadoporelgrupodeTangycol.sobreuna
obtenindosebuenosresultados.[Tang,2006b].
inmunosensores,cabedestacarlosderivadossolgel.Lasventajasquepresentan
38
Introduccin
estetipodesuperficiesestnrelacionadasconsuporosidad,sualtaestabilidad
permiteelatrapamientodelosbiomateriales,peropresentaelinconvenientede
anteriormente,supresenciaproporcionaunambientesimilaralestadonatural
delamolculabiolgica,mantenindosesuspropiedades.Adems,lapresencia
de las nanopartculas proporciona una mayor rea activa, lo que conlleva una
mayordensidaddeanticuerposinmovilizados,yunamayorsensibilidad.Esta
2005].
sobreunasuperficiedeoropreviamentemodificadaconunamonocapade1,6
deteccinde4ngmL1[ChenH,2006].
39
Introduccin
deformaesquemticaaspectosrelevantescomosupreparacinysuaplicacin
aladeterminacindediferentesanalitosdeinters.
40
Introduccin
Tabla3.Inmunosensoreselectroqumicosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
41
Introduccin
Tabla3.Inmunosensoreselectroqumicosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
42
Introduccin
Tabla3.Inmunosensoreselectroqumicosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
43
Introduccin
Tabla3.Inmunosensoreselectroqumicosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
44
Introduccin
Tabla3.Inmunosensoreselectroqumicosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
45
Introduccin
Tabla3.Inmunosensoreselectroqumicosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
46
Introduccin
Tabla3.Inmunosensoreselectroqumicosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
Abreviaturas: BSA: albmina de suero bovino, CPE: electrodo pasta de carbono, DTSP: 33Ditiobis(cido propionioco/N
hidroxisuccinimida), FcCHO: ferrocenocaraldehdo, GCE: electrodo carbono vitrificado, HAsAb: Anticuerpo Hepatitis B., HbsAg:
antgeno del Hepatitis B., MPS: mercaptopropiltrimetoxilano, MPTS: mercaptopropiltrietoxisilano, Nf: nafion, nAu: nanoparticulas de
oro, PDA: ofenilenidiamina, PSA: antgeno especfico de la prstata, PTH: politionina, PVB: polivinilbutiral, SAM: monocapa
autoensamblada,TRIS:tris(hidroximetil)aminometano,Thi:tionina
47
Introduccin
I.5ANALITOSYANTECEDENTESBIBLIOGRFICOS
I.5.1 Compuestosfenlicos
Losfenolessoncompuestosaromticosquesecaracterizanporteneruno
familia,elfenol[Serra,2002].
(CE)ydelaAgenciadeProteccinAmbientalNorteamericana(EPA)
industrial.Desdeelpuntodevistadelacontaminacin,esdegranimportancia
plsticos,colorantes,tintas,medicamentos,antioxidantes,polmerossintticos,
compuestosenelmedioambiente,ascomocontarconmtodosfiablesparasu
determinacinenmatricescomplejas[Wang,1994].
48
Introduccin
Porloqueserefierealospolifenoles,soncompuestosconstituidosporal
menosunanilloaromticoconunoomsgruposhidroxilocomosustituyentes.
Enelserhumano,trassuingesta,partedelaactividadbiolgicadelos
propiedadesmsrelevantescabedestacarsucapacidadparainhibirlosprocesos
consideradoscomounsubproductodealtovaloraadido[Mello,2003].
nivelmundialconelfindeconocerlacantidadyeltipodepolifenolespresentes
dietticas.
antioxidantesnaturales,ralentizanoprevienenlosprocesosdedescomposicin
organolpticas[Capannesi,2000].
49
Introduccin
compuestosfenlicosconbiosensoresamperomtricos
Lanecesidaddehacerfrentealosproblemasanalticosqueseplantean
compuestosfenlicospresentesenmuestrasambientales,yotrassustanciasde
inters,comolospolifenolesenalimentos.
Estehechohaimpulsadoeldesarrollodebiosensorescomoalternativaa
tcnicasespectrofotomtricasycromatogrficas,quegeneralmenteimplicanun
mayortiempodeanlisis.
Elempleodeenzimas,comoelementodereconocimientobiolgico,yla
deteccinamperomtricacomosistemadetransduccin,paralafabricacinde
biosensores,proporcionanumerosasventajasdesdeunpuntodevistaanaltico.
enzimticosamperomtricosparaladeteccinydeterminacindecompuestos
fenlicos.
hanaplicado.
50
Introduccin
disolucin.
Tambinsehanencontradoejemplosenlosqueseempleaunelectrodo
oxgeno,loqueconllevaladesventajadelanecesidaddeaplicarunpotencialde
medidabastantenegativo,aumentandoaselnmerodeinterferencias.
realizarsecolocandolaenzimasobrelasuperficiedelamembranapermeableal
deotrotipo[Streffer,2001],obieninmovilizandopreviamentelaenzimaenun
gelqueposteriormentesedepositaenlamembranadelelectrodo[Campanella,
2004].
Alahoradellevaracabolapreparacindebiosensores,hayquetener
dependedeltipodematerialelectrdicoempleado.As,enlosbiosensoresque
utilizanmaterialescompsitos,elmtododeinmovilizacinmsutilizadoesel
aunqueenocasioneslaenzimaseinmovilizadespusdehabersemezcladocon
otraspartculas[LiuS.,2003a].Otraalternativaeselempleodeunafinacapade
solgelparalainmovilizacindelaenzimasobrelasuperficiedelelectrodo.
51
Introduccin
conunamembrana[Rajesh,2004a],poratrapamientoenunamatrizpolimrica
depositadaenlasuperficiedelelectrodo[Vdrine,2003],medianteelempleode
unhidrogel[WangB.,2000a],oporunincovalenteconcarbodiimida[Freire,
dilisis,ounincovalenteaunhidrogelqueposteriormentesedepositasobrela
superficiedelelectrodo[Freire,2002b].
Enelcasodeemplearunelectrododegrafitoslidolainmovilizacinde
laenzimaessimilaraladeloselectrodosdecarbonovitrificado,sibienesms
superficierugosa[Haghighi,2003;JarrosWilkolazka,2004].
predominantementeacuoso,emplendoseenlamayoradeloscasosregulador
fosfatoapHsentre5.0y7.4.Enalgunoscasos,seaadeunciertoporcentajede
metanol,[Narvez,1996],etanol[Gomes,2004]oacetonitrilo[Rogers,1999].
existentes,muypocoshansidoaplicadosamuestrasreales.Noobstante,sehan
desarrolladoaplicacionesenaguas,suelos,filtrosdecigarrillo,aceites,cervezas,
vinosypesticidas.Laescasaaplicacindelosbiosensoresdesarrolladospuede
atribuirsealadificultaddellevaracabomedidasenmatricescomplejas,enlas
cualesellmitededeteccinpuedeaumentarconsiderablemente,laestabilidad
muchomsacusada.
52
Introduccin
Tabla4.Antecedentesbibliogrficossobreladeterminacindecompuestosfenlicosconbiosensoresamperomtricosenzimticos.
53
Introduccin
Tabla4.Antecedentesbibliogrficossobreladeterminacindecompuestosfenlicosconbiosensoresamperomtricosenzimticos.
54
Introduccin
Tabla4.Antecedentesbibliogrficossobreladeterminacindecompuestosfenlicosconbiosensoresamperomtricosenzimticos.
55
Introduccin
Tabla4.Antecedentesbibliogrficossobreladeterminacindecompuestosfenlicosconbiosensoresamperomtricosenzimticos.
56
Introduccin
Tabla4.Antecedentesbibliogrficossobreladeterminacindecompuestosfenlicosconbiosensoresamperomtricosenzimticos.
57
Introduccin
Tabla4.Antecedentesbibliogrficossobreladeterminacindecompuestosfenlicosconbiosensoresamperomtricosenzimticos.
58
Introduccin
Tabla4.Antecedentesbibliogrficossobreladeterminacindecompuestosfenlicosconbiosensoresamperomtricosenzimticos.
59
Introduccin
Tabla4.Antecedentesbibliogrficossobreladeterminacindecompuestosfenlicosconbiosensoresamperomtricosenzimticos.
Abreviaturas: ACN: acetonitrilo, B: boro, DOPAC: 3,4dihidroxifenilacetico, DHB: dihidroxibenceno, DMP: dimetilfenol,
EPD:etilenpropilendieno, GA: glutaraldehdo, GDH: glucosa deshidrogenasa, MPA: cido mercaptopropionico, PAPCP: poly (N3
aminopropyl pyrrolecopyrrole), PCS: poli(carbamoilsulfonato), PEGDGE: poli(etilenglicol) diglicidil ter, PVI13dmeOs: {poly[(1
vinilimidazol)osmio (1,4dimethilbipiridina)2Cl]}_/2_, Ph: fenol, PS 086: copolimero de polimetilsiloxano (85%) y difenilsiloxano (15%),
Ru:rutenio,SH:salicilatohidroxilasa,SPCE:electrododecarbonoserigrafiado,TAC:triacetatedecelulosa,Tir:tirosinasa
60
Introduccin
I.5.3.Progesterona
Laprogesteronaesunahormonaesteroideaqueseencuentraendiferentes
tambinpuedesersintetizadaenlasglndulasadrenalesyelhgado.
ciclopentanoperhidrofenantreno,tambinllamadoesterano.Estecompuestoes
saturacindelfenantrenoasociadoaunanillodeciclopentano.Posee17tomos
decarbono.Deestabaseestructuralderivanlosesteroides,quesonlamolcula
(colesterol),cidosbiliaresyhormonasesteroideas.
Figura2.EstructuradelaProgesterona
leche.
artificial,lamonitorizacindelosnivelesdeprogesteronaenlecheconstituyeel
matrizcompleja,debidoprincipalmentealapresenciadeprotenasygrasas.
61
Introduccin
progesteronaempleandoinmunosensoreselectroqumicos
manejoqueproporcionenresultadosrpidosyfiables.
herramientaquepuedeserempleadaparafinesdediagnsticoclnico,control
bibliografaparaladeterminacindeestahormona.
Lamayorpartedelosinmunosensoressebasanenlainmovilizacindel
anticuerpodelaprogesteronasobrelasuperficieelectrdicay,posteriormente
larealizacindeuninmunoensayodetipocompetitivoentrelaprogesteronade
empleodeunelectrododecarbonoserigrafiado(screenprinted)modificado
conunrecubrimientodeinmunoglobulinaG,sobreelcualseinmovilizalaanti
enzimtica[XuY.F.,2005].
62
Introduccin
concentracionesdeprogesterona,impidiendoladeterminacindelahormonaa
corrientedefondoqueseobtienedebidoalaconcentracinelevadadesustrato
quehayqueintroducirenelsistemadeflujo[Pemberton2001].
preez[Velasco,2001].
competitivoindirectoeseldesarrolladoporKreuzerycol.Enestecaso,sobrela
seguidamentesetrataconantiProgesteronayfinalmenteconinmunoglobulina
marcadaconfosfatasaalcalina.Elproductoobtenidodelareaccinenzimtica
concentracindelanalito,obtenindoseunintervalolinealde16a256ngmL1
yunlmitededeteccinparaprogesteronade3ngmL1[Kreuzer,2004].
63
Introduccin
I.5.5. Inmunoglobulinas
(cadenas L, light). Las cadenas estn unidas entre s por puentes disulfuro
adoptandolaformadeYquesemuestraenlaFigura3.
VL
2
NH
NH
VL
2 N
CL
2
NH
CL
H2
S- S
S S-
Fab
OH CO
VH VH
S-S
S
CO
S- S-S
S-
OH
S CH1
S-S
S-S
S-S
S-S
CH2
Fc
CH3
S-S
S-S
COOH COOH
Figura3.Estructurabsicadeunainmunoglobulina
peptdicasdetamaouniforme,unidosentresporpuentesdisulfurodentrode
lapropiacadena.Enlaestructuradelainmunoglobulinapuedendiferenciarse
dosregiones.Lareginvariable(V),siendosteeldominioNterminalositio
decombinacindelanticuerpo,cuyasecuenciadeaminocidosesmsvariada
queelrestodelacadenapolipeptdica,ylasllamadasregionesconstantes(C),
64
Introduccin
compuestaspordominiossimilaresentodaslasinmunoglobulinasdelamisma
especie. Las cadenas ligeras estn compuestas por una regin variable y una
regin constante (VL y CL). Sin embargo, las cadenas pesadas constan de una
humanohaydostiposdecadenasLycincodecadenasHquedanlugaralas
diferentesinmunoglobulinas:IgG,IgA,IgM,IgDeIgE.
capazdeatravesarlaplacenta.Porestemotivo,losvaloresdeinmunoglobulina
destacar, que durante los 3 ltimos meses del embarazo la IgG transferida al
fetoaumentaysusnivelesvuelvenadisminuirdurantelostresprimerosmeses
devida.
Porotrolado,cuandosellevaacabolaingestadeunalimentoalrgico
formainmediata,cuyareaccinespecficavendradadaporlaparticipacinde
lainmunoglobulinaE,ocasionandorespuestastalescomo,erupciones,catarroo
hinchazn,oqueaparezcapasadountiempodelaingestadedichoalimento,
65
Introduccin
infeccin.
inmunoglobulinasempleandoinmunosensoreselectroqumicos
Lapreparacindeinmunosensoreselectroqumicos,ysuaplicacinala
muestraslasdiferentesestrategiasencontradasenlabibliografa.
Elempleodeelectrodosserigrafiados(screenprinted)esfrecuenteen
paraladeterminacindeinmunoglobulinaGdeconejo,alcanzndoseunlmite
dedeteccinde330ngmL1.Delmismomodo,DazGonzlezycol.disearon
empleandoparasudeteccinvoltamperometradeondacuadrada.
Wilsonycol.,utilizaronunamatrizdeiridioparalaconstruccindeun
lado,WangZ.ycol.emplearonunelectrododecarbonovitrificadomodificado
deteccinhasta1.2ngmL1[Wang,2006].
carbonoynanopartculasmetlicas,suponeunaimportanteherramientaparala
66
Introduccin
preparacindeinmunosensores,consiguindoseimportantesmejorasencuanto
asuscaractersticasanalticas.
inmunosensoramperomtrico,llevaronacabounensayocompetitivo,conelfin
peorescaractersticasanalticas[Snchez,2007].Otroinmunosensorenelquese
ratnmedianteespectroscopiadeimpedanciafaradaica(EIS)[Yun,2007].
Encuantoalempleodenanopartculasdeoro,cabedestacareldiseode
Fuycol.basadoenlamodificacindeunelectrododeoroconunamonocapa
delcorrespondienteantgeno[Fu,2005].ChenH.ycolaboradoresemplearonun
novedosoprocedimientoparaamplificarlasealimpedimtricaobtenidapara
implicaelempleodenanopartculasdeorofuncionalizadascadaunaconvarias
lugarenunadisolucindeorocoloidalmarcadoconelanticuerpoprimarioy
ensegundolugarenotradisolucindeorocoloidalmarcadaconunanticuerpo
67
Introduccin
queaumentalaconcentracindelanalito[ChenH.,2006].
OtraestrategiaseguidaparaladeterminacindeinmunoglobulinaGfue
ladesarrolladaporChenZycol.,enestecasoseinmovilizaelanalitosobreun
electrododepastadecarbono,yposteriormenteseincubaenunadisolucinde
anticuerpomarcadoconorocoloidal.Trasaplicaraldispositivounpotencialde
[ChenZ,2007].
humana[Liu,2006].
68
Introduccin
69
Introduccin
Tabla5.InmunosensoreselectroqumicosaplicadosaladeterminacindeInmunoglobulinas
70
Introduccin
Tabla5.InmunosensoreselectroqumicosaplicadosaladeterminacindeInmunoglobulinas
71
Introduccin
Tabla5.InmunosensoreselectroqumicosaplicadosaladeterminacindeInmunoglobulinas
72
PROCEDIMIENTOS
EXPERIMENTALES
Procedimientosexperimentales
procedimientosexperimentalesempleadosenestetrabajo,agrupadosencuatro
desarrolladosenestaTesisDoctoral.
NANOPARTCULASDEORO
mtododereferenciaempleadoparasuvalidacin.
nanopartculasdeoroyTirosinasa
Pretratamientodelelectrododecarbonovitrificado
limpiayreproducible.Paraello,sepuleelelectrodo[Metrohm6.084.010de3
introduceenunbaodeultrasonidosdurante30segundosenetanolyenagua,
alternativamente,repitiendoestaltimaetapadelavadotresveces.Porltimo,
sesecadichasuperficiehaciendopasarunacorrientedenitrgeno.
75
Procedimientosexperimentales
PreparacindelelectrododeTirnAuGCE
Unavezaplicadoalelectrodoelpretratamientodelimpiezaanterior,se
procedealamodificacindelasuperficieelectrdica,siguiendolasetapasque
sedescribenacontinuacin:
carbonovitrificadopretratado.
SesumergeelelectrodoenunadisolucindeHAuCl4(Sigma)de100mgL1,
preparadamediantepesadadirectadelacantidadadecuadadelproductoy
disolucinenAguaMilliQfiltradaatravsdefiltrosdeNylonde0.45m
(Whatman),yseaplicaunpotencialde200mVdurante1minuto.
champin,conunaactividadde2590unidadespormgdeslido)sobrela
superficieelectrdicamodificada.
Sedepositansobreelelectrodo5Ldeunadisolucindetirosinasade91.5
UL1preparadadisolviendolacantidadadecuadadeenzimaenregulador
minutosatemperaturaambiente.Finalmente,seaclaraconaguadestilada.
Conelfindecomprobarelfuncionamientodelbiosensoryverificarquela
respuestaobtenidaesreproducible,stesesumergeenlaclulademedidaque
agitndoseconayudadeunagitadormagnticoaunavelocidadconstante.Se
estacionariocuandoseadicionan10Ldeunadisolucindecatecol1.0x102
76
Procedimientosexperimentales
referencia.
Elbiosensorsealmacenaenelfrigorficoa4C.Antesdellevaracabolas
paracomprobarsucorrectofuncionamiento.
potenciostatoAutolabPGSTAT12equipadoconunsoftwareGPES4.7(General
PurposeElectrochemicalSystem)(Figura4).
Figura4.PotenciostatoautolabPGSTAT12
muestraeldispositivodescrito.
77
Procedimientosexperimentales
Electrodo
Auxiliar
Electrodo de
Referencia
Electrodo de
Trabajo
Figura5.ClulaelectroqumicaBASmodeloVC2
Todaslasmedidassehanrealizadoenreguladorfosfato0.1molL1depH
7.4atemperaturaambiente.
II.1.2. Caracterizacindelrecubrimientoelectrdico
vitrificadomodificadoconnanopartculasdeoro(nAuGCE)ydelbiosensorde
electroqumicasymicroscopiaelectrnicadebarrido(SEM).
78
Procedimientosexperimentales
II.1.2.1.Determinacindelrecubrimiento
Ladeterminacindelacantidaddeorodepositadasobrelasuperficiedel
comprendidoentre0.35y+1.50Venunadisolucindecidosulfrico0.1M
(Sharlab,9597%).Lareduccindelosxidosdeoroformadosenelbarridode
integracinpermitecalcularlacargaimplicadaendichoprocesodereduccin.
tericode482 C/cm2paralacargaasociadaalareduccindeunamonocapa
recubiertapornanopartculasdeorodepositadassobreelelectrododecarbono
vitrificado.
II.1.2.2. Espectroscopiadeimpedanciaelectroqumica(EIS)
medianteestatcnica,serepresentaelsistemaenestudiomedianteunmodelo
paraleloconuncondensador,Cdl,quesimulalainterfaseelectrodo/disoluciny
estasuvezenserieconunasegundaresistencia,RS,talcomosemuestraenla
Figura6.
79
Procedimientosexperimentales
Cdl
Rs
Rct Zw
Figura6.CircuitoequivalentedeRancles
nmerodesistemaselectroqumicos.RSrepresentalaresistenciahmicaentreel
electrolito,laresistenciadeloshilosutilizadosparaconectarlaclulaalsistema
disolucin.
Laresistenciaalatransferenciadecargavaracuandosobreelelectrodo
sedepositanoadsorbensustanciasdiferentes.
LascomponentesRSyZwrepresentanlas propiedadesdeladisolucin
delelectrolitoyladifusindelaespecieredoxenladisolucinrespectivamente.
ocurrenenlasuperficiedelelectrodo.
PorotroladolascomponentesCdlyRct,dependendelascaractersticas
80
Procedimientosexperimentales
inmovilizaroacoplarmaterialessobrelainterfaseestudiada.
impedanciaZfrenteaZobtenidosparacadavalordefrecuenciaaplicada.En
laFigura7semuestraestarepresentacinparaelcircuitodeRandles.
4000
3000 Z=
Z=RsolRs
++RCT
R-CT 2 dl2 Cdl
2-2C
-Z,
2000
1000
Pte = 1
0
Z,
Figura7.DiagramadeNyquist
Comopuedeobservarse,larepresentacindeNyquistmuestraunazona
linealdependienteuno,querepresentaelprocesodetransferenciaelectrnica
electrnica sea muy rpido, el grfico de Nyquist muestra slo la parte lineal,
reginsemicircular.
Cuandolasuperficieelectrdicaesmodificadaconalgnmaterial,puede
penetrenatravsdelmodificadorhacialasuperficieconductoradelelectrodo,
observndoseunaumentodeldimetrodelazonasemicircular.
81
Procedimientosexperimentales
elementos del circuito. As, RS vendr dado por el punto de corte a altas
frecuencias del diagrama de impedancia con el eje real; Rct coincidir con el
siguienteexpresin:
1
Cd l =
max R ct Ecuacin[1]
AdiferenciadeRctyCdl,quesonindependientesdelafrecuencia,Zwes
inversamenteproporcionalalarazcuadradade:
w
Zw = (1 j ) Ecuacin[2]
1 / 2
siendoWelcoeficientedeWarburg:
RT 1 1
w = 1/ 2 + 1/ 2 Ecuacin[3]
2 2
n F A 2 DO Co D R C R
especiesoxidadayreducida,respectivamente.DOyDRsonsuscoeficientesde
difusin,Rlaconstanteuniversaldelosgasesperfectos(R=8.314JK1mol1),T
latemperaturaengradosKelvin,nelnmerodeelectronesqueintervienenen
elprocesoyFlaconstantedeFaraday(96487Cmol1).
Paralaobtencindelosespectrosdeimpedanciasesumergeelelectrodo
detrabajo,eldereferenciayelauxiliarenunaclulaquecontieneunamezcla
deK4Fe(CN)6yK3Fe(CN)61mM(Sigma)decadaunodeellosenmediocloruro
82
Procedimientosexperimentales
intervalo comprendido entre 100 mHz y 10 KHz (20 frecuencias por dcada),
tomndoseparacadafrecuenciaelvalormediodecincomedidasrealizadasde
laimpedancia.
connanopartculasdeoroyconnanopartculasdeoroytirosinasa.
Losexperimentosdeespectroscopiadeimpedanciaelectroqumicasehan
realizadoempleandounpotenciostatoAutolabTypeIIIconunsoftwareFRA
2(Ecochemie)(Figura8).
II.1.2.3. Microscopiaelectrnicadebarrido
sobrelamorfologaytopografadelasuperficiedelosslidos.
para que sea opaca a los electrones) un haz de electrones acelerados por
83
Procedimientosexperimentales
aplicacindeunaltovoltaje,realizandounbarridodelamismasiguiendouna
trayectoriadelneasparalelas.
molculasquenoseandelamuestraaanalizar.Estoseconsigueconpotentes
bombasdevaco,quetrabajanapresionesqueoscilanentre107y1010bares.
Silamuestranoesbuenaconductoraseacostumbraarecubrirlaconuna
cuandoseairradiada.
son electrones de baja energa (decenas de eV) que resultan de la emisin por
(colisionado)conlostomosdelamuestrayhansidoreflejados.Laintensidad
deambasemisionesvaraenfuncindelnguloqueformaelhazincidentecon
lasuperficiedelmaterial,esdecirdependedelatopografadelamuestra.Dela
aparienciatridimensionaldelamuestra.
totalmenteseca,esdecir,exentadeagua.Adems,cuntomsconductoraseala
84
Procedimientosexperimentales
conductoralacarcasadeTefln.Acontinuacin,serecubrenloslateralesdela
microscopioyseobtienenlasmicrografascorrespondientes.
empleandounbiosensordeTirnAuGCE
Laestimacindelndicedepolifenolesenvinossellevaacabomediante
deefectomatriz,seutilizelmtododeadicionesestndarparalaestimacin
del contenido de polifenoles en las muestras. Para ello se registran las seales
medidaquecontiene10mLdeladisolucinreguladorafosfato0.1MapH7.4y
serealizansucesivasadicionesde20Ldeunadisolucinpatrndefenol2.5x
103molL1Lasmedidasamperomtricasserealizanaunpotencialde0.1Ven
disolucionesagitadasmecnicamenteaunavelocidadconstante.
Elcontenidodecompuestosfenlicosobtenido,hasidoexpresadocomo
mgL1decidocafeico.
espectrofotomtricoFolinCiocalteau
85
Procedimientosexperimentales
compuestosfenlicos,originandoxidosazulesdewolframioymolibdeno.
Laaplicacindeestemtodoimplicaseguirelsiguienteprocedimiento:
seadicionan4.2mLdeaguadesionizaday0.5mLdelreactivoFolinCiocalteau
(Sigma)a0.5mLdemuestra(enelcasodevinotintoesnecesariorealizaruna
dilucindelamuestra1:8).Lamezclaesagitadadurante1minutoavelocidad
sdicoal80%(Panreac)y4.2mLdeaguadesionizada.Ladisolucinresultante
sedejaenlaoscuridaddurante2horas,conelfindeconseguirlaestabilizacin
delareaccin.Losproductosobtenidosdelareaccinsemidenaunalongitud
concentracionesdecidocafeico(Sigma,99%).
espectrofotmetroUVvisibleHP8453.
86
Procedimientosexperimentales
preparacindelbiosensor,incluyendolapreparacindelorocoloidal;ascomo
estimacindelcontenidototaldecompuestosfenlicosenmuestrasdeaguasy
dealpechn.
II.2.1. PreparacindelbiosensorcompsitoTirAucolgrafitoTefln
modificadoconorocoloidalyTirosinasa,esnecesarioenprimerlugarpreparar
utilizar se haya limpiado previamente con agua regia, aclarando varias veces
conaguaMilliQpreviamentefiltradaavacoempleandounfiltrodeNylonde
tamaodeporode0.1m(Scharlab).Despuselmaterialsedejasecaralaire
durante48horasantesdesuutilizacin.
(Sigma,99%)al1%ydecitratosdico(Sigma,99%)al1%ysefiltranatravsde
unamembranamicroporosade22m.
87
Procedimientosexperimentales
Acontinuacin,secalientahastaebullicinenvasodeprecipitadosuna
durante15minutos,seadicionan1.25mLdeladisolucindecitratosdicoal
1%(Sigma,99%),agitandovigorosamenteconunavarilladevidrio.Trasunos
coloidalsealmacenaenunrecipientedecolortopacioa4C.
caractersticodenanopartculasdeoroconuntamaomediode16nm[Wang
L.,2006].
1.6
1.4
1.2
Absorbancia (AU)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
400 500 600 700 800 900
(nm)
Figura9.Espectrodeabsorbanciadelorocoloidal
LapreparacindelaspastillasdeTirosinasaorocoloidalgrafitoTefln(70%)
unidadesmg 1enunasuspensinde0.4mLdeunadisolucinreguladorade
ltimo,semezclamanualmentecon415.25mgdeTefln(Aldrich),yseprocede
alacompresinmecnicadelamezcla.Apartirdelapastillamadreobtenidase
preparanvariaspastillasmspequeas,de3.0mmdedimetroconayudade
tornillo de acero inoxidable con punta plana que es introducido por el otro
extremodeltubodeTefln.
coloidalenausenciadeenzima.
Tornillodeaceroinoxidable
PastilladeTirosinasaoro
coloidalGrafitoTefln
Tefln
Figura10.Esquemadelelectrodocompsito
II.2.2. Clculodelaactividadenzimtica
LarespuestaamperomtricadelosbiosensorescompsitosdeTirosinasa
dependedelacantidaddeenzimainmovilizadaenlasuperficiedelelectrodo.
molL1.
ningnpotencialelctrico,porloqueelproductodelareaccinnoesreducido
enzimaactivaenlasuperficiedelbiosensor.
medianteunacurvadecalibrado,enlaqueserepresentandichosincrementos
deabsorbanciaenfuncindelaactividadenzimticaqueseobtieneutilizando
disolucionesdeLtirosinaquecontienencantidadesconocidasdetirosinasaen
tirosinasaentre0y200unidadesdeenzima.
cronoamperometra
serdiferente.
90
Procedimientosexperimentales
Elclculodelreaelectroqumicadeloselectrodossehallevadoacabo
paraunaparejaredoxreversible,quea25C,ysuponiendounelectrodoplano
yunprocesodifusivodelaespecieelectroactiva,es:
ip=(2.69x105)n3/2AD1/2Cv Ecuacin[4]
electronestransferidosenelproceso,Aeselreaelectroqumicadelelectrodo
(cm2),Deselcoeficientededifusindelaespecieelectroactiva(cm2s1),C,es
ferrocianuropotsico5x104MenmedioKCl1M,cuyocoeficientededifusin
esde6.3x106cm2s1a25C[Bard,2001].
0.45V.Lavariacindelacorrienteconeltiempovienedadaporlaecuacinde
Cottrell,
1/ 2
n F A DOx C*
id (t ) = Ecuacin[5]
1/ 2 t 1/ 2
dondeid(t)vieneexpresadaenA,elreadelelectrodoencm2,C*enmolcm3y
cuadradadeltiempo.
91
Procedimientosexperimentales
II.2.4. Clculodelcoeficientededifusindelfenol
concentracinycomoelectrodosdetrabajounelectrododegrafitoTeflnde
grafitoTeflnmodificadoconnanopartculasdeoro.
Lapendientedelarepresentacindelaintensidaddecorrientefrenteala
inversa de la raz cuadrada del tiempo permite, una vez conocida el rea del
electrodo,calcularelcoeficientededifusin[Zare,2006].
II.2.5. Clculodelcoeficientedetransferenciaelectrnicaparaelfenol
sehacalculadoapartirdelclculodelaspendientesdeTafel(pte=2.303RT/
naF)obtenidasadiferentesvelocidadesdebarridodepotencial.Paraello,se
electroactivaylasuperficiedelelectrodo.
electrododegrafitoTeflnmodificadoconnanopartculasdeoro.
II.2.6. Estimacindelcontenidototaldecompuestosfenlicosenaguas
Elcontenidototaldefenoleshasidoestimadoenvariostiposdeaguas,
unasintticaenriquecidaconunamezcladecompuestosfenlicosformadapor
92
Procedimientosexperimentales
Mde4cloro2metilfenol(Aldrich,99%),ytresmuestrasprocedentesdeuna
purificacin.Ladeterminacindelcontenidofenlicoenlasdiferentesmuestras
espectrofotomtricodela4aminoantipirina.
anteriormente.
a)Determinacinmedianteamperometraendisolucionesagitadas.
Paraladeterminacindelcontenidodefenolesenlasmuestrasdeaguas
reguladorfosfato0.1MdepH7.4yseaplicaunpotencialde0.1V.
realizandoadicionessucesivasdeunadisolucinpatrndefenol1.0x104M.
b)Mtodocolorimtricodela4aminoantipirina
Elmtododela4aminoantipirinaesadecuadoparaladeterminacinde
sustituidosenposicinparaporungrupocarboxido,halgeno,metoxilocido
sulfnico.Sinembargo,presentaelinconvenientedenodeterminarlosfenoles
93
Procedimientosexperimentales
enlosquelaposicin paraseencuentrasustituidaporungrupoalquilo,arilo,
nitro,nitrosoaldehdo.
Aunqueelmtodorequiereprocesospreviosdedestilacinyextraccin
lmitededeteccinde0.5gL1
Elprocedimientoseguidoconsiste,enprimerlugar,enlarealizacinde
uncalibradoparafenolenelintervalodeconcentracincomprendidoentre0.05
y2.0mgL1.Cadadisolucindefenolsetratacon1.2mLdeunadisolucinde
hidroxilamina0.5molL1(Panreac),ajustndoseelpHa7.90.1conregulador
obteniendounadisolucindecolorligeramenteamarillento.Seguidamente,se
fritado que contiene una capa de Na2SO4 anhidro. Se mide la absorbancia del
extractoclorofrmicoa460nm.Elequipoempleadopararealizarlasmedidas
espectrofotomtricasesunespectrofotmetroUVvisibleHP8453.
aminoantipirinaesnecesariorealizarunaetapapreviadedestilacin,conelfin
94
Procedimientosexperimentales
posteriormentesemedirnporespectrofotometra.
matrazyseajustaaunpHde4.0concidofosfrico(Scharlab,ACS85%).Sila
fosfrico.
acidificarconcidofosfricovolvindoseadestilar.
Unavezpurificadoslosfenolessehacenreaccionarconladisolucinde
preparacindelcalibrado.
espectrometrademasas
aguayseleaade1gotadecidoortofosfrico.Estevolumensepasaatravs
deuncartuchode500mgdeC18quepreviamentesehaacondicionadocon6.0
mLdemetanol(Sharlab)y3.0mLdeaguadestilada.Loscompuestosfenlicos
95
Procedimientosexperimentales
inyectadadirectamenteenelcromatgrafodegases.
HP59943B.
II.2.7. Estimacindelcontenidototaldecompuestosfenlicosenmuestrasde
alpechn
Ladeterminacindelndicedepolifenolesenmuestrasdealpechnseha
disolucinreguladorafosfato0.1MdepH7.4.Lasmedidasamperomtricasse
realizanaplicandounpotencial de0.1V.Paralaestimacindelcontenido de
Paraelloserealizanadicionessucesivasde20Ldeunadisolucinpatrnde
cidocafeico1.0mM(Sigma,99%).
espectrofotomtricoFolinCiocalteau,descritoenelapartadoII.1.4.
GRAFITOTEFLNMODIFICADOSCONOROCOLOIDALPARALA
DETERMINACINDEPROGESTERONAENLECHE
96
Procedimientosexperimentales
detallaelprocedimientoseguidoparaladeterminacindelaconcentracinde
progesteronaenmuestrasdeleche.
Tefln
LaspastillasdegrafitoTeflnmodificadasconorocoloidalsepreparan
depositansobrelasuperficiedelelectrodocompsito5Ldeunadisolucin0.5
temperaturaambiente.Despussesumergeelinmunosensorenunadisolucin
reguladordedietanolamina(DEA)(Merck,98%)HCl0.1MdepH7.2durante5
minutos,conelfindeminimizarposiblesadsorcionesinespecficas.Finalmente,
dietanolaminadepH10.0.
97
Procedimientosexperimentales
II.3.2. Realizacindelinmunoensayocompetitivosimultneo
Progesteronamarcadaconfosfatasaalcalina(ProgAP)(RidgewayScienceLtd)
yProgesterona(Prog)(Aldrich,98%),alniveldeconcentracindeseado,enuna
ambienteobiendurantetodalanochea4C.
Ladeteccinelectroqumicadelaprogesteronaserealizasumergiendoel
inmunosensorenlacluladetrabajoquecontiene10mLdeunadisolucinde
dietanolaminaHCl0.1MdepH10y1mMdeMgCl2(Merck,99%)yseaplica
unpotencialde+0.3Vagitandoladisolucinavelocidadconstante.Cuandola
disolucinde1naftilfosfato(Fluka>98%)0.1M,monitorizndoselaoxidacin
delnaftol,generadoenlareaccinenzimtica,queseproduceenlasuperficie
delelectrodo.
realizacindelinmunoensayo,ascomolareaccinenzimticaquetienelugar
aladicionarelsustratodelafosfatasaalcalinasemuestraenelEsquema1.
98
Procedimientosexperimentales
Ar-O-P-ONa
* * ONa
* Ar=O
* * Ar-OH e
INMUNOSENSOR INMUNOENSAYO
*
Aucol-grafito-Tefln anti-Progesterona BSA Progesterona Progesterona marcada
con fosfatasa alcalina (AP)
II.3.3. Clculodelcoeficientededifusindelnaftol
concentracinyutilizandocomoelectrodosdetrabajounelectrododegrafito
TeflndegrafitoTeflnmodificadoconnanopartculasdeoro.
obtenidaalrepresentarlaintensidaddecorrientefrentealainversadelaraz
cuadradadeltiempo,secalculaelcoeficientededifusin.
II.3.4. Clculodelcoeficientedetransferenciaelectrnicodelnaftol
procedimientoindicadoenelapartadoII.2.5.
99
Procedimientosexperimentales
Esteparmetrotambinpuedecalcularseapartirdelarepresentacinde
laintensidaddepicofrentealarazcuadradadelavelocidaddebarrido,que
parasistemasirreversiblesa25C,vienedadaporlaecuacin:
ip=(2.99x105)n(na)1/2AD1/2Cv Ecuacin[6]
dondeipeslacorrientedepico(A),nelnmerodeelectronestransferidosenel
proceso,elcoeficientedetransferenciadecarga,naeselnmerodeelectrones
implicadosenlaetapadeterminantedelavelocidaddelprocesoelectrdico,A
concentracinendisolucindelnaftol(molcm3)yveslavelocidaddebarrido
depotencial(Vs1).
relacionadosmediantelaecuacin:
47.7
n a =
(
Ep Ep/ 2) Ecuacin[7]
dondelosparmetrosynasonlosespecificadosanteriormente.
Paraellosehanregistradovoltamperogramascclicosdeunadisolucin
denaftol5x104Menmediodietanolamina0.1MdepH10.0,empleandocomo
modificadoconnanopartculasdeoro.
100
Procedimientosexperimentales
II.3.5. Preparacindelinmunosensorbasadoenelempleodeunbiosensorde
TirAucolgrafitoTeflncomotransductor
(tris(hidroximetil)aminometano)(Sigma,99.9%)0.1MdepH7.0ysedejasecara
BSAal2%yselavaconladisolucinreguladoradepH7.0.
Pararealizarunseguimientodecadaunadelasetapasdemodificacinde
electroqumicaquecontieneK3(Fe(CN)6]/K4(Fe(CN)6enconcentracin5mM
decadaunodeellosenmediocloruropotsico0.1M,yseregistraelespectro
deimpedanciatalycomosedescribeenelapartadoII.1.2.2.
Unavezpreparadoelinmunosensor,sellevaacaboelinmunoensayo,en
estecasodetipocompetitivosecuencial.Paraello,sesumergeelinmunosensor
en10mLdeunadisolucindeProgesteronadeconcentracinvariabledurante
progesteronamarcadaconfosfatasaalcalinadurante40minutos.
potencialde0.1V. Cuandolacorrienteseestabiliza,seadicionan20Ldeuna
101
Procedimientosexperimentales
productodelareaccinenzimticadelfenol(Esquema2).
O
.. .. .. .. *
... ... ... ... * Ar-O-P- ONa
... ... ... ... ** ONa
Ar-OH
..
* e-
.
...
Ar=O
.
Ar-OH
..
... *
... Tir-Aucol-grafito-Tefln anti-Progesterona BSA Progesterona Progesterona marcada
con fosfatasa alcalina (AP)
II.3.6. Determinacindeprogesteronaenleche
InmunosensorbasadoenunbiosensorcompsitoAucolgrafitoTefln
seguidosedescribeacontinuacin.Sediluyen285Ldelecheenriquecidacon
(3.5ngProg/mL)con5Ldeprogesteronamarcadaconfosfatasaalcalinayse
disolucinde1naftilfosfato0.1Mcomosustratodelaenzima.
Comoconsecuenciadelefectomatrizobservado,debidoprincipalmente
102
Procedimientosexperimentales
calibradodeprogesteronaenlecheexentadelanalito.Acontinuacin,elvalor
delaintensidaddecorrienteobtenidapara7muestrasdelecheenriquecida,se
concentracindelanalitopresenteenlamuestra.
InmunosensorbasadoenunbiosensorcompsitodeTirAucolgrafitoTefln
Progesteronaenmuestrasdelecheenriquecidasadosnivelesdeconcentracin,
5.0y1.5ngmL1.Enestecaso,nofuenecesariorealizarningunadilucindela
muestra.
Unavezpreparadoelinmunosensor,seincubadurante30minutos,enla
muestradeleche.Acontinuacin,selavaysesumergeen10mLdedisolucin
concentracindeprogesteronaseanalizamidiendoa0.1Vlareduccindelao
quinonageneradaporlatirosinasaaladicionar20Ldefenilfosfato0.01M.
103
Procedimientosexperimentales
II.4. INMUNOSENSORAMPEROMTRICOPARAINMUNOGLOBULINA
TIROSINASAOROCOLOIDALGRAFITOTEFLN
II.4.1. Preparacindelinmunosensor
seguirunaseriedeetapas.Enprimerlugarseincubaelbiosensorcompsitode
(Sigma)endisolucinreguladora0.1MdepH7.0,conelfindeconseguiruna
biosensor.
bioelectrodoysedejasecaratemperaturaambiente[antiIgG(TirAucolgrafito
disolviendounacantidaddelslidoenelvolumenadecuadodeclorurosdico
mL1seobtienepordilucindelaanteriorcondisolucinreguladoraTRIS0.1
MdepH7.0.
anticuerpo,sesumergeen5mLdeunadisolucindealbminadesuerobovino
empleandoparaellounadisolucinreguladoradeTRIS0.1MdepH7.0.
104
Procedimientosexperimentales
II.4.2. Realizacindelinmunoensayotiposndwich
Unavezpreparadoelinmunosensor[antiIgG(TirAucolgrafitoTefln)],
ste se incuba en una disolucin del analito (IgG), durante 35 minutos. Para
llevaracabolareconstitucindelainmunoglobulinaG(Sigma),sedisuelveel
disolucinde1mgmL1.Disolucionesmsdiluidassepreparanpordilucinde
ladisolucinpatrnendisolucinreguladora.
Porltimo,elinmunosensorsesumergeen10mLdeunadisolucinde
de1700ngmL1durante40minutos.
inmunosensoren10mLdereguladorTRIS0.1MdepH7.0y1mMdeMgCl2.
Ladeteccinamperomtricaserealizaaunpotencialde0.1V,midindosela
reduccindela oquinonageneradaporlatirosinasacuandoseadicionan20L
dedisolucin de fenilfosfato1x103M.
electroqumicatalycomosedescribeenelapartadoII.1.2.2.
II.4.3. DeterminacindeinmunoglobulinaGensueros
105
Procedimientosexperimentales
inmunoglobulinaGde3118mgdL1(Spinreact).
Unavezpreparadoelinmunosensor,seincubdurante35minutosenla
muestradesueroenriquecido.Seguidamente,selavacondisolucinreguladora
mM.Ladeteccinamperomtricaserealizamidiendoa0.1Vlareduccindela
interpolenlarectadecalibradoobtenidaensueroexentodeIgG,siguiendoel
procedimientodescritoenelapartadoII.4.2.
seguidofueelmismoqueeldescritoparaelsueroenriquecido.
106
RESULTADOS Y
DISCUSIN INTEGRADA
Resultadosydiscusinintegrada
ComoyasehapuestodemanifiestoenlaIntroduccin,lamodificacin
desuperficieselectrdicasconnanopartculasdeoropermitelainmovilizacin
paralaconstruccindebiosensoreselectroqumicos.As,sehademostradoque
elevadosnivelesdeestabilidadysensibilidad.
biosensoresenzimticos,ascomovariosinmunosensoresbasadosenelectrodos
modificadosconestenanomaterial.Acontinuacinsediscutenlosaspectosms
relevantesdelosresultadosobtenidos,agrupndolosendospartesprincipales:
BiosensoresdeTirosinasautilizandodiferentessuperficieselectrdicas
modificadasconnanopartculasdeoro.
nanoestructurados.
109
Resultadosydiscusinintegrada
MODIFICADASCONNANOPARTCULASDEORO
empleodediferentesestrategiasdemodificacindelasuperficieelectrdica.
Enlaprimeradeellassellevaacabolamodificacindeunelectrodode
nanopartculasdeoro,apartirdeunadisolucindeHAuCl4;lascaractersticas
modificado.
formanpartedelamatriztridimensionalmediantesimpleinclusinfsica.
Enlosapartadosqueseexponenacontinuacinsecomentanalgunosde
tirosinasa,ascomoalgunosresultadosexperimentalesquenoserecogieronen
laspublicacionescorrespondientes.Finalmenteseestablecerunacomparacin
comentndoselasventajaseinconvenientesdecadaunodeellos.
110
Resultadosydiscusinintegrada
NANOPARTCULASDEOROELECTRODEPOSITADAS
Sellevaronacabodiversosestudiosencaminadosalacaracterizacinde
deoro,ascomodelpropiobiosensordetirosinasa(TirnAuGCE),empleando
deldiseobasadoenelempleodenanopartculasdeoro.
III.1.1.1. Caracterizacinmediantetcnicaselectroqumicas
utilizadapararealizarunseguimientodecadaunadelasetapasimplicadasen
obtenidosmedianteestatcnica,quenoaparecenenlosartculospublicadosy
secomparanconlosobtenidosmediantevoltamperometracclica.
EnlaFigura11serepresentanlosgrficosdeNyquistcorrespondientesa
comparativossemuestratambineldiagramadeNyquistcorrespondienteaun
electrododecarbonovitrificadosinmodificar(GCE).
carbonovitrificadomuestraunaregincircularmayorqueenpresenciadelas
111
Resultadosydiscusinintegrada
nanopartculasdeoro,dondeseobtieneundiagramadeNyquistsemejanteal
pequeodimetro,loqueponedemanifiestounadisminucindelaresistencia
alatransferenciadecargaconrespectoalelectrodosinmodificar,yuntramo
controlada por difusin [Lu, 2002]. Por otro lado, el biosensor de carbono
semicrculodemayordimetroqueelobtenidoenausenciadelaenzimaycon
elelectrodosinmodificar.
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
Z' ,
Figura11. DiagramasdeNyquistde()GCE,()nAuGCEy()TirnAuGCEen
disolucinK4Fe(CN)6/K3Fe(CN)65mMenKCl1M.
grficasdeNyquistsepuedecalcularla resistenciaalatransferenciadecargayla
112
Resultadosydiscusinintegrada
ParaelbiosensorTirnAuGCE,larepresentacindeNyquistrevela,comoera
deesperar,unaresistenciaalatransferenciadecargamayorqueenausenciade
sobrelasuperficieelectrdicamodificada.
Porotraparte,lapresenciadesemicrculosdeprimidosenlazonade
originacomoconsecuenciadelamodificacindeladistribucindecargadela
superficieelectrdica.Estefenmenoesparticularmenteimportantecuandose
incorporaunacapadeprotenasobrelasuperficie[Katz,2003].
Laexpresinmatemticacorrespondiente alelementodefaseconstante
es:
1
CPE = Ecuacin[8]
A ( jw )
n
delcircuitodeRandles,conunvalorcomprendidoentre0.5<n<1.Enelcaso
dequenseaigualalaunidad,lasuperficieescompletamentelisayelelemento
Cdl.Amedidaqueaumentalarugosidadelvalordenseaproximaa0.5
113
Resultadosydiscusinintegrada
nanopartculasdeoro,esnecesariosustituirelcondensadorporunelementode
faseconstante(CPE),comoocurreconunagranpartedeloselectrodosslidos.
SeobtuvieronvaloresdeCdlparaelnAuGCEde0.7Fyde6F(n=0.87)para
elbiosensordetirosinasa,mientrasqueparaelelectrododecarbonovitrificado
seobtuvounvalorCPEde4.2F.
electrnica,ko,quepuedecalcularseapartirdelamedidadelaresistenciaala
expresiones,
RT
Rct = Ecuacin[9]
nFi0
i0 = nFAk C* Ecuacin[10]
dondeAeslasuperficiedelelectrodoencm2,C*laconcentracindelaespecie
enmolcm3,Rctlaresistenciaalatransferenciadecargaen,iolacorrientede
reaccinyFlaconstantedeFaraday96487J/Kmol.
ApartirdelosvaloresdeRctmencionadosanteriormenteyaplicandolas
esperar,elvalordedichaconstanteesaproximadamente7vecessuperiorconel
114
Resultadosydiscusinintegrada
potsicosobreunsustratoelectrdicomodificadoconnanopartculasdeoro.
tirosinasa(TirnAuGCE).
25 A
nanopartculasdeoro,produceunaumentonotabledelascorrientesdepicoen
separacinentrelospotencialesdepicoandicoycatdico,loquenuevamente
115
Resultadosydiscusinintegrada
con nanopartculas de oro. Sin embargo, aunque las corrientes de pico son
entrelospotencialesdepicoandicoycatdicoesmenorquesobreGCE.Por
modificadoconnanopartculasdeoro(nAuGCE).
ElcoeficientedeWarburgpuedecalcularsemedianteextrapolacindela
reginlinealdebajasfrecuenciasdelgrficodeNyquist(Z=RS+Rct W2 Cdl).
Sin embargo, dado que la regin circular en el caso del electrodo modificado
frecuencias,siendolapendienteobtenida,de0.555,inferioralaunidad.
8000
7000
GCE
-1/2
6000 pte= 1288 s
r=0.9999
5000
Z ',
4000 nAu-GCE
-1/2
3000
pte= 1665 s
r= 1
2000
1000
0
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
-1/2
f , s -1/2
Figura13. Representacionesdelaimpedanciafaradaicaenfuncindef1/2paranAu
GCEyGCE.
116
Resultadosydiscusinintegrada
nAuGCEyGCEpuedencalcularseloscoeficientesdedifusinparaelparredox
encuestin.Comoeradeesperar,losvaloresdeloscoeficientesdedifusinson,
en ambos casos, del mismo orden, 4.1x107 y 6.8x107 cm2 s1, respectivamente,
dadalaausenciadeenzimaenambassuperficies.
III.1.1.2. AspectosmsrelevantesdelbiosensorTirnAuGCE
decarbonovitrificadomodificadoconnanopartculasdeoroelectrodepositadas
como son, una buena repetibilidad de las medidas (R.S.D. =3.6%, n=6) sin
necesidaddeaplicarunpretratamientodelimpieza,unabuenaestabilidadenel
vinos,empleandounprocedimientoextremadamentesimple.
biosensoresdetirosinasaqueimplican,bienlaausenciadenanopartculasdeoro
sustrato.
paracatecolenunintervalodeconcentracinde1x105a5x105M,obtenidoscon
paralapreparacindecadaunodeellos.
117
Resultadosydiscusinintegrada
CONFIGURACIN
PREPARACINDELBIOSENSOR *PENDIENTE,AM1
ELECTRDICA
1)Electrodep:E=0.2Vt=1min
TirnAuGCE 2)5LdeTirde91.3UL1 0.1022
3)30minenGA
1)5LdeTirde91.3UL1
TirGCE 0.0012
2)30minenGA
1)5LdeTirde91.3UL1
TirAuE 0.0568
2)30minenGA
*Intervalodeconcentracin1x1055x105Mcatecol
lasnanopartculasdeoro,yaproximadamenteeldoblequelaobtenidacuando
seinmovilizalatirosinasadirectamentesobreunelectrododeoroconvencional.
Esteaumentodesensibilidadpuedeatribuirseaquelasnanopartculasdeoro
movimientodelaenzimainmovilizadadebidoaunaciertadistanciaentreellas,
entres,loqueconfiereunamayorrigidez.Esteltimohechoesconsistentecon
observadacuandosemodificalasuperficiedelelectrododecarbonovitrificado
casos,unamayorcantidaddeoroelectrodepositadaseasemejacadavezmsa
unelectrododeoroconvencional.
118
Resultadosydiscusinintegrada
vinos.
Estaestimacinesdegranintersdadalacorrelacinqueexisteentrela
capacidadantioxidanteyelcontenidodepolifenoles.
Tanto los vinos tintos como los blancos han sido analizados llevando a
caboelprocedimientodescritoenelapartadoII.1.3,queimplicanicamentela
adicindeunaalcuotadevinoalaclulaelectroqumicaysucesivasadiciones
deunadisolucinpatrndefenolaplicndoseelmtododeadicionesestndar.
diferentesensibilidadobservadasobreelbiosensorTirnAuGCEparacadauno
deloscompuestosfenlicos.
llevaracabounaestimacindelcontenido totaldepolifenolesenestetipo de
muestras.Lapreparacindelasmuestrasylarealizacindelcalibradodecido
cafeicosehanllevadoacabotalcomosedescribeenelapartadoII.1.4.
obtencindeambostiposdevino.
119
Resultadosydiscusinintegrada
Tabla7. Estimacindelcontenidodecompuestospolifenlicosenvinosempleando
unbiosensordeTirnAuGCE
Mtodo
Vino Biosensor*
Espectrofotomtrico*
*expresadocomomgL1decidocafeico
presentanambosmtodosparaladeterminacindelosdiferentescompuestos
determinacindecompuestosfenlicosycatecolescon,almenos,unaposicin
inconvenientedequeelreactivoempleadopuedereaccionartambinconotros
compuestosdenaturalezanopolifenlica,queinterfierenalahoradellevara
porloquesehanensayadocomoposiblesinterferentesconelbiosensordeTir
utilizadas.
120
Resultadosydiscusinintegrada
correspondientesadosdelasmuestrasanalizadas,unadevinotintoyotrade
vinoblanco,trasaplicarelmtododeadicionesestndar.
(A) (B)
+20Lfenol 2.5mM
+10Lfenol 1mM
+270Lvino blanco
+270Lvino tinto
1min
0,02A
0.2A
100s
Figura14. RegistrosdeintensidadtiempoobtenidosconelbiosensorTirnAuGCEen
disolucinreguladoradefosfato0.1M,pH7.4(A)enunamuestradevino
tintoSotillo, (B) en muestra de vino blanco Dulce por el mtodo de las
adicionesestndar.Eap.:0.1V.
estimacindelcontenidodeloscompuestosfenlicosporambosmtodos.
121
Resultadosydiscusinintegrada
60
50
30
20
10
0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Folin-C iocalteau (m g/L ac. cafeico)
Figura 15.Correlacinentrelosresultadosobtenidosparalaestimacinelcontenido
de compuestos fenlicos en muestras de vino empleando el biosensor Tir
nAuGCEyelmtododeFolinCiocalteau.
mtodos, puede verse que se consigue una buena correlacin entre ellos
(r=0.990),loqueponedemanifiestolaaplicabilidaddelbiosensordesarrollado
polifenolesenvinos.
122
Resultadosydiscusinintegrada
III.1.2.BIOSENSORDETIROSINASABASADOENUNELECTRODOCOMPSITO
DEGRAFITOTEFLNMODIFICADOCONNANOPARTCULASDEORO
comparacin con los electrodos convencionales formados por una sola fase
loslmitesdedeteccin,constituyendostaunadelasprincipalesventajasdel
empleodeestosmateriales.Asimismo,altratarsedeunamatriztridimensional,
superficieelectrdicaporsimplepulido.
biosensorcompsitodetirosinasmodificadoconorocoloidal,capazdeestimar
alpechines.
electroqumicas
123
Resultadosydiscusinintegrada
modificadosysinmodificarconlasnanopartculas(TirAucolGTyTirGT).
2500
x1 02
2300
23
20 x1 02
2000
x1 02
1800
18
x1 02
1500
15
Z,
x1 02
1300
13
x1 02
1000
10
800
8 x1 02
500
5 x1 02
300
3 x1 02
0. x1002
-0. x102 5 x1 0 2 10 x1 02 15 x1 02 20 x1 02 25 x1 02 30 x1 02 35 x1 0
0 500 1000 1500
Z' / o h m2000 2500 3000 3500
Z,
carga,Rct,calculadosapartirdeldimetrodelsemicrculodelosdiagramasde
presenciadenanopartculasdeoroloqueponedemanifiesto,unavezms,que
lamodificacinconorocoloidalfacilitalatransferenciaelectrnica.
resistenciaalatransferenciadecargaesmayorqueenausenciadeenzima,lo
superficiedelelectrodo.Asimismo,laresistenciaalatransferenciadecargadel
biosensorcompsitopreparadoenausenciadelnanomaterialessuperioraldel
mismobiosensormodificadoconnanopartculasdeoro.
124
Resultadosydiscusinintegrada
ComopuedeobservarseenlaFigura16,enningncasollegaaapreciarse
controldifusivo.
Porotraparte,sehacalculadola constantedetransferenciaelectrnica,ko,a
partirdelaresistenciaalatransferenciadecargamedidaenlaregindealtas
frecuenciasdelosdiagramasdeNyquist,haciendousodelasecuaciones[9]y
[10].EnlaTabla8semuestranlosvaloresdekoobtenidos,paraloselectrodosde
obtenindoseunmayorvalordedichaconstante.
compsitos,entodosloscasosdichovalorsealejadelaunidad,porloqueenel
circuitodeRandlesdebetenerseunelementodefaseconstanteenlugardeun
biosensoresdetirosinasasealejananmsdelaunidad,aproximndosea0.5
msqueenelcasodelospropioselectrodosenausenciadelaenzima,loquese
2003].
125
Resultadosydiscusinintegrada
Elclculodelreaactivadeloselectrodosnecesariaparaelclculodela
electrodosporlasdiferentestcnicas.
Tabla9.ClculodelreaactivadeloselectrodosAucolGTyGT.
VOLTAMPEROMETRA
ELECTRODO CRONOAMPEROMETRA(cm2)
CCLICA(cm2)
AucolGT 0.170.04 0.160.02
GT 0.07270.007 0.0700.008
muy similares, obtenindose, como era de esperar, un mayor valor del rea
biosensoresparaunadisolucindeferrocianuropotsico5x104MenKCl1M.
25 A
E/V
Figura17. Voltamperogramascclicosdeferrocianuropotsico5x104MenKCl1M
a0.3V/s..()grafitoTeflny()AucolgrafitoTefln.
126
Resultadosydiscusinintegrada
presenciadelasnanopartculasdeoroenlamatrizproduceunaumentoenlas
probablementeesdebidoadichoaumentodelreasuperficialactiva.
electrnicaparaelfenol()sobreelelectrodocompsitodegrafitoTeflnysobre
esteelectrodomodificadoconnanopartculasdeoro.Paraellosehanempleado
procedimientosdescritosenlosapartadosII.2.4yII.2.5.
potencialdesdeunvaloralcualnotienelugarelectrolisis(i=0)hastaunvaloral
cualelprocesoestcontroladopordifusin.Laeleccindedichospotenciales
correspondientes,quesemuestranenlaFigura18dondesehansealadodichos
valoresdepotencial(0.5y0.8V).
I -4
0.100x10
+
-4
0.050x10 I
-0.100x1 0 -4
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.
E/V
Figura18 Voltamperogramascclicosparaunadisolucindefenol0.5mM( )y
unadisolucindefondo().MedioTRIS0.1MapH7.0;v=50mV/s
(a)grafitoTeflny(b)AucolgrafitoTefln.
127
Resultadosydiscusinintegrada
correspondientesadisolucionesdefenoldediferenteconcentracinempleando
calculadoapartirdelarepresentacindelaspendientesdelasrectasanteriores
enfuncindelaconcentracindefenolutilizandolaecuacindeCottrell[Zare,
2006].
12 y = 19.875x + 0.937
r = 0.999
10 y = 13.363x + 0.894
(a) (b) 8 r = 0.998
4 y = 10.297x + 0.638
i, A
6 r = 0.999
4 y = 7.572x + 0.416
2.5A r = 0.987
2 1
0
y = 1.683E+01x + 2.757E-06
Sensibilidad, A s
30
r= 0.96
20
10
0 8.0 13.0 18.0 23.0 28.0 33.0 38.0 43
0
t/s
0.E+00 2.E07 4.E07 6.E07 8.E07 1.E06
[Fenol], m ol/cm 3
128
Resultadosydiscusinintegrada
i, A
r=0.998
12
y = 29.521x + 2.1714
7 1 r=0.995
5A
2
0 0.2 0.4 0.6 0.8
1/ t 1/2
(c)
Figura20. (a) Respuesta cronoamperomtrica del electrodo AucolgrafitoTefln en
medio regulador TRIS 0.1 M de pH 7.0 a 0.8 V para diferentes
concentracionesdefenol.Losnmeros13correspondenafenol0.5,0.7y
0.9 mM. (b) Representacin de i vs. 1/t1/2 obtenidas a partir de los
cronoamperogramas. (c) Representacin de las pendientes vs.
concentracindefenol.
106yde4.52x106cm2/sempleandoelelectrododegrafitoTeflnyelelectrodo
conamboselectrodossonmuysimilarescomoeradeesperar,dadalaausencia
dificultarelaccesodelanalitoalasuperficiedelelectrodo.
Severificlainfluenciadelavelocidaddebarridodepotencialsobrela
correspondientes.
129
Resultadosydiscusinintegrada
(a) (b)
-4 -4
10 A
-4
0 0.x10-4
-4
0 0.x10-4
-4
0x10-4
-4
0 -0.x10-4
-4 -4
0 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
-0.x10
1.10.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1
E/V E/V
Figura 21.Voltamperogramascclicosobtenidosparaunadisolucindefenol5x104
MenmedioTRIS0.1MdepH7.0sobreunelectrododegrafitoTefln(a)
yAucolgrafitoTefln(b)a diferentesvelocidades debarrido, 5, 20,
50,100,200,300mV/s.
Losvaloresdelaintensidaddecorrientedepicoydelospotencialesde
picoparaunadisolucindefenol5x104MserecogenenlaTabla10.
v, ip,A Ep,mV
mV/s
GT AucolGT GT AucolGT
10 1.18 1.81 674 620
20 2.23 2.79 691 630
25 2.43 3.66 693 632
50 4.86 6.69 682 644
100 7.85 9.92 700 671
200 12.2 16.1 724 674
300 17.1 20.9 735 693
500 23.4 23.7 739 720
750 27.7 35.2 741 744
130
Resultadosydiscusinintegrada
electrododegrafitoTefln.
Encuantoalaintensidaddecorriente,seapreciaunaumentodesuvalor
conlavelocidaddebarridoconamboselectrodos,siendolamagnituddedicha
corrientemayorenelcasodelelectrodomodificadoconnanopartculasdeoro,
dadoelconocidoefectocatalticoqueejercenlasnanopartculasdelmetal.Enla
comprendidaentre0.5y1.0,loqueindicaquesetratadeunsistemaquenoest
totalmente controlado por difusin, sino que presenta una cierta contribucin
deadsorcin[Xiao,2008].
-6
-5.8 log ip = 0.7286 log v - 4.4194
-5.6 R2 = 0.9946
-5.4
-5.2
log ip
-5
-4.8 log ip = 0.6681 log v - 4.3548
R2 = 0.9901
-4.6
-4.4
-4.2
-4
0 -0.5 -1 -1.5 -2 -2.5
log v
131
Resultadosydiscusinintegrada
parmetro naparaelfenolsobreambostiposdeelectrodos.Laspendientesde
electrodo[Banks,2005].Paraello,esnecesariolaeliminacindelacontribucin
potencialespreviosalaoxidacindelfenol.Deestaforma,losvaloresmedios
modificadoconnanopartculasdeorohansidode0.43y0.48respectivamente.
Estosvaloresponendemanifiestoqueelnmerodeelectronesintercambiados
consistentes con los obtenidos por otros autores empleando otros materiales
electrdicos[Hart,1997].
III.1.2.2. AspectosmsrelevantesdelbiosensorTirAucolGT
Lasventajasdecombinarelempleodeunamatrizcompsitacomoesla
mejoranlasobtenidasconotrosbiosensoresdetirosinasayaexistentes.Porotra
parte,laregeneracindelasuperficiedelbiosensoryportantodesuactividad,
mediante un simple pulido, junto con las ventajas que proporcionan las
estabilidadytiempodevidatil.
132
Resultadosydiscusinintegrada
encontradosenlabibliografa,incluyendolasproporcionadasporelbiosensor
compsitoTirAucolGTdesarrolladoenestaMemoria.
Tiempode
Electrodo Sensibilidad* LD,M KMapp,M Ref.
vidatil
Retiene 30% de la
TirPEDTGCE 608mAM cm 1 2 0.05 actividad despus [Verdne,2003]
de12das
Retiene 94% de la
TirsolgelTiO2 103mAM 1 0.1 2.9x10 4 actividad despus [Yu,2003]
de80das
Retiene 73% de la
TirsolgelSiO2 23.1mAM 1 0.1 actividad despus [Wang,2000]
de3semanas
[Campuzano,
TirMPAAuE 13.9mAM1 0.088 1.5x104 5das
2003]
Tir/GDHClark 6.6mAM1 0.01 [Streffer,2001
TirRVC 8.2mAM1 0.26 20das [Pea,2001]
*Expresadacomopendientedelcalibrado;GCE:electrododecarbonovitrificado;PEDT:
poli(3,4etilendioxitiofeno); MPA: cido 3mercaptopropionico; GDH. Glucosa
deshidrogenasa; RVC: carbono vtreo reticulado; SPCE: electrodo de carbono
serigrafiado;CPE:electrododepastadecarbono;GT:grafitoTefln.
133
Resultadosydiscusinintegrada
EsdedestacarcomoelbiosensordeTirAucolGTpermiteconseguiruna
mejorasignificativaenlasensibilidadparaladeteccindelfenol,talycomose
deducedelvalorobtenidoparalapendientedelcalibradodedichocompuesto,
que es, como mnimo, un orden de magnitud ms elevada que las reportadas
electrdicasmssensibles,puedededucirsequelapresenciadelorocoloidalen
lamatrizcompsitaeselresponsabledelmarcadoincrementoqueseproduce
enlasensibilidad.
Encuantoallmitededeteccin,slodosdelosbiosensoresrecogidosen
laTablaposeenunvaloralgoinferioralobtenidoconelelectrodoTirAucolGT
desarrollado,apesardeposeerambosunasensibilidadmuyinferior(62.3y23
mAM1frentea540mAM1).
aproximadamenteunorden de magnitudmenorqueloscalculadosparaotras
configuraciones,loqueindicaunamayorafinidaddelaenzimaporelsustrato
utilizando esta configuracin y, por tanto, una mayor sensibilidad. Este hecho
inmovilizacindelabiomolculasobrelasnanopartculasdeoro.
vidadelosdistintosbiosensoresqueaparecenenla Tablavaramuchodeunas
134
Resultadosydiscusinintegrada
posibilidadderegenerarlasuperficieelectrdicaporsimplepulidoy,porotra,
2003].
loscompuestosfenlicosestudiadosconambosbiosensores.
Intervalo Lmitede
Biosensor Sensibilidad(mA/M)
Lineal(M) Deteccin(M)
Fenol
TirAucolGT 0.0254.0 540 0.02
TirGT 0.125 280 0.099
3,4Dimetilfenol
TirAucolGT 0.052.0 563 0.011
TirGT 0.16 520 0.1
4Cloro2Metilfenol
TirAucolGT 10275 9 3.3
TirGT 50100 3 23
Comopuedeapreciarse,lamodificacindelbiosensorcompsitoconlas
135
Resultadosydiscusinintegrada
biosensordeTirGT,consiguindoseunamayorsensibilidadymenoreslmitesde
deteccinparaladeterminacindelosdiferentescompuestosfenlicos.
reduccindelaquinonaenlasuperficieelectrdicay/oalareaccinenzimtica
deoxidacindelcatecolaquinona,sehanrealizadomedidasdelaintensidad
decorrienteenestadoestacionarioparaunadisolucinde2,4benzoquinona5
nanopartculasdeoro.Asimismo,sehanrealizadomedidascorrespondientesa
lasintensidadesencadacaso.
2,4BENZOQUINONA FENOL
ELECTRODO
5M,A 5M,A
GT (0.04640.002)
AucolGT (0.1060.008)
TirGT (0.940.10)
TirAucolGT (2.10.3)
electrododegrafitoTeflncomoconelbiosensordetirosinasa.Larespuestadel
las nanopartculas de oro que con el que no las contiene. Estos resultados
136
Resultadosydiscusinintegrada
reduccinelectroqumicadelacorrespondienteoquinona[LiuY.,2003].
porotrosmtodosanalticosdeusocomn.
caractersticas.Laprimeradeellasconsistienunamuestrasintticapreparada
enellaboratorio,quefueenriquecidacontrescompuestosfenlicosdiferentes,
M.Estoscompuestosseeligierondebidoaladistintasensibilidadconlaque
sondetectadosconelbiosensordetirosinasa,yporsudiferentepolaridad.Las
otras tres muestras de agua analizadas proceden de una refinera y han sido
tomadasendiferentesdasyendistintasetapasdelprocesodepurificacin.El
adicionesestndaryexpresndoseelndicefenlicocomomol/Ldefenol.
Losresultadoscorrespondientesalasdiferentesmuestrassecompararon
obtenido por ambos mtodos para una misma muestra proporciona un valor
137
Resultadosydiscusinintegrada
estosmtodoshacialosdiferentescompuestosfenlicos.Enelcasodelmtodo
espectrofotomtrico,ladiferenciaenlarespuestasedebeaquelaestructuradel
compuestofenlicoinfluyeenlainteraccinconla4aminoantipirina.As,por
muestras que contienen estos compuestos. Por otro lado, las muestras que
compuestosfenlicosquepresentanocupadalaposicinorto.
TirAucolGT Mtodoespectrofotomtrico
MUESTRA
(molL1fenol) 4aminoantipirina(molL1fenol)
Enriquecida (3.90.4)x106 (1.10.2)x106
M1 (102)x106 (1.50.4)x106
M2 (61)x106 (1.200.04)x106
M3 (1.10.2)x104 (5.50.4)x106
Apesardelasdiferenciasenlosvaloresnumricosqueseobtienenpor
metodologascuandoserepresentandichosvalores,loqueponedemanifiesto
138
Resultadosydiscusinintegrada
anlisisconsiderablementemenorrespectoalmtodoespectrofotomtrico.
alpechnesunlquidonegruzcooriginadoenlasalmazarascomosubproducto
entreotroscompuestos)yalagrancantidaddesustanciasdisueltasqueposee.
Sudegradacinenlanaturalezaoenplantasdepuradorasesdifcil,porloque
natural,sucomposicinnoesconstante,variandosegneltipodeaceituna,la
estacin,tipoderecogidaysobretodoconelprocesoindustrialempleadoenla
obtencindelaceite.
Martos2a,bycprocedendeunaalmazaraenlaquelaobtencindeaceitede
compuestosfenlicossuperiorqueenlasmuestrasresultantesdelempleodeun
extraccinporcentrifugacin,dedosfasesenlaprimeraydetresfasesenlas
dosltimasmuestras.
preparadoenellaboratorio[Mena,2005b],ascomolosproporcionadosporel
139
Resultadosydiscusinintegrada
contenido fenlico se expresa como g/L de cido cafeico. Cada uno de los
de0.05.
Tabla15.Estimacindelcontenidodecompuestosfenlicosenalpechn
BIOSENSOR MTODO
(gL1c.Cafeico) ESPECTROFOTOMTRICO
MUESTRA
FOLINCIOCALTEAU
TirAucolGTLacNSTPAuE (gL1c.Cafeico)
Badajoz 0.2550.002 0.0630.008 0.2700.009
Martos1 0.4160.002 0.130.01 0.3520.005
Martos2 3.50.7 1.70.2 7.20.5
Villarejo 0.220.03 0.0830.005 0.580.02
Martos2a 1.50.1 0.770.04 3.60.2
Martos2b 1.70.3 0.560.07 2.40.2
Martos2c 0.70.1 0.500.03 1.80.1
Elempleodelbiosensordetirosinasadesarrolladoimplicalamedidade
reguladoradefosfato0.1MdepH7.4aplicandounpotencialdemedidade0.1
V.Enelcasodelbiosensordelacasaseemplereguladorcitrato0.1MdepH
5.0aplicndoseunpotencialde0.0V[Mena,2005b].Enamboscasosseaplicel
mtododeadicionesestndar.
EnlaFigura23semuestralarepresentacingrficacorrespondientealos
resultadosobtenidosutilizandoambosbiosensores.
140
Resultadosydiscusinintegrada
1.8
1.6
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
Figura23.Correlacinentrelosresultadosobtenidosparalaestimacindelcontenido
decompuestosfenlicosenmuestrasdealpechnempleandolosbiosensores
deTirAucolGTydeLacNSTPAuE.
biosensores,obtenindoseunaordenadaenelorigenqueincluyeelcero,loque
enzimticosempleados,porlosdiferentescompuestosfenlicos.Dehecho,hay
con dobles enlaces conjugados como es el caso del cido cafeico. Este hecho
141
Resultadosydiscusinintegrada
obtenidosconambosbiosensores.
Porotraparteenla Figura24serepresentanlosvaloresobtenidosconel
proporcionadosporelmtododeFolinCiocalteau.
4.0
3.5
Tir-Aucol-GT (g/L ac. cafeico)
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Folin-Ciocalteau (g/L ac. cafeico)
Figura24.Correlacinentrelosresultadosobtenidosparalaestimacindelcontenido
de compuestos fenlicos en muestras de alpechn empleando el biosensor
TirAucolGTyelmtodoespectofotomtricodeFolinCiocalteau.
consecuenciadeladistintasensibilidadexistenteentreambasmetodologas.
Finalmentecabedestacarlabuenacorrelacin(r=0.996)entreelbiosensor
detirosinasayelmtodoespectrofotomtricodeFolinCiocalteau,loquepone
demanifiestolaaplicabilidaddelmtododesarrollado.
142
Resultadosydiscusinintegrada
GT
EnestaMemoriasehanpreparadodosbiosensoresbasadosenlaenzima
tirosinasaparaladeterminacindecompuestosfenlicosendiferentestiposde
muestras.Comoyasehacomentado,encadaunodeellossehaempleadoun
dependiendodelamatrizelectrdicaempleada,quepresentanalgunasventajas
ascomotambinalgunosinconvenientes.
Encuantoalbiosensordetirosinasaqueutilizaunelectrododecarbono
electrdicasehallevadoacabomedianteelectrodeposicin.Esteprocedimiento
demodificacindelasuperficieconelnanomaterialresultaserbastantesimple
yrpido,comparadoconotrosprocedimientosquerequierenlapreparacinde
unadisolucindeorocoloidal,enlosquelasnanopartculasmetlicasforman
necesarioenlaelectrodeposicin.Unadelasprincipalesventajasquepresenta
nanopartculasdeorojuntoconlaenzimaenelinteriordelamatrizelectrdica
regenerarlasuperficieelectrdicaporsimplepulido.
143
Resultadosydiscusinintegrada
diferentesestudiosdeoptimizacin.EnlaTabla16serecogenelintervalolineal,
lapendientedelcalibrado,ascomoloslmitesdedeteccinobtenidosencada
caso.
Catecol
144
Resultadosydiscusinintegrada
electrodepositadas.
lasmedidasyunaelevadareproducibilidadensufabricacin.
muestrasrealesconresultadossatisfactorios.
145
Resultadosydiscusinintegrada
SUPERFICIESCOMPSITASNANOESTRUCTURADAS
especificidadnecesariaparaestetipodeanlisis,mientrasqueelprocedimiento
bajocostedelainstrumentacinyenlafabricacindelosbiosensores.
caractersticas,desensibilidad,selectividadydeestabilidadoperacional.
respectivamente.
146
Resultadosydiscusinintegrada
DEPROGESTERONA
Laimportanciadeldesarrollodedispositivosquepermitanobtenerbajos
defertilidaddelasvacas,yaquetraslaovulacinlosnivelesdeprogesterona
electroqumicosparaladeterminacindeestahormona,unodeellosbasadoen
elempleodelelectrodocompsitoAucolgrafitoTeflnyelotroenlautilizacin
deunbiosensordeTirAucolgrafitoTeflncomotransductoramperomtrico.
correspondientes.
NANOPARTCULASDEORO
nanopartculasdeoro
Elnaftilfosfatofueescogidocomosustratodelaenzimafosfatasaalcalina
inmunosensordeprogesterona.Dadoqueelproductodelareaccinenzimtica
147
Resultadosydiscusinintegrada
electroqumicadelnaftolsobrelassuperficieselectrdicasempleadas.
comparativos,sellevacaboelmismoestudiosobreunelectrodosinmodificar
conelnanomaterial.
dietanolamina0.1MdepH10.0sobreambassuperficieselectrdicas.
00x10 -4 10A
10A 0.200x10 0.200x10 -4
-4
00x10
i/A
i/A
-4
00x10
0 0
-4
0x10
-4
-4
-0.100x10 -0.100x10
0x10 -4
-4
-4 0.400x10 -4-0.200x10
-0.3 -0.2
-0.3 -0.2 -0.1
-0.1 00 0.1 0.2
0.1 0.2 0.3
0.3 0.4
0.4 0.5
0.5 0.6
0.6
-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
-4
E/V 0.300x10 -4 E/V
0.200x10
148
Resultadosydiscusinintegrada
menospositivosqueenausenciadelnanomaterial,loqueseatribuyealefecto
fenlico.
modificadoconnanopartculasdeoro,atribuibleigualmentealefectocataltico
queejercenlasnanopartculasdelmetal.
superficieselectrdicas,observndoseunajustelinealenamboscasos.Cuando
seempleunelectrododegrafitoTeflnmodificadoconnanopartculasdeoro
sistemaquenoesttotalmentecontroladopordifusin,sinoquepresentauna
ciertacomponentecataltica.Porotrolado,cuandosetrabajconunelectrodo
degrafitoTeflnseobtuvounvalordelapendientedelarectamuyprximaa
0.5,loqueindicaqueenestecasoelprocesosestcontroladopordifusin.
149
Resultadosydiscusinintegrada
-6.0
log ip= 0.6723 log v- 4.4032
R2 = 0.9867
-5.5
log ip
-5.0
-4.0
-2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0
log v
Otrosparmetroscalculadosempleandoestassuperficieselectrdicashan
sidoloscoeficientesdedifusindelnaftolyelcoeficientedetransferenciadecarga.
mediantecronoamperometra(apartadoII.2.4.)son3.87x106cm2/sy2.75x106
compuestofenlicoalelectrodo.
limitantedelavelocidad.EnelcasodelelectrododegrafitoTefln,comoyase
150
Resultadosydiscusinintegrada
controladopordifusin,porloquedichoparmetrotambinpuedecalcularsea
partirdelapendientedelarepresentacindelaintensidaddecorrientefrentea
larazcuadradadelavelocidaddebarridoapartirdeladiferenciaentrelos
respectivamente,prximosalvalorde0.53obtenidoapartirdelapendientede
Tafel.
electrodoAucolgrafitoTefln
compsitamodificadaconnanopartculasdeoro(AucolgrafitoTefln)sobrela
proporcionaunaseriedeventajasparaeldesarrollodeestetipodedispositivos.
Porunlado,permitelainmovilizacindirectadelosanticuerpossinnecesidad
posiblesinterferencias.
Confinescomparativos,yparacorroborarlasventajasdelempleodelas
lugaraunarespuestamenosestable.Estehechoponedemanifiestolaventaja
151
Resultadosydiscusinintegrada
disminucinenlasensibilidad.
Encuantoalosresultadosalcanzadosconelinmunosensordesarrollado,
ejemploelbasadoenelempleodeunelectrodoserigrafiadodecarbono[XuF.,
2005].Enmuchosdelosdispositivosladeterminacindeprogesteronaabajas
concentracionesprogesterona.Porotraparte,esdedestacarquelasensibilidad
progesteronaanivelesfisiolgicosrelacionadosconloscontrolesdefertilidad.
enriquecidaconlaconcentracindeprogesteronaadecuada,hastaunvolumen
finalde1000Lconladisolucinreguladora.Pararealizarelinmunoensayo,3
dejarsecarlasuperficiedurantedoshorasatemperaturaambiente,serealizael
inmunoensayo.
152
Resultadosydiscusinintegrada
posteriorfecundacin.
153
Resultadosydiscusinintegrada
TIROSINASA
anticuerpodescritoanteriormenteparaladeterminacindeprogesterona,esel
incorporacindedichaenzimaenlamatriztridimensionalpermitelaoxidacin
catalticadelfenolgeneradoenlareaccinenzimticadelafosfatasaalcalinaa
disminucindelpotencialdedeteccin.
etapasdemodificacindelasuperficieelectrdicamedianteespectroscopiade
impedanciaelectroqumica,ascomootrosaspectosrelevantesdesudesarrollo.
espectroscopiadeimpedanciaelectroqumica
formacindelcomplejoantgenoanticuerpo.Asimismo,confinescomparativos
sehanobtenidolosdiagramasdeNyquistcorrespondientesalasmismasetapas
enausenciadenanopartculasdeoroenlamatrizcompsita.
obtenidosparaamboscasos.
154
Resultadosydiscusinintegrada
800 800
600 600
Z '',
Z '',
400 400
200 200
0 0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 500 1000 1500 2000 2500
Z ', Z ',
decargadebidoaunbloqueocadavezmayordelasuperficieelectrdica.Estas
interaccinantgenoanticuerpoquetienelugar.
Enla Tabla16serecogenlosvaloresdelaresistenciaalatransferenciade
cargacorrespondientesalosdiagramasdeNyquistdelaFigura27.
155
Resultadosydiscusinintegrada
Tabla16. Comparacindelaresistenciaalatransferenciadecargaenlasdiferentes
etapas de modificacin de los inmunosensores con ambas superficies
electrdicas.
resultadossoncoherentesconlosobtenidosmedianteamperometra,dondese
nanomaterialalamatriz.
III.2.1.2.2. Aspectosmsrelevantesdelinmunosensorbasadoenunelectrodo
TirAucolgrafitoTefln
monitorizarelectroqumicamentelareaccinantgenoanticuerpohapermitido
considerabledelasensibilidad.
Paraeldiseodelnuevoinmunosensordeprogesteronaseoptimizaron
156
Resultadosydiscusinintegrada
secuencialpropuesto.
alcalinaenlugardenaftilfosfato,debidoaquelaoxidacindelnaftolporaccin
noobservndosesealdereduccinsobrelasuperficieelectrdicaparavalores
depotencialcomprendidosentre0y0.2V.
OtravariableimportanteeselpHdelmedio,yaquesuvalorinfluyede
reaccinelectrdica.Adems,elpHptimodelasenzimasfosfatasaalcalinay
tirosinasanoeselmismo,siendobsicoparalaprimerayneutrooligeramente
bienzimticoadiferentespHspermitenobtenerunamayorsensibilidadapH7,
mslarespuestadecorrienteobtenidaquelareaccindehidrlisisdelsustrato
delafosfatasaalcalina.
respuestaamperomtricaobtenidaconestenuevodiseo,conlaproporcionada
nanopartculasdeoroenlamatrizelectrdica.Enesteltimocaso,seobserv
quelainmovilizacindelanticuerpo,antiprogesterona,sobrelasuperficiedel
corrienteesun58%menorquelaobtenidaconelinmunosensorenpresenciade
lasnanopartculasdeoro.
obtenidosparaunaconcentracinde10ngmL1deprogesteronaempleandoel
157
Resultadosydiscusinintegrada
ausenciadelasmismasunavezalcanzadalaestabilizacindelaseal.
cuandoeltransductoreselbiosensormodificadoconelnanomaterial.
i, A i, A
2.0 3.5
1.5 + 3 + 3
2.5
3
1.0
3
1.5
0.5
0.0 0.5
0 2 4 6 8 10 12 Das 0 4 8 12 16 20
Das
Figura 29.Grficosdecontrolparalosinmunosensoresconstruidosempleandocomo
transductores un biosensor de (a) Tir GT y (b) Tir AucolGT, para la
determinacindeprogesterona10ngmL1enmedioTRIS0.1MdepH7.0
yMgCl21mM.Eap=0.1V
158
Resultadosydiscusinintegrada
Elinmunosensordesarrolladopermitelaobtencindecalibradoslineales
hastaunaconcentracinde50ngmL1, siendoellmitededeteccinde0.43ng
mL1.
paraprogesteronaempleandolechecomomatriz.
diseosdelinmunosensorencontradosenlabibliografa,loscuales,presentan
unacurvaturaabajasconcentraciones(efectohook)[XuY.F.,2005].Asimismo
dispositivoenausenciadenanopartculasdelmetal.
TEFLN
bioactividad.
159
Resultadosydiscusinintegrada
queconduceaunaumentodelaselectividadenladeterminacin.
analticasobtenidasparaambosinmunosensores.
Tabla18. Comparacindelascaractersticasanalticasdeambosbiosensoresparala
determinacindeprogesterona.
amperomtricoproduceunaumentodelasensibilidaddeaproximadamenteun
80%,ascomounadisminucindellmitededeteccinobtenido,de0.84ngmL
1 enausenciadetirosinasa,a0.37ngmL1enpresenciadelamisma.
160
Resultadosydiscusinintegrada
INMUNOGLOBULINAG
ElempleodematricescompsitasdegrafitoTeflnmodificadasconoro
monitorizacindelareaccinantgenoanticuerpo.Entreellascabedestacar,la
inmovilizadas,ascomofacilitarlossitiosdebiorreconocimientodemaneraque
lasuperficieproporcioneunreconocimientorpidoyeficaz.
inmunoglobulinaGhabindoseaplicadoaladeterminacindedichoanalitoen
suero.Laimportanciadeladeterminacindeestetipodeinmunoglobulinasse
manifiestandemanerainmediatatraslaingestadelalimento,sonmediadaspor
estainmunoglobulina.
desarrollado.
biosensorTirAucolgrafitoTeflncomotransductor
Elempleodelbiosensorcompsitomodificadoconnanopartculasdeoro
paraladeterminacindeinmunoglobulinaGpresentaexcelentescaractersticas
inmunosensoresencontradosenlabibliografa.
161
Resultadosydiscusinintegrada
interferenciaselectroqumicas.
LamodificacindelasuperficieelectrdicaconProtenaAconstituyeuna
etapacrucialeneldesarrollodelinmunosensor,yaqueestaprotenaposeeuna
reginFcdelainmunoglobulinaimplicalaformacindeenlacesnocovalentes,
2004].
conjugadoconlafosfatasaalcalina,seunealantgeno(inmunoglobulinaG)tras
una etapa de incubacin, quedando el analito, de este modo, entre los dos
cuentaqueambosanticuerposhandeestarenexceso;elprimerodeellospara
162
Resultadosydiscusinintegrada
marcacincompletadelinmunocomplejo.
observndoseunaumentodelaresistenciaalatransferenciadecargaamedida
quesevamodificandolasuperficieelectrdicacomoconsecuenciadeunmayor
bloqueodelamisma.
experimental,perosinutilizarprotenaA.Enestecaso,ycomoeradeesperar,
As, se obtuvo una desviacin estndar relativa del 14.3% (n=5) para las
presenciadedichaprotenaelvalordeRSDfuedel4.8%(n=5),loqueponede
conelectrodosmodificadosconprotenaA.
Deformaanloga,sepreparuninmunosensorsinnanopartculasdeoro,
19semuestranlosresultadosobtenidosconambasconfiguraciones.
163
Resultadosydiscusinintegrada
Tabla19. Comparacindelascaractersticasanalticasdeambosbiosensoresparala
determinacindeinmunoglobulinaG.
electrdicaparaeldesarrollodelinmunosensor,modificndosedichasuperficie
realizadoelinmunoensayosellevacaboladeterminacindeIgGenmuestras
certificadasiguiendolosprocedimientosdescritosenelapartadoII.4.3.
EncuantoaladeterminacindeIgGenmuestrasdesuerocertificadofue
amboscasosseobtuvieronresultadossatisfactorios,obtenindoseenelcasodel
muestracertificada.
164
PUBLICACIONES
AnalyticaChimicaActa
528,18(2005)
Resultadosydiscusinintegrada
169
Resultadosydiscusinintegrada
170
Resultadosydiscusinintegrada
171
Resultadosydiscusinintegrada
172
Resultadosydiscusinintegrada
173
Resultadosydiscusinintegrada
174
Resultadosydiscusinintegrada
175
Resultadosydiscusinintegrada
176
Development of a high analytical performance-
tyrosinase biosensor based on a composite
graphite-Teflon electrode modified with gold
nanoparticles
BiosensorsBioelectronics
22,730736(2006)
Resultadosydiscusinintegrada
179
Resultadosydiscusinintegrada
180
Resultadosydiscusinintegrada
181
Resultadosydiscusinintegrada
182
Resultadosydiscusinintegrada
183
Resultadosydiscusinintegrada
184
Resultadosydiscusinintegrada
185
Bioelectrochemical evaluation of the total phenols
content in olive oil mill wastewaters using a
tyrosinase-colloidal gold-graphite-Teflon biosensor
EnvironmentalAnalytical
Chemistry
87,5765(2007)
Resultadosydiscusinintegrada
189
Resultadosydiscusinintegrada
190
Resultadosydiscusinintegrada
191
Resultadosydiscusinintegrada
192
Resultadosydiscusinintegrada
193
Resultadosydiscusinintegrada
194
Resultadosydiscusinintegrada
195
Resultadosydiscusinintegrada
196
Resultadosydiscusinintegrada
197
Development of a Progesterone Immunosensor
Based on a Colloidal Gold-Graphite-Teflon
Composite Electrode
Electroanalysis
19,853858(2007)
Resultadosydiscusinintegrada
201
Resultadosydiscusinintegrada
202
Resultadosydiscusinintegrada
203
Resultadosydiscusinintegrada
204
Resultadosydiscusinintegrada
205
Resultadosydiscusinintegrada
206
Nanostructured progesterone immunosensor using
a tyrosinase-colloidal gold-graphite-Teflon
biosensor as amperometric transducter
AnalyticaChimicaActa
596,8691(2007)
Resultadosydiscusinintegrada
209
Resultadosydiscusinintegrada
210
Resultadosydiscusinintegrada
211
Resultadosydiscusinintegrada
212
Resultadosydiscusinintegrada
213
Resultadosydiscusinintegrada
214
Amperometric IgG Immunosensor using
Tyrosinase-colloidal gold-Graphite-Teflon
biosensor as transducer
AnalyticalLetters
41,244259(2008)
Resultadosydiscusinintegrada
217
Resultadosydiscusinintegrada
218
Resultadosydiscusinintegrada
219
Resultadosydiscusinintegrada
220
Resultadosydiscusinintegrada
221
Resultadosydiscusinintegrada
222
Resultadosydiscusinintegrada
223
Resultadosydiscusinintegrada
224
Resultadosydiscusinintegrada
225
Resultadosydiscusinintegrada
226
Resultadosydiscusinintegrada
227
Resultadosydiscusinintegrada
228
Resultadosydiscusinintegrada
229
Resultadosydiscusinintegrada
230
Resultadosydiscusinintegrada
231
Resultadosydiscusinintegrada
232
CONCLUSIONES
Conclusiones
ApartirdelosresultadosobtenidosydescritosenlaMemoriadeestaTesis
Doctoralsehallegadoalassiguientesconclusiones:
1. Elempleodesuperficieselectrdicasmodificadasconnanopartculasdeoro
diferenteselectrodosdeunaformarpidayreproducible,obtenindoseeltamao
delasnanopartculasdeseado.
2. Lacombinacindelasventajasdeutilizarunamatrizcompsitadegrafito
Teflnparalainmovilizacindeenzimasylaincorporacindelasnanopartculas
excelentescaractersticasanalticas,mejorandoloslmitesdedeteccinalcanzados
presenciadeorocoloidal,aumentatantolacinticadelareaccinimplicadaenel
procesodereconocimientobioqumicocomoladelareaccinbasedelprocesode
deteccindecompuestosfenlicos.Adems,lafcilregeneracindelasuperficie
sensoramediantesimplepulido,juntoconlacapacidaddelasnanopartculasde
biosensorreutilizableyreproducibleconunagranestabilidadeneltiempo.
progesteronabasadoenlainmovilizacindeantiprogesteronasobrelasuperficie
235
Conclusiones
compsitodetirosinasamodificadoconnanopartculasdeorocomotransductor
amperomtricodelareaccindeafinidad,hapermitidodisminuirelpotencialde
determinacindedichoanalito.Adems,labuenarepetibilidaddelasmedidasy
cambiosenlaconcentracindeprogesteronaanivelesfisiolgicosdeinterspara
estudiosdefertilidadenlasvacas.Porotraparte,elempleodeestebiosensorpara
gransensibilidadyestabilidadcomparadoconotrosinmunosensoresreportados
unavezmssuadecuacinparainmovilizarbiomolculasdeformaeficiente,as
amperomtrica.
reproducibilidadentredistintosbiosensores,hanresultadoserentodosloscasos
cadaunodelosbiosensoresenzimticoseinmunosensores.
5. Finalmente,losbiosensoresdesarrolladossehanaplicadoaladeterminacin
delosanalitoscorrespondientesenmuestrasrealesoenmuestrasenriquecidasa
236
Conclusiones
enzimticos,sehallevadoacabolaestimacindelcontenidototaldepolifenoles
obtenindoseunabuenacorrelacinentrelasdistintasmetodologas.
progesteronaenmuestrasdelecheenriquecidas,ascomodeinmunoglobulinaG
pretratamientodelamuestra.
237
BIBLIOGRAFA
Bibliografa
241
Bibliografa
242
Bibliografa
[Cosnier, 2001]: Cosnier C., Szunerits S., Marks R.S., Lellouche L.P., y Perie K.
(2001). Mediated electrochemcial detection of catechol by tyrosinasebased
poly(dicarbazole)electrodes..J.Biochem.Biophys.Methods50:6577
[Crespilho, 2006]: Crespilho, F.N., Ghica, M.E., Florescu, M., Nart, F.C., Oliveira
Jr., O.N.y Brett, C.M.A., (2006).A strategyforenzyme immobilization on layer
bylayer dendrimer gold nanoparticles electrocatalytic membrane incorporating
redoxmediator.Electrochem.Commun.8:16651670
[ubuku, 2007]: ubuku, M., Timur, S. y Anik, lk (2007). Examination of
performance of glassy carbon paste electrode modified with gold nanoparticle y
xanthineoxidaseforxanthineyhypoxanthinedetection.Talanta3:434439
[Cummings,2001a]:CummingsE.A.,LinquetteMailleyS.,MailleyP.,CosnierS.,
Eggins B.R. y McAdams E.T. (2001). A comparison of amperometric screen
printed carbon electrodes and their application to the analysis of phenolic
compoundspresentinbeers.Talanta55(5):10151027
[Cummings, 2001b]: Cummings E.A., Eggins B.R., McAdams E.T., Linquette
Mailley S., Madigan D., Clements M. y Coleman C. (2001). Development of a
tyrosinasebased screenprinted amperometric electrode for the detection of
flavonoidpolyphenolsinlagerbeers.J.Am.Soc.Brew.Chem.59(2):8489
[Dan, 2007]:Dan,D.,Xiaoxing, X.,Shengfu,W.yAidong,Z.(2007).Reagentless
amperometric carbohydrate antigen 199 immunosensor based on direct
electrochemistryofimmobilizedhorseradishperoxidase.Talanta71:12571262
[Darain,2003]:DarainF.,ParkSUyShimYB.(2003).Disposableamperometric
immunosensor system for rabbit IgG using a conducting polymer modified
screenprintedelectrodeBiosen.Bioelectron18(56):773780
[Dequaire, 2000]: Dequaire M., Degrand C. y Limoges B. (2000). An
electrochemicalmetalloimmunoassaybasedonacolloidalgold label. AnalChem.
72:55215528.
[DazGonzlez, 2005]: DazGonzlez M., HernndezSantos D y Gonzelz
Garca B (2005). Devellopment of an immunosensor for the determination of
rabbit IgG using streptavidin screenprinted carbon electrodes. Talanta, 65: 565
573
[Du,2008]:Du,D.,Chena,S.,Cai,J.yZhang,A.(2008)Electrochemicalpesticide
sensitivity test using acetylcholinesterase biosensor based on colloidal gold
nanoparticlemodifiedsolgelinterface.Talanta74(4):766772
[EhrentreichFrster, 2003]: EhrentreichFrster E., Scheller F.W. y Bier F. F.
(2003).Detectionofprogesteronainwholebloodsmaples. Biosens.Bioelectron.18:
375380
[EscosuraMuiz A., 2006]: EscosuraMuiz A., GonzalezGarca M.B y Costa
GarcaA.(2006).Aurothiomalateasanelectroactivelabelforthedeterminationof
243
Bibliografa
immunoglobulinMusingglassycarbonelectrodesasimmunoassaytransducers.
SensandActB:Chemical114(1):473481
[Feng, 2007]: Feng, H., Wang, H., Zhang, Y., Yan, B., Shen, G. y Yu, R., 2007. A
DirectElectrochemicalBiosensingPlatformConstructedbyIncorporatingCarbon
NanotubesandGoldNanoparticlesontoRedoxPoly(thionine) Film.Anal.Sci.23:
235239
[FernndezSnchez C., 2000]: FernndezSnchez C., GonzlezGarca M.B Y
CostaGarca A. (2000). AC voltammetric carbon pastebased enzyme
immunosensors.Biosen.Bioelectron14(12):917924
[Finot, 1999]: Finot M.O., Braybrook G.D. y McDermott M.T. (1999).
Characterization of eelctrochemically deposited gold nanocrystals on glassy
carbonelectrodes.J.Electroanal.Chem.466:234241
[Freire, 2002a]: Freire R.E., Duran N. Y Kubota L.T. (2002). Electrochemical
biosensorbased devices for continuous phenols monitoring in environmental
matrices.J.BrazilChem.Soc.13(4):456462
[Freire, 2002b]: Freire R.S., Thongngamdee S., durn N., Wang J y Kubota L.T.
(2002). Mixed enzyme (laccase/tyrosinase)based remote electrochemical
biosensorformonitoringphenoliccompounds.Analyst.127:58261
[Freire, 2003]: Freire R.S., Pessoa C.A., Mello L.D., Kubota L.T. (2003). Dual
amperometric biosensor device for analysis ofbinary mixtures of phenols by
multivariatecalibrationusingpartialleastsquares.AnalChim.Acta485:263269
[Fu, 2007]: Fu, X.H., (2007). Electrochemical immunoassay for based on
polythionineandgoldglassycarbonelectrodescarbohydrateantigen125hollow
microspheresmodified. .Electroanal.19(17):18311839
[Fu., 2005]: Fu, Y., Yuan, R., Tang, D., Chai, Y y Xu, L. (2005). Study on the
immobilization of antiIgG on Aucolloid modified gold electrode via
potentiometric immunosensor, cyclic voltammetry, and electrochemical
impedancetechniquesColloidSurfurface.B40(1):6166
[Gao, 2007]: Gao, F., Yuan, R., Chai, Y., Chen, S., Cao, S. y Tang, T., (2007).
AmperometrichydrogenperoxidebiosensorbasedontheimmobilizationofHRP
on nanoAu/Thi/poly ( paminobenzene sulfonic acid)modified glassy carbon
electrode.J.Biochem.Bioph.Meth.70:407413
[Gomes, 2004]: Gomes S.A.S.S., Nogueira J.M.F. y Rebelo M.J.F. (2004). An
amperometric biosensor for polyphenolics compounds in red wines. Biosen.
Bioelectron.20(6):12111216
[Gooding.,2004]:GoodingJ.J.,WasiowychCh.,BarnettD.,HibbertB.,BarisciJ.N
Y Wallace G.G. (2004). Electrochemical modulation of antigenantibody binding.
Biosen.Bioelectron20(2):260268
244
Bibliografa
[Jena, 2007]: Jena B.K. y Raj C.R. (2007). Ultrasensitive Nanostructured Platform
fortheElectrochemicalSensingofHydrazine.J.Phys.Chem.C.111:6228.
[Jewell, 2001]: Jewll W.T. y Ebeler S.E. (2001). Tyrosinase biosensor for the
measurementofwinepolyphenolics.Am.J.Enol.Vitic52(3):219222
245
Bibliografa
[Jia,2002]:Jia,J.,Wang,B.,Wu,A.,Cheng,G.,Li,Z.yDong,S.,2002.Amethodto
construct a thirdgeneration horseradish peroxidase biosensor: Selfassembling
goldnanoparticlestothreedimensionalsolgelnetwork. Anal. Chem.74(9):2217
2223
[Jin,2002]:JinByZhangH.(2002).Nanogoldmodifiedglassycarbonelectrode
forselective determinationofepinephrine in thepresenceof ascorbicacid. Anal.
Lett.35(12):19071918
[Jiang, 2003]: Jiang, L. y Gao, L. (2003). Modified carbon nanotubes: an effective
waytoselectiveattachmentofgoldnanoparticles.Carbon41:29232929
[Katz, 2003]: Katz E y Willner I. (2003). Probing biomolecular interactions at
conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to
impedimetricimmunosensorsDNASensorandenzymebiosensors.Electroanal.15
(11):913947
[Katz, 2004]: Katz E., Willner I. y Wang J. (2004). Electroanalytical and
bioelectroanalytical systems based on metal and semiconductor nanoparticles
Electroanal.16(12):19
[Kim, 2000]: Kim, J.H., Cho, J.H., Cha, G.S., Lee, C.W., Kim, H.B. y Paek S.H.
(2000). Conductimetric membrane strip immunosensor with polyanilinebound
goldcolloidsassignalgenerator.Biosens.Bioelectron.14:907915
[Kim,2003]:KimM.A.yLeeW.Y.(2003).Amperometricphenolbiosensorbased
onsolgelsilicate/Nafioncompositefilm.Anal.ChimActa479(2):143150
[Kreuzer, 2004]: Kreuzer M.P., McCarthy R., Pravda M. Y Guilbault George G.
(2004).DevelopmentofelectrochemicalimmunosensorforProgesteroneAnalysis
inmilk.Anal.Lett.37(5):943956
[Kumar, 2005]: Kumar S.S, Mathiyarasu J. y Phani K.L. (2005). Exploration of
synergism between a polymer matrix and gold nanoparticles for selective
determinationofdopamine.J.Electroanal.Chem.578:95103
[Lei, 2003]: Lei, CX., Gong, F.C., Shen, G.L. y Yu, R.Q. (2003). Amperometric
immunosensor for Schistosoma japonicum antigen using antibodies loaded on a
nanoAu monolayer modified chitosanentrapped carbon paste electrode. Sensor
Actuat.BChem.96:582588
[Li M., 2008]: Li M., Gao F., Yang P., Wang L. Y Fang B. (2008). Conveniently
assembling dithiocarbamate and gold nanoparticles onto the gold electrode: A
newtypeofelectrochemicalsensorsforbiomoleculedetection. Surf.Sci.602:151
155
[Li X., 2006a]: Li, X., Wu, J., Gao, N., Shen, G. y Yu, R. (2006) Electrochemical
performance of lcysteinegoldparticle nanocomposite electrode interface as
applied to preparation of mediatorfree enzymatic biosensors. Sensor Actuat. B
Chem.,117:3542
246
Bibliografa
[Li X, 2006b]: Li, X., Yuan, R., Chai, Y., Zhang, L., Zhuo, Y. y Zhang Y. (2006).
Amperometric immunosensor based on touidine blue/nanoAu through
electrostatic interaction for determination of carcinoembryonic antigen. J.
Biotechnol.123:356366
[Liang, 2005]: Liang, R., Qiu, J. y Cai, P. (2005). A novel amperometric
immunosensorbasedonthreedimensionalsolgelnetworkandnanoparticleself
assembletechnique.Anal.Chim.Acta534(2):223229
[Lin, J., 2007a]:Lin,J.,Qu,W.y Zhang,S.(2007)Disposablebiosensorbasedon
enzyme immobilized on Auchitosanmodified indium tin oxide electrode with
flowinjectionamperometricanalysis.Anal.Biochem.360:288293
[Lin, J., 2007b]: Lin, J., Zhang, L., y Zhang, S. (2007) Amperometric biosensor
based on coentrapment of enzyme and mediator by gold nanoparticles on
indiumtinoxideelectrode.Anal.Biochem.370:180185
[Liu A., 2005]: Liu A., Honma I. Y Zhou H. (2005). Electrochemical biosensor
based on proteinpolisaccharide hybrid for selective detection of nanomolar
dopaminemetaboliteof3,4dihydroxylaceticacid(DOPAC). Electrochim.Comm.7
(2):233236
[Liu S., 2002]: Liu, S.Q. y Ju, H.X. (2002). Renewable reagentless hydrogen
peroxide sensor based on direct electron transfer of horseradish peroxidase
immobilizedoncolloidalgoldmodifiedelectrode.Anal.Biochem.,307:110116
[LiuS.,2003a]:Liu,S.,Yu,J.yJu,H.(2003).Renewablephenolbiosensorbasedon
a tyrosinasecolloidal gold modified carbon paste electrode. J. Electroanal. Chem.
540(2):6167
[Liu S., 2003b]: Liu S.Q y Ju H. (2003). Reagentless glucose biosensor based on
directelectrontransferofglucoseoxidaseimmobilizedoncolloidalgoldmodified
carbonpasteelectrode.Biosen.Bioelectron.19(3):177183
[Liu Y., 2003]: Liu Y., Yin F., Long Y., Zhang Z. y Yao S. (2003). Study of the
immobilizationof alcohol dehydrogenaseonAucolloidmodifiedgold electrode
by piezoelectric quartz crystal sensor, cyclic voltammetry, and electrochemical
impedancetechniques.J.Colloid.Interf.Sci.,258:7581
[Liu Y., 2004]: Liu, Y., Nie,L.,Tao, W. y Yao, S., (2004). AmperometricStudy of
AuColloid Function on Xanthine Biosensor Based on Xanthine Oxidase
ImmobilizedinPolypyrroleLayer.Electroanal.16(15):12711278
[Liu Y., 2006]: Liu, Y., Qin, Z., Wu, X. y Jiang, H. (2006). Inmunebiosensor for
aflatoxinB1basedbioelectrocatalyticreactiononmicrocombelectrode. Biochem.
Eng.J.32:211217
[Liu,Y.,2005]:LiuY.,Wang,M.,Zhao,F.,Guo,Z.,Chen,H.andDong,S.,(2005).Direct
electron transfer and electrocatalysis of microperoxidase immobilized on
nanohybridfilm.J.Electroanal.Chem.581:110
247
Bibliografa
[Liu Y., 2007]: Liu, Y., Wu, S., Ju, H. y Xu, L., (2007). Amperometric Glucose
BiosensingofGoldNanoparticlesandCarbonNanotubeMultilayer Membranes.
Electroanal.19(9),986992
[LiuY.,2008]: Liu,Y.(2008)Electrochemicaldetectionofprostatespecificantigen
basedongoldcolloids/aluminaderivedsolgelfilm.ThinSolidFilm8:18031808
[LiuZ.M.,2006]:LiuZ.M.,YangH.F.,LiY.F.,LiuY.L.,ShenG.L.yYuR.Q.(2006).
Coreshellmagneticnanoparticlesappliedforimmunosensing.Sensor ActuatorsB,
113:956962
[Lu, 2002]: Lu M., Li X.H., Yu B.Z. y Li H.L. (2002). Electrochemical behavior of
Au colloidal electrode through layerbylayer selfassembly. J. Colloid.Interf.Sci.,
248:376382
[Luo, 2004]: Luo, X.L., Xu, J.J., Du, Y. y Chen, H.Y. (2004). A glucose biosensor
based on chitosanglucose oxidasegold nanoparticles biocomposite formed by
onestepelectrodeposition.Anal.Biochem.,334:284289
[Luo, 2005]: Luo X.L., Xu J.J., Zhang Q., Yang G.J. y Chen H.Y. (2005).
Electrochemically deposited chitosan hydrogel for horseradish peroxidase
immobilizationthroughgoldnanoparticlesselfassembly.Biosen.Bioelectron.21(1):
190196
[Maduraiveeran, 2007]: Maduraiveeran G. y Ramaraj R. (2007). Gold
nanoparticles embedded in silica solgel matrix as an amperometric sensor for
hydrogenperoxide.J.Electroanal.Chem.608:5258
[Manso, 2007]: Manso, J.,Mena, M.L.,YezSedeo,P. y Pingarrn, J.M. (2007)
Electrochemical biosensors based on colloidal goldcarbon nanotubes composite
electrodes.J.Electroanal.Chem.,603:17
[Manso, 2008]: Manso, J.,Mena, M.L.,YezSedeo,P. y Pingarrn, J.M. (2008)
Alcoholdehydrogenaseamperometricbiosensorbasedonacolloidalgoldcarbon
nanotubescompositeelectrode.Electrochim.Acta53:40074012
[Mello, 2003]: Mello L.D., Tabeada M.P. y Kubota L.T. (2003). HRPbased
amperometricbiosensorforthepolyphenolsdeterminationinvegetablesextract.
Sens.Actuat.B96(3):636645
[Mena, 2005a]: Mena, M.L., YezSedeo, P. y Pingarrn, J.M. (2005). A
comparison of different strategies for the construction of amperometric enzyme
biosensorsusinggoldnanoparticlemodifiedelectrodes.Anal.Biochem.336:2027
[Mena, 2005b]:MenaM.L.,CarraleroV.,GonzlezCortsA.,YezSedeoP.y
Pingarrn J.M. (2005). Laccase biosensor based on NSuccinimidyl3
Thiopropionatefunctionalizedgoldelectrodes.Electroanal.23:21472155
[Messina,2005]:MessinaG.A.,TorrieroA.,DeVitoI.,OlsinaR.YRabaJ.(2005).
Continuosflow/stoppedflow system using an immunobiosensor for
248
Bibliografa
249
Bibliografa
250
Bibliografa
251
Bibliografa
252
Bibliografa
253
Bibliografa
[VelascoGarca, 2001]:VelascoGarcaMariaN.ymottramT.(2001).Biosensors
in the livestock industry: an automated ovulation prediction system for dairy
cows.TrendsinBiotechnology19(11):433
[WangB.,2000]:WangB.,ZhangJ.,DongS.(2000).Silicasolgelcompositefilmas
anencapsulationmatrixfortheconstructionofanamperometrictyrosinasebased
biosensor.Biosens.Bioelectron.15(79):397402
[Wang J., 1994]:Wang J., Lu F. y Lopez D.(1994).Tyrosinasebased ruthenium
dispersedcarbonpastebiosensorforphenols.Biosens.Bioelectron.9:915
[Wang L., 2004]: Wang L. y Wang E. (2004). A novel hydrogen peroxide sensor
based on horseradish peroxidase immobilized on colloidal au modified ITO
electrode.Electrochem.Commun.,6(2):225229
[Wang L., 2006]:WangL.,BaiJ.,HuangP.,WangH., Zhang L., ZhaoY.,(2006).
Nanostructured gold colloid electrode based on in situ functionalized self
assembledmonolayersongoldelectrode.Electrochem.Commun.,8;18251829
[WangM.,2004]:Wang,M.,Wang,L.,Wang,G.,Ji,X.,Bai,Y.,Li,T.,Gong,S.yLi,
J. (2004). Application of impedance spectroscopy ofr monitoring colloid Au
enhanced antibody immobilization and antibodyantigen reactions. Biosens.
Bioelectron.19(6):575582
[WangP.,2007]:WangP.,LiY.,HuangX.,WangL.(2007).Fabricationoflayerby
layermodifiedmultilayerfilmscontainingcholineandgoldnanoparticlesandits
sensingapplicationforelectrochemicaldeterminationofdopamineanduricacid.
Talanta73:431437
[WangZ.,2006]:WangZ.,YangY.,LiJ.,GongJ.,ShenGyYuR.(2006).Organic
inorganic matrix for electrochemical immunoassay: Detection of human IgG
basedonZnO/chitosancomposite.Talanta69(3):686690
[Wilson M.S., 2004]: Wilson M.S y Rauh R.D. (2004). Novel amperometric
immunosensors based on iridium oxide matrices Biosen.Bioelectron. 19 (7): 693
699
[Wu B.Y., 2007]: Wu, B.Y., Hou, S.H., Yin, F., Li, J. y Zhao, Z.X., (2007).
Amperometric glucose biosensorbased on layerbylayer assemblyof multilayer
films composedofchitosan,goldnanoparticlesand glucose oxidasemodified Pt
electrode.Biosens.Bioelectron.22:838844
[Wu L., 2006]: Wu, L., Chen, J., Du, D. y Ju, H. (2006). Electochemical
immunoassay for CA125 based on cellulose acetate stabilized antigen/coloidal
goldnanoparticlesmembrane.Electrochim.Acta51(7):12081214
[Wu Z.S., 2005]: Wu, Z.S., Li, J. S., Luo, M.H., Shen, G. L. y Yu, R.Q. (2005). A
novelcapacitiveimmunosensorbasedongoldcolloidmonolayersasociatedwith
asolgelmatrix.Anal.Chim.Acta528:235242
254
Bibliografa
[Xian,2006]:Xian,Y.,Hu,Y.,Liu,F.,Xian,Y.,Wang,H.yJin,L.,(2006).Glucose
biosensorbasedonAuconductivepolyanilinenanocomposite.Biosens.Bioelectron.
21:19962000
[Xiao,1999]:XiaoY.,JuH.X.yChenH.Y.(1999).Hydrogenperoxidesensorbased
on horseradish peroxidaselabeled Au colloids immobilized on gold electrode
surfacebycysteaminemonolayer.Anal.Chim.Acta391:7382
[Xiao,2008]:XiaoF.,RuanC.,LiJ.,LiuL.,ZhaoF.yZengB.(2008). Voltammetric
Determination of Xanthine with a SingleWalled Carbon NanotubeIonic Liquid
PasteModifiedGlassyCarbonElectrode.Electroanal.20(4):361366
[Xu Q., 2006]: Xu Q., Mao, C., Liu, N.N., Zhu, J.J. y Sheng, J., (2006). Direct
electrochemistry of horseradish peroxidase based on biocompatible
carboxymethylchitosangoldnanoparticlenanocomposite. Biosens.Bioelectron.22:
768773
[Xu S., 2006]: Xu S., Tu, G., Peng, B. y Han, X., (2006). Self assembling gold
nanoparticles on thiolfunctionalized poly(styrenecoacrylic acid) nanospheres
forfabricationofamediatorlessbiosensor.Anal.Chim.Acta570:151157
[XuS.,2007]:XuS.,Peng,B.yHan,X.,(2007).AthirdgenerationH2O2biosensor
based on horseradish peroxidaselabeled Au nanoparticles selfassembled to
hollowporouspolymericnanopheres.Biosens.Bioelectron.22:18071810
[Xu Y., 2006]: Xu Y.Y., Bian, C., Chen, S. y Xia, S. (2006). A microelectronic
technology based amperometric immunosensor for fetoprotein using mixed
selfassembledmonolayersandgoldnanoparticles. Anal.Chim.Acta561(12):48
54
[Xu Y.F., 2005]: Xu Y.F., VelascoGarca M., Mottram T.T. (2005). Quantitative
analysisoftheresponseofanelectrochemicalbiosensorforprogesteroneinmilk.
Biosens.Bioelectron.20:20612070
[Xue,2006]:Xue,M.H.,Xu,Q.,Zhou,M.yZhu,J.J.(2006)Insituimmobilization
of glucose oxidase in chitosangold nanoparticle hybrid film on Prussian Blue
modified electrode for highsensitivity glucose detection. Electrochem. Comm. 8:
14681474
[Yang,2006a]:Yang,W.,Wang,J.,Zhao,S.,Sun,Y.ySun,C.,(2006).Multilayered
constructionofglucoseoxidaseandgoldnanoparticlesonAuelectrodesbasedon
layerbylayercovalentattachment.Electrochem.Commun.8:665672
[YezSedeo, 2005]: YezSedeo, P. y Pingarrn, J.M., (2005). Gold
nanoparticlebasedelectrochemicalbiosensors.Anal.Bioanal.Chem.382:884886
[Yi,2000]: YiX.,HuangXianJ.yHongYuanC.(2000).Directelectrochemistryof
horseradish peroxidase immobilized on a colloid/cysteaminemodified gold
electrode.Anal.Biochem.278:2228
255
Bibliografa
[Yu A.M., 2003]: Yu A.M., Liang Z.J., Cho J.H. y Caruso R. (2003). NanoLett. 3:
1203
[Yu, 2003]: Yu J., Liu S., y Ju H. (2003). Mediatorfree phenol sensor based on
titania solgel encapsulation matriz for immobilization of tyrosinase by a vapor
depositionmethod.Biosens.Bioelectron.19(5):509514
[Yuan, 2005]: Yuan, R., Zhang, L., Li, Q., Chai, Y. y Cao. S. (2005). A labelfree
amperometric immunosensor based on multilayer assembly of polymerized o
phenylenediamine and gold nanoparticles for determination of Japanese B
encephalitisvaccine.Anal.Chim.Acta531(1):15
[Yun, 2007]: Yun Y, Bange A., Heineman W.R., Halsall H. Brian, Shanov V. N.,
DongZ.,PixleyS.,BehbehaniM.,JaziehA.,TuYietal.(2007).Ananotubearray
immunosensor for direct electrochemical detection of antigenantibody binding.
SensorActuatB:Chem.123(1):177182
[Zacco E., 2004]: Zacco E., Pividori M.I., Llopis X., M del Valle y Alegret S.
(2004).Renewable Protein A modified graphiteepoxy composite for
electrochemicalimmunosensingJ.ImmunologicalMethods286(12):3546
[Zare, 2006]: Zare H.R., Nasirizadeh N., Golabi S.M., Namazian M., Mazloum
Ardakani M. Y Nematollahi D. (2006). Electrochemical evaluation of coumestan
modifiedcarbonpasteelectrode:StudyonitsapplicationasaNADHbiosensorin
presenceofuricacid.Sens.ActuatB114:610617
[ZhangF.H.,2006]:Zhang,F.H.,Cho,S.S.,Yang,S.H.,Cho,S.S.,Yang,S.H.,Seo,
S.S.,Cha,G.S.yNam,H.,(2006).Goldnanoparticlebasedmediatorlessbiosensor
preparedonmicroporouselectrode.Electroanal.18(3):217222
[ZhangS.,2005]:Zhang,S.,Wang,N.,Yu,H.,Niu,Y.ySun,C.(2005).Covalent
attachment of glucose oxidase to an Au electrode modified with gold
nanoparticlesforuseasglucosebiosensor.Bioelectrochem.67:1522
[ZhangS.,2006]:Zhang,S.,Yang,W.,Niu,Y.,Li,Y.,Zhang,M.ySun,C.,(2006).
Construction of glucose biosensor based on sorption of glucose oxidase onto
multilayersofpolyelectrolyte/nanoparticles.Anal.Bioanal.Chem.384:736741
[ZhangT.,2003]:ZhangT.,TianB.,KongJ.,YangP.yLiuB.(2003).Asensitive
mediatorfree tyrosinase biosensor based on an inorganicorganic hybrid titania
solgelmatriz.Anal.Chim.Acta489(2):199206
[Zhao, 2006]: Zhao, S., Zhang, K., Bai, Yu, Yang, W. y Sun C. (2006). Glucose
oxidase/colloidalgoldnanoparticlesimmobilizedinNafionfilmonglassycarbon
electrode:Directelectrontransferandelectrocatalysis.Bioelectrochem.69:158163
[Zhong, 2005]: Zhong, X., Yuan, R., Chai, Y., Liu, Y., Dai, J. y Tang, D., (2005).
Glucose biosensor based on selfassembled gold nanoparticles and doublelayer
256
Bibliografa
257
GLOSARIO DE
ABREVIATURAS
Glosariodeabreviaturas
4AMPh:4Aminotiofenol
Ab:Anticuerpo
AChE:Acetilcolinesterasa
ACN:Acetonitrilo
ADH:Alcoholdeshidrogenasa
AET:Mercaptoetilamina
AFB1:AflatoxinaB1
AFP:1Fetoprotena
Ag:Antgeno
AntiAFP:Antifetoprotena
AntiCEA:Anticuerpocarcinoembrinico
AntihCG:antihumanchorionicgonadotrophin
AP:Fosfatasaalcalina
APTS:3Aminopropiltrietoxisilano
ASV:Voltamperometradestrippingandico
Aucol:Orocoloidal
B:Boro
BSA:Suerodealbminabovino
CA125:Carcinomaantigeno125
CA153:Marcadortumoraldelcncermamario
Cdl:Capacidaddeladoblecapa
CE:ComunidadEuropea
CEA:Antgenocarcinoembrinico
CitC:CitocromoC
CNT:Nanotubodecarbono
CPE:Elementodefaseconstante
CV:Voltamperometracclica
261
Glosariodeabreviaturas
DA:cidodomoico
DHB:Dihidroxibenceno
DMG:Dimetilformamida
DMP:Dimetilfenol
DOPAC:3,4Dihidroxifenilactico
DPV:Voltamperometradiferencialdeimpulsos
DTSP:33`Ditiobis(cidopropionicoNhidroxisuccinimidaester)
EDC:1Etil3(dimetilaminopropil)carbodimida
EIS:Espectroscopiadeimpedanciaelectroqumica
EPA:AgenciadeProteccinAmbientalNorteamericana
EPD:Etilenpropilendieno
GA:Glutaraldehdo
GCE:Electrododecarbonovitrificado
GCPE:Electrodopastadecarbonovitrificado
GDH:Glucosadeshidrogenasa
GOx:Glucosaoxidasa
GT:GrafitoTefln
H.pyIgG:HelicobacterPylori
HbsAg:AntgenodelahepatitisB
HDT:1,6Hexanoditiol
HRP:Peroxidasaderbano
Hx:Hipoxantina
IgG:InmunoglobulinaG
ITO:xidodetitanioeindio
K:Constantedetransferenciaelectrnica
LBL:Layerbylayer
LD:Lmitededeteccin
LDL:Lipoprotenasdebajadensidad.
262
Glosariodeabreviaturas
lgpfuml1:Logaritmodeunidadesformadorasdeplacas.(plaqueforming
unit)
LSV:Voltamperometradebarridolineal
mAb:InmunoglobulinaGderatn
MP11:Microperoxidasa
MPTS:Mercaptopropiltrietoxisilano.
nAu:Nanopartculasdeoro
Nf:Nafion
NHS:NHidroxisulfoxinimida
ODT:1Octanodecanotiol
PANAM:Poliamidoamina
PBS:Disolucinreguladorafosfato
PEDOT.3,4Etilenditioxitiofeno
PLY:Pneumolisina
PSA:Antgenoespecficodelaprostata
pSf:Polisulfona
PVB:Polivinilbutiral
PVS:cidopolivinilsulfnico
QMC:Microbalanzacristaldecuarzo
RBC:Redbloodcellsofcruciancarp
Rct:Resistenciaalatransferenciadecarga
rIgG:InmunoglobulinaGdeconejo
Rs:Resistenciadeladisolucin
RVC:Carbonovtreoreticulado
SAMs:Monocapasautoensambladas
ScreenPrinted:Electrodosserigrafiados
SEM:Microscopiaelectrnicadebarrido
SH:Salicilatohidroxilasa
263
Glosariodeabreviaturas
SjAb:AnticuerpodeSchistosomajaponicum
SPE:Electrodosdescreenprinted
SWV:Voltamperometradeondacuadrada
TAC:Triacetatodecelulosa
TB:AzuldeToluidina
Thi:Tionina
Tir:Tirosinasa
TMB:Tetratiafulvaleno
XOD:Xantinaoxidasa
Zw:ImpedanciadeWarburg
264