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FACULTAD DE MEDICINA
Por:
Agosto 2010
i
El proyecto de la tesis fue realizado en:
ii
Agradecimientos
A Dios por darme la vida, los medios necesarios para lograr mis metas, por
rodearme de su amor cuando ms he necesitado y por todas las personas que
cruzaste en mi camino.
A la Dr.med Lourdes Garza Ocaas por permitirme ser parte de este proyecto,
por su asesora, apoyo y sugerencias para el desarrollo de este trabajo.
Al Dr. Jos Miguel Yacamn por proporcionar las NPs de Ag para este estudio.
.A mis compaeros, pero sobre todo amigos: Omar, Christian, Cris, Arge, Zuly,
Paty, Sandra y Sergio por su cario y solidaridad en mis dificultades.
iii
Dedicatoria
Al Dr. med. Oscar Torres Alans y a la Dr. med. Mara Victoria Bermdez,
iv
v
Mnica Azucena Ramrez Cabrera Fecha de graduacin: Agosto 2010
vi
TABLA DE CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS iii
DEDICATORIA iv
APROBACIN DE TESIS v
RESUMEN vi
Lista de figuras xi
Lista de tablas xiii
1. INTRODUCCIN 1
1.1 Introduccin a la Nanotecnologa 1
1.1.1 Nanociencia y Nanotecnologa 1
1.1.2 Nanomateriales 2
1.1.3 Aplicaciones de la Nanotecnologa 2
1.2 Nanomedicina 3
1.2.1 Aplicaciones de la nanomedicina 3
1.3 Nanopartculas 4
1.3.1 Produccin de nanopartculas 5
1.3.2 Nanopartculas de utilidad clnica 6
1.3.3 Efecto de las nanopartculas sobre la salud 8
1.4 Nanopartculas de la plata (NPs de Ag) 11
1.4.1 Evaluacin de la actividad biolgica de las 12
NPs de Ag
1.4.2 Estudios de toxicidad de las NPs de Ag 14
1.5 Etapas para el desarrollo de medicamentos 16
1.6 Objetivo general 20
1.6.1 Objetivos especficos 21
2. MATERIAL Y MTODOS 22
2.1 MATERIAL 22
2.1.1 Material biolgico 22
vii
2.1.1.1 Lneas celulares 22
2.1.1.2 Animales 22
2.1.2 Material qumico 22
2.1.2.1 NPs de Ag (NPs de Ag) 22
2.1.3 Material, reactivos y equipo 23
2.1.3.1 Material y equipo en general 23
2.1.3.2 Reactivos 24
2.1.3.2.1 Reactivos para el cultivo de lneas celulares, 24
prueba de MTT, prueba de DCFDA y
produccin de xido ntrico.
2.1.3.2.2 Reactivos para la determinacin de Ag mediante 26
EAA
2.1.3.2.3 Reactivos para la evaluacin mediante EEDX. 26
2.2 MTODOS 27
2.2.1 Evaluacin de la actividad biolgica de las 27
NPs de Ag In vitro
viii
2.2.1.5.1 Cultivo de macrfagos y fibroblastos en 30
placas de 96 celdillas
2.2.1.5.2 Exposicin de macrfagos y fibroblastos 31
a NPs de Ag
2.2.1.5.3 Cuantificacin de NO mediante el ensayo 31
de Griess
2.2.1.5.4 Determinacin indirecta del factor de 32
necrosis tumoral alfa
2.2.2 Evaluacin de la distribucin de NPs de Ag en ratas 33
Wistar
2.2.2.1 Exposicin de ratas Wistar a NPs de Ag 33
2.2.2.2 Obtencin de muestras 33
2.2.2.3 Evaluacin de la presencia de las NPs de Ag 34
mediante Espectroscopa de Energa
Dispersiva por rayos X (EEDX).
2.2.2.3.1 Tratamiento de las muestras 34
2.2.2.4 Cuantificacin de Ag por EAA 34
2.2.2.4.1 Tratamiento de las muestras 34
2.2.2.4.2 Estndares de plata 35
2.2.2.4.3 Curva de calibracin 36
2.2.2.4.4 Procedimiento 36
2.2.2.4.5 Clculo para determinar la concentracin de 36
Ag
2.2.3 Determinacin de la concentracin de plata en muestras 37
de orina y heces
2.2.3.1 Exposicin de los animales a las NPs de Ag 37
2.2.3.2 Obtencin de las muestras 37
2.2.3.3 Tratamiento de las muestras 37
2.2.3.4 Estndares de plata y curva de calibracin 38
2.2.3.5 Procedimiento 38
2.2.3.6 Clculo para determinar la concentracin de Ag 38
2.2.4 Evaluacin de la toxicidad producida por las 38
ix
NPs de Ag
3. RESULTADOS 40
3.1 Evaluacin de la citotoxicidad 40
3.1.1 Revisin microscpica y prueba de reduccin del 40
MTT
3.2 Evaluacin de estrs celular oxidativo producido por las 42
NPs de Ag mediante la prueba de DCFDA
3.3 Efecto de las NPs de Ag sobre la produccin de 43
NO y determinacin indirecta del TNF-
3.3.1 Produccin de NO 43
x
LISTA DE FIGURAS Y TABLAS
Pgina
xi
Figura 9. Concentraciones de plata de las muestras de rganos de ratas 49
Wistar (bazo, cerebro, hgado, pulmn y rin) correspondientes al
periodo de 7 das despus de la administracin de 50 mg/Kg de
nanopartculas de plata va i.p
49
Figura 9.1. Corte de la grfica 9 para una mejor apreciacin de las
concentraciones de plata en rganos de ratas Wistar.
xii
TABLAS
Pgina
determinacin de plata
xiii
1. INTRODUCCIN
fuerza en las ltimas dcadas, estos ltimos ya existan desde hace varios
una conferencia impartida en 1959 por uno de los grandes fsicos del siglo
tomos individuales.
significado del prefijo nano es una dimensin que equivale a 10-9, y si se fija
1
1.1.2 Nanomateriales
individuales con un dimetro menor a 100 nm, lo que puede originar tanto
2
1.2 Nanomedicina
3
de tumores por calentamiento (hipertermia), separacin y purificacin de
diagnostico molecular. 3
Todas las aplicaciones constituyen una nueva era cientfica y asistencial en las
distintos nanomateriales.
1.3 Nanopartculas
Las nanopartculas han existido por siglos, algunos ejemplos son las partculas
de Lycurgs, creado por los romanos en el siglo IV d.C. tiene una caracterstica
4
interesante, su color es verde si la luz es reflejada y cambia a rojo si la luz es
transmitida a travs de el. El anlisis de este vaso muestra que est compuesto
tenan antecedentes del uso de nanopartculas, no fue sino hasta 1857 cuando
oro. Y desde esa poca hasta la fecha se han logrado grandes avances en el
propiedad que les confiere una mayor capacidad de interaccin con otros
5
Los mtodos mediante los cual se obtienen las nanopartculas se pueden
Distintos mtodos para la vaporizacin de los metales pueden ser usadas y con
reactivos. Este mtodo es usado para crear quantum dots y es mejor que las
6
molienda pueden afectar las propiedades de las nanopartculas. Este mtodo
por sus diversas propiedades han sido atractivas para el desarrollo comercial,
ha sido posible por las propiedades que ofrecen estos sistemas para mejorar la
7
el uso de nanopartculas para obtener imgenes moleculares y como parte de
comparacin con los pacientes a los que solo se les administraba el anticuerpo
con lo cual se logr mejorar la liberacin del frmaco y adems se observ una
8
1.3.3 Efecto de las nanopartculas sobre la salud
9
mayor tamao, existe la posibilidad de que esto vaya acompaado de nuevos
Aqullas que tienen una estructura fibrosa podran tener una mayor
existen reportes que indican que algunas nanopartculas que no son usadas en
esta rea, pero que estn presentes en procesos industriales y que son
manipuladas por humanos, han producido efectos txicos los cuales han sido
(animales). Los efectos nocivos varan dependiendo del modelo biolgico, las
txica, sin embargo otros estudios han demostrado que las nanopartculas son
10
ese mismo ao Murdock C. y cols. expusieron la misma lnea celular pero a
11
plata y otras sales) fueron utilizadas en el tratamiento de enfermedades
concluyeron que debido a que las nanopartculas actan en contra del virus en
evitar el contagio con este virus y/o combatir sus efectos. Tambin se ha
12
sugerido que las NPs de Ag podran ser usadas de para combatir el virus de
papiloma humano.23
anterior sugirieron que las clulas cancerosas podan ser susceptibles al dao
13
del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y de la interleucina 1-beta
14
exposicin de monocitos de origen humano a NPs de Ag indujo la produccin
apoptosis . 31
los que se mostr la liberacin de iones de plata (Ag+) que podran traslocarse
15
NPs de plata es cercano al de los iones de Ag+ y algunos reportes mencionan
medicamentos convencionales.
16
productos y equipo mdico con la ventaja de traspasar barreras no
por las que un compuesto debe ser analizado antes de ser comercializado son
demostrar que la sustancia no sea txica. Los resultados de esta etapa dan la
compuesto.
17
hacen pruebas aleatorias y controladas con un placebo (sustancia sin efecto) o
se registra para que haga su entrada en el mercado. Una vez que el nuevo
para ser comercializado, empieza una nueva etapa de control. Fase IV. de
Hace algunos aos algunas industrias farmacuticas han sido aprobadas por la
18
El incremento de la produccin de nanopartculas para diversos usos, hace
19
1.6 OBJETIVO GENERAL
de plata.
20
1.6.1 OBJETIVOS ESPECFICOS
plata, In vitro.
Wistar.
21
2. MATERIAL Y MTODOS
2.1 MATERIAL
Para los estudios In vitro se utilizaron 3 lneas celulares: clulas de hgado de Chang
2.1.1.2 Animales
Para los estudios In vivo se utilizaron ratas Wistar hembras, entre 6 y 7 semanas de
jaulas de acrlico con tapa de rejilla metlica y/o jaulas metablicas, bajo condiciones
que se les proporcion agua y alimento ad libitum. Las ratas fueron obtenidas del
22
Las NPs de Ag fueron sintetizadas en atmsfera de aire reducida. Se utiliz nitrato de
plata (AgNO3; Aldrich) 0.6857 M y se mezcl con una solucin acuosa de albmina
oscura.
Cmara Neubauer
Equipo de diseccin
Espectrofluormetro
23
Membranas de filtracin de 0.22 m de dimetro de poro (Millipore)
Microtomo
Pipetas lineales de 5, 10 y 25 mL
Pipetas pasteur
Reservorio
Termmetro
2.1.3.2 Reactivos
cido actico
cido clorhdrico
cido tiobarbitrico
cido tricloroactico
24
Agua bidestilada
Alcohol etlico
Alcohol isoproplico
Cloruro de calcio
Formaldehdo
Lipopolisacrido
Malondialdehdo
Nitrato de sodio
Reactivo de Griess
Rojo Neutro
Suero de caballo
Tripsina (Sigma)
25
2.1.3.2.2 Reactivos para la determinacin de Ag mediante EAA
cido Ntrico
Agua bidestilada
Argn
Acetato de uranilo
Acetona
cido clorhdrico
cido pcrico
Agua ultrapura
Azul de toluidina
Borato de sodio
Cacodilato de sodio
Citrato de plomo
Glutaraldehdo
Hidrxido de sodio
Nitrato de uranilo
Parafolmaldehdo
Resinas epxicas
Tetraxido de osmio
26
2.2 MTODOS
cultivo usando como nutriente medio esencial mnimo (MEM), para sembrar las clulas
de hgado de Chang se suplement al 10% con suero fetal bovino, en el caso de los
ambiente de 5% CO2 y 95% aire, hasta la formacin de la monocapa celular (2-3 das).
usaron fibroblastos. Las condiciones para su cultivo fueron las mismas que ya se han
mencionado.
Chang y fibroblastos
desprender las clulas del frasco de cultivo y separarlas entre s. Al trmino de este
27
cada pozo de la placa se les adicion 0.1 mL de la suspensin celular. Las placas se
durante 24 y 48 h.
Despus de la exposicin de las clulas a las NPs de Ag, las clulas de las placas se
28
Finalmente se midi la absorbancia a de 570 nm. La lectura de las celdillas controles
(DCFDA)
Las placas de 96 celdillas que contenan a las clulas de Chang fueron expuestas a
Posteriormente, se les aadi 0.2 mL de una solucin que contena DCFDA (0.05
mg/mL) y xantina oxidasa (0.06 U/mL), las placas fueron selladas e incubadas a 37 C.
se realizaron lecturas, a los 30 min y despus cada hora durante 6 h, a una de 585
Como control positivo de estrs oxidativo se utilizaron las celdillas con MEM, DCFDA y
xantina oxidasa y como control negativo se utilizaron celdillas con MEM y DCFDA.
29
2.2.1.3.3 Clculos
emitida por las clulas de las celdillas correspondientes a cada concentracin de NPs
vitro
La monocapa formada por los macrfagos en los frascos de cultivo fue removida
La monocapa formada por fibroblastos contenida en los frascos para cultivo se expuso
a 1 ml de tripsina 0.25% durante 5-10 minutos para desprender las clulas del frasco
concentracin celular. La densidad celular se ajust a 2 X104 clulas por 0.1 mL con
30
2.2.1.5.2 Exposicin de macrfagos y fibroblastos a NPs de Ag
Una vez formada la monocapa celular se retir el medio de las celdillas de las placas
0.002- 3.4 mg/mL) de NPs de Ag. Las celdillas usadas como control contenan medio
de cultivo + LPS. Las placas se incubaron a 37 C con una atmsfera de 95% de aire y
5% de CO2 durante 24 h.
5% de CO2 durante 24 h.
sobrenadante del cultivo celular a las 24 h mediante el ensayo de Griess. Los nitritos
Despus del tiempo de incubacin se midieron 0.1 mL del medio de cultivo de cada
31
de estudio, se adicion 0.1 mL del reactivo de Griess y la placa se incub durante 30
estndar.
viabilidad celular y se utiliz para calcular el % de viabilidad celular de las celdillas que
desviaciones estndar.
distintos.
32
2.2.2 Evaluacin de la distribucin de nanopartculas de plata en ratas Wistar
Se formaron 6 grupos de ratas con una n=6, los grupos experimentales fueron 1, 3 y 5
Al finalizar el periodo de exposicin los grupos fueron anestesiados con una solucin
sangre mediante puncin de la vena renal. La sangre fue colectada en tubos libre de
de 4C para su conservacin.
bazo, cerebro, corazn, hgado, pulmn y rin, de los cuales se tom una pequea
Espectroscopa de Energa Dispersiva por rayos X (TME con EEDX); el resto del
33
2.2.2.3 Evaluacin de la presencia de las nanopartculas de plata mediante
barre durante varios minutos y los rayos X son colectados y analizados por el equipo, la
La seccin tomada de los rganos fue fijada en osmio, procesada con resinas
contrastados para el anlisis mediante TME con EEDX para determinar la presencia de
NPs de Ag.
tomos presentes.
34
Tejidos. Para la determinacin de plata los rganos se llevaron a digestin hmeda
utilizando cido ntrico concentrado para eliminar la materia orgnica, se realizaron las
diluciones necesarias con agua desionizada para asegurar que la concentracin de las
muestras estuviera dentro del margen de la curva de calibracin al ser procesadas por
el equipo.
A partir de una solucin estndar de Ag (1000 g/mL), se prepar una solucin stock
50 500 10 5
100 500 10 10
200 500 10 20
400 500 10 40
600 500 10 60
35
2.2.2.4.3 Curva de calibracin
La curva fue utilizada para optimizar la seal del equipo, se realiz antes de iniciar el
anlisis de muestras, para lo cual se midieron 100 L de cada estndar por separado y
2.2.2.4.4 Procedimiento
modificadora.
solucin modificadora.
dentro del rango de la curva, cuando alguna muestra excedi el intervalo, a sta se le
Los clculos se realizaron a partir de la lectura del equipo y tomando en cuenta las
36
2.2.3 Determinacin de la concentracin de plata en muestras de orina y heces
Se formaron 2 grupos de ratas Wistar con una n=6, el grupo experimental fue el grupo
1, este grupo recibi una dosis de 50 mg/Kg de NPs de Ag va i.p., el grupo 2 fue el
respectivo control y ste solo recibi agua desionizada va i.p. Ambos grupos fueron
heces.
de HNO3 concentrado.
Los vasos para microondas fueron colocados en el carrusel del aparato para llevar
acabo la digestin.
37
2.2.3.4 Estndares de plata y curva de calibracin
2.2.3.5 Procedimiento
manera:
solucin modificadora.
Las muestras se homogenizaron de la misma forma que se hizo con las muestras de
equipo. Se aceptaron los valores se encontraban dentro del rango de la curva, cuando
analiz nuevamente.
establece que los animales son expuestos a una dosis de 5mg/Kg de la sustancia a
38
evaluar y despus de un perodo de 24 h se evala el parmetro de mortalidad si no
Para esta prueba se formaron 6 grupos de ratas con una n=6, los grupos
39
3. RESULTADOS
120
% de viabilidad celular
100
80
60
40
20
0
0 6 13 27 53 106 213
g de NPs de Ag/mL
exposicin a NPs de Ag mediante la prueba de reduccin del MTT. Los datos representan el
40
Efecto de las NPs de Ag sobre la viabilidad de las clulas
L929 (MTT, 24 h)
140
120
% de viabilidad celular
100
80
60
40
20
0
0 6 13 27 53 106 213
g de NPs de Ag/mL
(a)
120
% de viabilidad celular
100
80
60
40
20
0
0 6 13 27 53 106 213
g de NPs de Ag/mL
(b)
41
3.2 Evaluacin de estrs celular oxidativo producido por las
diclorofluorescena (DCFDA)
continua (es decir cada hora) as como en una medicin que se realiz a las
muestran en la figura 3.
42
Efecto de las NPs de Ag sobre la produccin de estrs
oxidativo en clulas de hgado de Chang
140
120
100
Fluorescencia
80 0 g/mL
12.5 g/mL
60 25 g/mL
50 g/mL
40
xantina oxidasa
20
0
0 0.5 1 2 3 4 5 6
Tiempo (h)
Fig. 3. Efecto de las nanopartculas de plata sobre la produccin de estrs celular oxidativo en
independientes.
3.3.1 Produccin de NO
exposicin 24 h.
43
Efecto de las NPs de Ag sobre la produccin de xido ntrico en
macrfagos (24 h)
90
*
80
70
g de xido ntrico/mL 60
*
50
*
40
*
30
20
10
0
0 6 13 27 53 106 213 425
g de NPs de Ag/mL
durante 24 h. (Figura 5)
44
Efecto de 50 L de medio de los macrfagos expuestos a
NPs de Ag sobre la viabilidad de clulas L929 (MTT, 24h)
140
120
100
%de viabilidad
80
60
40
20
0
0 6 13 27 53 106 213
g de NPs Ag/mL
120
100
% de viabilidad
80
60
40
20
0
0 6 13 27 53 106 213
g de NPs de Ag/mL
45
3.4 Evaluacin de la cintica de distribucin
plata estuvo presente en todos los rganos que se evaluaron aunque las
periodos de exposicin.
Concentracin de Ag en rganos
100
80
g de Ag/g
60
1 da
40 4 das
7 das
20
0
BAZO
CEREBRO
CORAZN
HGADO
PULMN
RIN
Para una mejor visualizacin se cort la grfica anterior en la escala de 10, con
46
cerebro el cual fue el rgano en el cual se deposit la cantidad ms baja, casi
Concentracin de Ag en rganos
10
8
g de Ag/g 1 da
4 das
6
7 das
4
0
BAZO
CEREBRO
CORAZN
HGADO
PULMN
RIN
Figura 6.1. Corte de la grfica 6, en la que se observa que el bazo es el segundo rgano con
en donde se observa que el corazn y el bazo fueron los rganos con mayor
de plata, sin embargo el hgado se observa que tuvo una acumulacin muy
grande, casi 50 veces mas que en el periodo de 4 das para este mismo
47
los rganos no se aprecian bien por lo que se decidi cortar esta grfica para
3
Controles
2 expuestos
0
BAZO
CEREBRO
CORAZN
HGADO
PULMN
RIN
nanopartculas de plata va i.p. en donde se aprecia que los rganos con mayor cantidad de
5
g de Ag/g de rgano
3
Control
2 Expuesto
0
BAZO
CEREBRO
CORAZN
HGADO
PULMN
RIN
que para este periodo el corazn y el bazo son los rganos con la mayor concentracin de
48
Concentracin de Ag en rganos de ratas sacrificadas 7
das despues de la administracin de NPs de Ag
100
g de Ag/g de rgano
80
60
Control
40
Expuesto
20
0
BAZO
CEREBRO
CORAZN
HGADO
PULMN
RIN
10
g de Ag/g de rgano
8
Control
6
Expuesto
4
0
BAZO
CEREBRO
CORAZN
HGADO
PULMN
RIN
Figura 9.1. Corte de la grfica 9 para una mejor apreciacin de las concentraciones de plata
en rganos de ratas Wistar (bazo, cerebro, hgado, pulmn y rin) obtenidos despus 7 das
49
Los rganos en los que se encontraron las mayores concentraciones de plata
en los tres tiempos de exposicin fueron: hgado, bazo y corazn. (figura 10)
90
80
70
60
g de Ag/g
50
40
30
20 CORAZN
10
BAZO
0
HGADO
1
4
7
Tiempo (das)
Figura 10. rganos de ratas Wistar con mayor concentracin de plata despus de 1, 4 y 7
50
3.4.2 Determinacin de concentracin de plata en muestras de sangre
250
200
g de Ag/ dL
150
100
50
Control
1
4
7
Tiempo (das)
va i.p.
51
3.4.3 Determinacin de la presencia de nanopartculas de plata mediante
corazn y rin.
52
a) b)
c)
Figura 12. Las nanopartculas de plata se observan como puntos luminosos en muestras de
hgado (a), corazn (b) y rin (c) de ratas Wistar expuestas a 50 mg/kg mediante la tcnica
EEDX.
aspecto luminoso.
53
Figura 13. Micrografa de tejido cerebral de ratas Wistar expuestas a 50 mg/kg de peso
54
3.4.4 Determinacin de la concentracin de plata en muestras de orina y
heces
a partir de los 4 das, se mantuvo muy similar a los 7 das y tuvo un ligero
25
20
g de Ag/ L
15
10
5
0
1
4
7
21
Tiempo (das)
obtenidas los das 4 y 21 fueron las que tuvieron las concentraciones mayores
55
Concentracin de Ag en muestras de heces
40
35
30
25
g de Ag/ g
20
15
10
5
0
0
1
4
7
21
Tiempo ( das)
56
4. DISCUSIN
otras), actividad antiviral (VIH y VPH) y se menciona que adems pueden ser
celulares bsicas que conlleva a un dao que puede ser detectado a partir de
diferentes pruebas in vitro para predecir los efectos txicos de las drogas y los
57
mitocondrias de la clulas vivas para reducir el MTT a formazn que es
plata fueron citotxicas para ambas lneas celulares. Las clulas L929 fueron
puede ser evaluado con la prueba de reduccin del MTT. Sin embargo es
58
de plata evaluadas produjo efecto oxidante pues la fluorescencia emitida por la
concentracin mas alta de nanopartculas de plata fue casi 3 veces menor que
la emitida por la xantina oxidasa la cual se utiliz como control positivo en esta
prueba.
la produccin de xido ntrico por los macrfagos activados. Esto indica que
59
causadas por microorganismos intracelulares como las micobacterias.43 En
agente extrao y por lo tanto, esta clula del sistema inmune se est activando
60
por la deteccin de las nanopartculas de plata por la tcnica de
bazo puede deberse en parte a que este rgano est altamente irrigado, y a
que es parte importante del sistema inmune, en este sentido algunos autores
tanto los efectos txicos que las nanopartculas pudieran producir, seran en el
de acumulacin son hgado > bazo > mdula > cerebro14 En este sentido los
61
rganos donde se acumul la mayor cantidad de Ag y de nanopartculas como
pudiese deberse a que despus de cierto tiempo hubo una redistribucin de las
filtracin renal de las mismas y excrecin a travs la orina. Con respecto a las
muestras de heces, las concentraciones fueron muy bajas por lo que se sugiere
62
como resultado de una simple filtracin.19 En este trabajo se demostr adems
para ninguna de las dosis evaluadas, ya que ninguno de los animales falleci
va renal.
63
5. CONCLUSIONES
macrfagos in vitro.
rin y pulmn
64
BIBLIOGRAFA
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15. Hussain S. M., Javorina A. K., Schrand A. M., et al. The interaction of
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