Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnologa

Biotecnologa de enzimas: Inmovilizacin

Sergio Huerta Ochoa

UAM-Iztapalapa
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Catlisis enzimtica heterognea

Para combinar las ventajas de la catlisis homognea y heterognea,
se desarroll la heterogenizacin de la catlisis homognea

Las enzimas inmovilizadas son enzimas fsicamente confinadas o

localizadas en una cierta regin definida de espacio con la
retencin de sus actividades catalticas, que pueden ser usadas
repetidamente y continuamente

Los mtodos ms comunes de inmovilizacin de enzimas

Heterogenizacin de enzimas solubles a travs del acoplamiento de
un soporte insoluble mediante: adsorcin o enlace covalente, por
entrecruzamiento de la enzima o por atrapamiento en un enrejado o
en microcpsulas
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Las propiedades de las enzimas inmovilizadas estn gobernadas
por las interacciones de las propiedades de la enzima y el material
del soporte

Enzima Soporte

Propiedades bioqumicas Caractersticas qumicas

Tipo de reaccin y cintica Propiedades mecnicas

Mtodo de inmovilizacin Efectos de transferencia de masa Estabilidad operacional

Rendimiento (%) Eficiencia () # de ciclos

Comportamiento
Consumo de enzima (U/kg producto)
Productividad (kg producto/U)
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Inmovilizacin de enzimas
Costo de la enzima

Grado de purificacin requerido de la enzima

Costo del proceso de inmovilizacin

Estabilidad de la enzima

Efectos de inhibicin y envenenamiento

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Pros y contras de la Inmovilizacin

PROS CO(TRAS

Alta estabilidad y resistencia al Existencia de la resistencia a la

esfuerzo cortante y a la
contaminacin
Fcil de desarrollar procesos
continuos
Rpidas tasas de reaccin
transferencia de masa
Necesidad del proceso de
inmovilizacin
Costos adicionales de reactivos
para la inmovilizacin

Fcil separacin de los productos Prdida de actividad durante la

etapa de inmovilizacin
Uso repetitivo del catalizador
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Inmovilizacin de enzimas
La inmovilizacin es la restriccin espacial de la movilidad de la enzima
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Mtodos de inmovilizacin

A A: Mtodos de enlace a
soportes
a) Enlace covalente;
b) Adsorpcin fsica;
c) Fuerzas electrostticas
B C
B: Entrecruzamiento

C: Atrapamiento

Enzyme in Industry: Production and Applications, pg 66.

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Atributos ideales de un soporte

Alta rea superficial

Permeable
Insoluble
Alta rigidez
Regenerable
Resistente a ataque microbiano y qumico
Estable mecnicamente y trmicamente
Hidrofobicidad controlada
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Mtodos de inmovilizacin claves
Unin Covalente
Glutaraldehido
CNBr-activacin
cidos cclicos (glicoproteinas)
Carbodimidas Ms comn para enzimas
Adsorcin
Intercambio inico
Hidrofobicidad
Entrecruzamiento
Encapsulacin Ms comn para clulas
Geles polimricos
Liposomas y otras bicapas
Mtodos emergentes
Avidin/streptavidin y biotin
Oligonucletidos-protein fusions
Materiales biocatalticos
Silicones/silicatos/sol-geles
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Mtodos de inmovilizacin: Soportes

Tipos de enlace Tipos de Soporte

Enlace covalente Inorgnicos: p.ej.

Slica, Vidrio poroso

Adsorcin fsica Orgnicos: p.ej.

Poliamida,
Enlace inico Poliacrilamida

Biolgicos: p.ej.
Celulosa, Quitosano
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Enlace Covalente

El soporte en este caso es amino alkoxy silano

Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237
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Enlace Covalente

Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237

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Adsorcin Fsica

Los biocatalizadores enlazan a los soportes por

interacciones fsicas tales como interacciones
hidrofbicas, fuerzas de van der Waals, etc.

Frecuentemente se usan soportes inorgnicos.

Actualmente, estn disponibles varios materiales
naturales que tienen fuertes capacidades de adsorcin.
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Unin a un soporte por adsorcin fsica

El mtodo se basa en la adorcin fsica de las molculas de

enzima en la superficie de una matriz slida, poniendo en
contacto una solucin acuosa de enzima con el soporte.

Procedimiento esttico
Mtodos de Electrodeposicin
adsorcin fsica Proceso de reactor
Bao con agitacin
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Mtodos de inmovilizacin : Atrapamiento

El mtodo de atrapamiento de inmovilizacin est

basado en la localizacin de una enzima dentro de un
enrejado de una matriz polimrica o membrana de tal
forma que previene la liberacin de proteina mientras
permite la penetracin de substrato.

- La enzima no se enlaza de ninguna forma a la matriz

del gel o a la membrana.
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Mtodos de inmovilizacin : Entrecruzamiento

Definicin: Formacin de enlaces covalentes entre las

molculas de enzima, por medio de reactivos bi- o
multifuncionales, formando agregados entrecruzados
tridimensionales.

Mtodos: Adicin de una cantidad apropiada de agente

entrecruzante a una solucin de enzima bajo condiciones
que den un aumento en la formacin de enlaces covalentes
mltiples.
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Mtodos de inmovilizacin: Entrecruzamiento (cont)

Handbook of Enzyme Biotechnology, pg. 585

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Limitaciones difusionales en sistemas de enzimas

inmovilizadas
Vm S s
J s = k L ( Sb S s ) =
K m + Ss
maximum rate of reaction V
 Da = = m
maximum rate of diffusion k L Sb

Da<<1 Limitado por reaccin

Reaccin y difusin -
Da1 resistencias comparables

Da>>1 Limitado por difusin

Da = mero de Damhkler
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Factor de efectividad
Para reacciones donde las limitaciones pueden ser importantes, la
tasa de reaccin aparente es frecuentemente expresada en trminos
de un factor de efectividad,

reaction with diffusional limitations

=
intrinsic reaction rate

Para una reaccin enzimtica que sigue la cintica de Michaelis-Menten

Vm S s
rsurface =
K m + Ss
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Limitaciones difusionales para enzimas inmovilizadas

en pellets porosos
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Perfil de concentracin en estado estacionario en pellets
porosos
Consideraciones:
Cintica de Michaelis-Menten
Enzima uniformemente distribuida a travs del pellet
No hay particin de substrato entre el interior y el exterior del pellet

Ecuaciones gobernantes:

d 2 S 2 dS Vm S
De 2 + =
dr r dr K m + S
S ( R) = S s
dS
=0
dr r =0
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Adimensionalizacin

S r Km
Definir variables adimensionales: S = ,r = , =
Ss R Ss
Introducir en los balances de masa y las condiciones frontera
d2S 2 dS S
2
+ = 2

dr r dr S
1+

dS Vm K m
S (1) = 1, = 0, = R
dr r =0
De
A menos que la reaccin sea de 1er orden, el sistema no tiene solucin
analtica con la cintica de Michaelis-Menten
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Grfica versus en el sistema Michaelis-Menten

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Diseo de pellets inmovilizados

Minimizar el radio de partcula

dentro las limitaciones
mecnicas

Optimizar la carga de la
enzima
Alto contenido de enzima
incrementa la tasa intrnseca de la
reaccin pero disminuye el factor
de efectividad
Bajo contenido de enzima
incrementa el factor de
efectividad pero disminuye la tasa
intrnseca de la reaccin
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Reactores enzimticos

Discontnuos (Enzimas libres e

inmovilizadas)

Tipos de
reactores

Contnuos (Enzimas inmovilizadas)

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Reactores discontnuos

Tipo tanque agitado con paletas Tipo tanque agitado con mamparas
que incluyen enzimas inmobilizadas que incluyen enzimas inmobilizadas

Reactor de lecho empacado Reactor de lecho fluidizado

con reciclado total con reciclado total
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Reactores contnuos

Reactor de lecho Reactor de lecho Reactor de fibra

empacado fluidizado hueca

Tipo tanque agitado con recuperacin por ultrafiltracin

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Reactor de tanque agitado contnuo

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Reactor de lecho empacado

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Reactor de lecho fluidizado

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Reactor de membrana
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Tecnologa de enzimas comerciales

High fructose corn syrup (xylose isomerase)
L-Amino acids (amino acylase, amino acid dehydrogenases, lyases)
D-Amino acids (hydantoinase)
L-Aspartic acid (aspartase)
L-Malic acid (fumarase)
Glycidyl butyrate (lipase)
Cis-dihydrodiols (dioxygenase)
Muconic acid, chiral amines (aminotransferase)
Semisynthetic penicillins and cephalosporins (penicillin amidase)
Acrylamide (nitrile hydratase)
Phenolic resins (peroxidase)
Food applications (many)
Industrial enzyme market ca. $1.5 billion
Chiral market estimated at $5-10 billion
Discovery markets - ??? (pharma spends ca. $15B/yr)
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Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada

Informacin estructural
GI es un tetrmero de 4 unidades
idnticas de cerca de 45,000 kDa
Compuesto como un dmero de
dmeros
Cada monmero est compuesto
de aproximadamente 16 hlices
alfa y 15 lminas beta
La interface monmero-
monmero es 3 veces ms
grande y fuerte que la interface
dmero-dmero
2 Mn2+ son necesarios para la
From Bacillus Coagulans, Isolated by actividad xilosa y 2 Co2+ para la
Novozyme, Inc. actividad glucosa isomerasa
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Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada

La isomerizacin de glucosa a jarabes de maz de alta fructosa

(HFCS), exclusivamente como un reemplazo de costo reducido para
soluciones de sacarosa y azcar invertida

Background:
Altas temperaturas de reaccin para altos rendimientos de fructosa
pH 7 para la actividad y estabilidad de la enzima
PERO, la glucosa y la fructosa son inestables, fcilmente se
descomponen a cidos orgnicos y subproductos coloreados
El tiempo de reaccin debe ser minimizado
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Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada

Condiciones del proceso:

En reactores de lecho fijo contnuos
Temperatura: 55-60 oC
pH: ptimo pH de la enzima
Los grnulos de la enzima deben ser
suficientemente rgidos para prevenir la
compactacin durante la operacin
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Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada
Rendimiento
Mtodo de Inmovilizacin (kg producto
seco/ kg enzima)

1. La enzima, despus del aislamiento y

purificacin, es covalentemente 20,000
inmovilizada sobre un soporte inerte
2. Entrecruzamiento de clulas que 2,000-4,000
contienen las enzimas deseadas
3. La enzima parcialmente purificada es
inmovilizada sobre resinas de 7,000- 10,000
intercambio inico
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Conclusiones

La inmovilizacin permite el uso repetitivo de la enzima

lo que significa un ahorro significativo en los costos

La seleccin de los mtodos de inmovilizacin debern

estar basados en los requerimientos tcnicos especficos
y en el marco global de su aplicacin comercial