Manual de Bioqumica II

Prctica 1.

HIDRLISIS ENZIMTICA DEL ALMIDN, UN POLISACRIDO

VEGETAL.

INTRODUCCIN.

El almidn es un homopolisacrido de
reserva formado por molculas de
glucosa, se encuentra en productos
vegetales como la papa, cereales,
legumbres, entre otros.

Qumicamente, el almidn es una

macromolcula formada por amilosa
Enlace glusdico 1-6
(15-20%) con una estructura
helicoidal no ramificada de glucosas
(1-4), y amilopectina (80-85%) con
estructura ramificada, con glucosas
(1-4) en la cadena continua y (1-6)
en los puntos de ramificacin.
Amilopectina

Cuando las semillas germinan, el u

almidn es degradado mediante la
amilasa que es la encargada de
romper los enlaces glucosdicos.
Esto, con la finalidad de proporcionar
las molculas de glucosa que sern
oxidadas para producir la energa 0 3 5
que requiere el embrin para su
desarrollo antes de que pueda
realizar la fotosntesis.

OBJETIVO GENERAL.
Comprobar la actividad enzimtica de las amilasas producidas por semillas de
maz al hidrolizar almidn y dando como producto final unidades de maltosa.

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OBJETIVOS PARTICULARES.
Obtener semillas de maz germinadas a 5, 3 y 0 das.
Extraer las enzimas de las semillas germinadas.
Realizar una curva patrn con maltosa.
Determinar la actividad de la enzima al hidrolizar almidn.
Determinar la cantidad de reductores totales producidos de la hidrlisis
enzimtica.

HIPTESIS.
Generada por el estudiante.

MATERIAL Y EQUIPO.
Material por equipo.

1 Mortero con pistilo.

1 Bistur.
6 Tubos de centrfuga de 15 mL.
1 Parrilla de calentamiento.
2 Vaso de precipitados de 1 L (para Bao Mara de 25 o C y 100o C).
1 Termmetro.
1 Embudo de filtracin de 5 cm de dimetro.
3 Pipetas Pasteur con perilla de hule.
2 Pipetas de 1 mL.
1 Pipeta de 5 mL.
1 Pipeta de 10 mL.
25 Tubos de ensayo.
1 Gradilla.
1 Espectrofotmetro.
1 Centrfuga clnica.
1 Par de celdas.
1 Recipiente plstico para poner hielo.
1 Agitador (Vortex).

Material proporcionado por los alumnos.

3 Bolsas de gasa.
20 Semillas de maz.

Material por grupo.

1 Balanza de 2 platos.

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Hielo.

Reactivos.

Hipoclorito de sodio.
cido succnico.
CaCl2.
Maltosa.
Na CO3 anhidro.
Tartrato de Na y K.
NaHCO3.
NaSO4 anhidro
CuSO4 5 H2O.
H2SO4.
Molibdato de amonio.
Arsenato de sodio .7H2.
Almidn.

Soluciones.

Hipoclorito de sodio al 1%. Hacer una dilucin 1:100 de cloro comercial.

Amortiguador de Succinato-CaCl2. cido succnico 0.02 M, CaCl2 0.02 N. Ajustar
a pH 5 con NaOH 0.1 M.
Patrn de Maltosa: 500 ug/mL. Pesar 0.05 g de maltosa y aforar a 100 mL con
agua destilada.
Almidn: 20 mg/mL. Pesar 800 mg de almidn soluble y disolver en 5 mL de
agua destilada. Agregar a 15 mL de agua hirviendo y continuar durante un
minuto. Enfriar y finalmente agregar 20 mL de amortiguador de Succinato-
CaCl2. (Se prepara al momento de usarlo).
Solucin A. Tartrato doble de Na y K. Disolver 25 g de Na CO 3 anhidro, 25 g
de Tartrato de Na y K, 20 g de Na HCO 3 y 200 g NaSO 4 anhidro. Aforar
a 1 litro de agua destilada.
Solucin B. Sulfato cprico. Disolver 30 g de CuSO 4 . 5 H2O en 200 mL de agua
destilada que contenga 4 gotas de H2SO4 concentrado.
REACTIVO I. Agregar 1 mL de la Solucin B a 25 mL de la Solucin A. (Preparar
unos minutos antes de usarse).
REACTIVO II. Disolver 25 g de Molibdato de amonio en 450 mL de agua
destilada, que contenga 21 mL de H 2SO4 concentrado. Por separado,
disolver 3 g de Arsenato de sodio .7H2O en 25 mL de agua y agregar a la
solucin anterior, despacio y con agitacin constante (emplear agitador
magntico). Aforar a 500 mL, incubar a 37C por una noche y posteriormente
en un bao de agua a 55C durante 30 minutos.

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
A. Actividad previa a la realizacin de la prctica.

1. Cinco das antes de la prctica, elegir 10 semillas de maz grandes y sanas.

Desinfectar las semillas, ponindolas a remojar durante 3 minutos en
hipoclorito de sodio al 1%. Despus, lavarlas varias veces con agua hervida
fra, para que queden libres de impurezas y del desinfectante.
2. Sembrar las semillas en una caja de Petri (o frasco limpio) que contenga algodn
estril y hmedo. Revisar que permanezca hmedo durante el tiempo de la
germinacin.
3. Tres das antes de la prctica, elegir otras 10 semillas, desinfectarlas y sembrar
en otra caja de Petri (o frasco limpio) como se indic en el paso 1 y 2.
4. Elegir una semilla para ser utilizada el da de la prctica.

B. Preparacin del extracto enzimtico (realizar todo el procedimiento en

hielo).

1. Poner en agua una semilla de maz sin

germinar durante 5-10 minutos que ser la
de cero das de germinacin.
2. Seleccionar una semilla de tres das y otra
de cinco das de germinacin.
3. Quitar a las semillas germinadas el
embrin o plntula y el escutelo (segn el
caso) con el bistur, dejando el
endospermo almidonoso (ver figura).
4. Preparar un extracto enzimtico de cero,
tres y cinco das de germinacin (A, B y C,
respectivamente) de la siguiente manera:

a) Macerar por separado, el endospermo de cada una de las semillas: de

cero, tres y cinco das de germinacin, en un mortero con 5 mL de
amortiguador de succinato pH 5.
b) Vaciar el homogenado de cada uno a un tubo de centrfuga, etiquetar
como se indic A, B, y C, filtrndo a travs de una gasa doblada. Lavar el
mortero con otros 5 mL de amortiguador y adicionarlo al mismo tubo.

5. Centrifugar las muestras a 3000 rpm durante 20 min a temperatura ambiente.

6. Separar el sobrenadante de cada muestra con una pipeta Pasteur, colocarlo
en un tubo A, B y C segn le corresponda. Dejarlos en hielo.

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C. Curva Patrn.
Realizar la curva patrn con base en lo indicado en la tabla 1. Hacerlo por
duplicado.
TABLA 1.
CURVA PATRN
Tubo no. Patrn de maltosa (mL) Agua (mL)
1 0 0.5
2 0.1 0.4
3 0.2 0.3
4 0.3 0.2
5 0.4 0.1
6 0.5 0

blopres
D. Determinacin de reductores totales.

1. Realizar la hidrlisis del almidn con el extracto enzimtico de cada una de

las muestras problema: A, B y C. Seguir las indicaciones de la Tabla 2, las
determinaciones se realizan por duplicado.

TABLA 2.

MUESTRAS PROBLEMA
Tubo no. Das de Extracto Extracto Solucin de
Germinacin enzimtico (mL) Almidn (mL)
7 Cero A 0.1 0.4
8 Tres B 0.1 0.4
9 Cinco C 0.1 0.4

2. Incubar todos los tubos (Curva Patrn y Problemas) durante 10 minutos a

25C.
3. Agregar a todos los tubos, 0.5 mL del Reactivo I, e incubar durante 20 min en
un bao de agua hirviendo, posteriormente enfriar al chorro del agua.
4. Agregar a todos los tubos 0.5 mL del Reactivo II y agitar vigorosamente
(Vortex).
5. Agregar a todos los tubos 8.5 mL de agua y leer la absorbancia a 520 nm en
un espectrofotmetro.

RESULTADOS.
1. Tabular los datos obtenidos de la Curva Patrn:

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CURVA PATRN
Tubo no. Patrn de Patrn de Absorbancia
maltosa (g) maltosa (mg)
1
2
3
4
5
6

2. Realizar la grfica de la Curva Patrn y determinar la ecuacin de la recta

correspondiente.
3. Tabular los siguientes datos de las muestras. Mediante la interpolacin de la
absorbancia, en la grfica de la Curva Patrn o mediante la ecuacin de la
recta, determinar los mg de azcar reductor y determinar el valor promedio.
Multiplicar por el factor de dilucin, para determinar la cantidad total de
azcar reductor.

MUESTRAS PROBLEMA
Tubo. Das de Absorbancia Azcar Promedio Promedio Total azcar
germinacin reductor (mg) (mg/mL) reductor
(mg) (mg/semilla)
7 Cero
8
9 Tres
10
11 Cinco
12
As debe quedar este cuadro? En el cuadro de las muestras problema en
Determinacin de reductores totales, lo tienes diferentes.

4. Obtener el valor promedio de mg totales de azcar reductor, as como su

desviacin estndar, para los tratamientos de cero, tres y cinco das de
germinacin y registrarlos en una tabla.
5. De los resultados anteriores, realizar un histograma indicando ttulo, variables
y desviacin estndar.

ANLISIS DE RESULTADOS.

Recuerda que debes hacer un ANLISIS amplio y especfico de cada uno de los
resultados obtenidos y que detallaste en el punto anterior.

Algunos de los puntos que puedes considerar para tu anlisis son los siguientes:

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Significado de la curva patrn indicando para qu y por qu se realiza.

Significado de los valores de absorbancia obtenidos en las muestras problema.
Con base en qu los azcares reductores forman un compuesto colorido.
Los elementos que intervienen en la reaccin de hidrlisis.
Significado de la activacin de la enzima en la semilla en germinacin.
Actividad de la enzima a los 0, 3 y 5 das de germinacin.

CUESTIONARIO PREVIO.
1. Cmo est conformada la estructura del almidn?
2. Qu es un azcar reductor?
3. Qu tipo de enlaces son hidrolizados por las amilasas?
4. Qu es una curva patrn?
5. Explique en qu consiste el mtodo de Nelson-Somogy para determinar
reductores totales.
6. Por qu se lee la absorbancia de las muestras a una longitud de onda de
540 nm?
7. Qu es el escutelo de la semilla?
8. De los reactivos qumicos empleados en esta prctica determine de cada
uno, su uso y dao a la salud.

BIBLIOGRAFA.

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739 pp.
2. Conn E., Stumpf P. K., Bruening G. y Doi R. H. 2001. Bioqumica
Fundamental. 2a. ed. Limusa. Mxico. 736 pp.
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Addison Wesley. Mxico.1335 pp.
4. Mckee T. y Mckee J R. 2003. Bioqumica. La base molecular de la vida. 3a.
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almidon.htm