RESUMEN.

En el siglo XVII, el ingls Robert Hooke dio a conocer la estructura del corcho y otros
tejidos vegetales, y llam clulas a los pequeos huecos polidricos que lo integraban a
modo de celdillas de un panal. Tuvieron que pasar dos siglos para que los bilogos
dieran la importancia que se merece al contenido de esas celdillas. En el siglo XIX, el
concepto de clula experimenta una considerable variacin, la clula ya no es la
estructura polidrica de Hooke, sino lo que hay en su interior. Es ms, muchas clulas
carecen de esa pared y no por eso dejan de ser clulas. Pero el hecho fundamental del
siglo XIX es el establecimiento de la teora celular, que afirma y reconoce la clula
como la unidad bsica de estructura y funcin de todos los seres vivos. Es decir, a pesar
de la diferente diversidad de formas, tamaos y funciones de los seres vivos, en todos
hay un fondo comn elemental: la clula.

Esta idea revolucionaria constituye uno de los pilares fundamentales sobre los que se
apoya la Biologa moderna, y sirvi para desplazar en gran medida el centro de
gravedad de las investigaciones hacia el terreno microscpico. Pronto se descubrieron el
ncleo, los cromosomas, el aparato de Golgi y otros organelos celulares, y la
introduccin en Biologa del microscopio electrnico revel innumerables detalles de
las ultraestructura celular, poniendo an en ms de manifiesto esa unidad existente entre
todos los seres vivos, a pesar de la aparente diversidad. Los hallazgos conseguidos por
este procedimiento, junto con los descubrimientos iniciados a finales del siglo XIX
sobre la relacin existente entre la estructura y la funcin de los organelos celulares,
resultaron en parte de la unin de tcnicas histolgicas, citolgicas y qumicas, cuyo
resultado fue la aparicin de la histoqumica y de la citoqumica. Al descubrirse que la
base material de la herencia son los cromosomas y que la molcula portadora de la
informacin que se transmite de una generacin a otra es el ADN, se establecieron las
bases de la citogentica. En la actualidad son tantos los campos de la Biologa que han
enriquecido a la citologa, y han sido tan importantes y transcendentales las
repercusiones de estos conocimientos a todos los niveles de organizacin, que la clula
ha pasado a ser el centro de la atencin de muchos investigadores y a constituir por s
sola un captulo importante entre las ciencias biolgicas, al que por mrito propio se
llama "Biologa celular".

El estudio de la estructura de la clula es indispensable, pues, siendo la unidad

anatmica funcional de todos los tejidos tiene la capacidad para efectuar de una manera
individual todas las funciones esenciales para la vida. Las clulas de todos los tejidos
muestran especializaciones que no son otras cosas que amplificaciones de las funciones
celulares bsicas, pero, aunque en cada uno de estos vare el tamao, forma o nmero de
sus organelos podemos encontrar de forma general en cada clula nucleolo, ncleo,
citoplasma, aparato de Golgi, mitocondrias, membrana plasmtica, retculo
endoplasmtico, pared celular.
OBJETIVOS.

Aplicar los principios de la centrifugacin en el fraccionamiento celular en una

gradiente de sucrosa y comprobar la presencia de organelos en las distintas fracciones
mediante microscopia de contraste de fases.

Medir la concentracin de sacarosa de cada fraccin con un refractmetro, determinar

su densidad y asociar con densidad de cada uno de los organelos.
INTRODUCCIN.

Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en
un medio apropiado (una solucin amortiguadora, salina azcar isotnica). Para
mantener la integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento de
fraccionamiento, todas las soluciones deben mantenerse fras. Despus de rebanar las
hojas, el tejido est preparado para la homogenizacin, procedimiento que rompe los
enlaces celulares y libera el contenido celular, sin daar el medio en suspensin. La
suspensin de clulas constituyentes se llama homogenizado. Para los tejidos de plantas,
la homogenizacin se debe realizar con un mortero, al cual se le agrega solucin
amortiguadora.

El fraccionamiento celular permite separar los componentes de las clulas. Las

membranas y organelos celulares suelen separarse mediante centrifugadoras, aparatos
que hacen girar tubos de ensayo. Esto ejerce una fuerza centrfuga en el contenido de los
tubos, que sedimenta las partculas suspendidas en la solucin (como los organelos y
membranas de clulas). Algunas de estas partculas, como las mitocondrias, son
organelos completos. Otras son pequeas vesculas cerradas, llamadas microsomas,
constituidas por membranas de Retculo Endoplasmtico, complejo de Golgi y
membrana plasmtica. Despus de la centrifugacin algunas de las partculas forman un
condensado en el fondo del tubo. Las diferentes partes celulares tienen densidad
distinta, lo que permite separarla en fracciones celulares al centrifugar la suspensin a
velocidad creciente (centrifugacin diferencial). Las membranas y los organelos de los
condensados resuspendidos pueden purificarse despus mediante centrifugacin por
gradiente de densidad, que se ilustra como el ltimo paso en la figura. El condensado
resuspendido se dispone en una capa en la parte superior de una gradiente de densidad,
por lo general compuesto de una solucin de sacarosa y agua. Dado que las densidades
de los organelos y las membranas difieren, cada uno emigrar durante la centrifugacin
y formar una banda a una altura distinta en el gradiente.

La centrifugacin es un mtodo por el cual se pueden separar slidos de lquidos de

diferente densidad mediante una centrifugadora, la cual le da a la mezcla un movimiento
rotatorio con una fuerza de mayor intensidad que la gravedad, provocando la
sedimentacin del slido o de las partculas de mayor densidad. Este es uno de los
principios en los que se basa la densidad. Todas las partculas, por poseer masa, se ven
afectadas por cualquier fuerza (origen de una aceleracin). La centrifugacin impone,
gracias a la aceleracin centrfuga, un efecto parecido al gravitacional. Las partculas
experimentan una aceleracin que las obliga a sedimentar. La centrifugacin puede
dividirse en primera instancia en dos grandes grupos: La preparativa y la analtica. En la
primera, se obtienen grandes cantidades del material que se desea estudiar, mientras que
en la segunda se procede al anlisis de las macromolculas en una ultracentrifugacin.
Existen diversos mtodos de centrifugacin y una extensa variedad de tcnicas
derivadas de esta.
MATERIALES.

Hojas frescas y tiernas de espinacas.

Soluciones de sucrosa en 0,01 M EDTA, Ph 7,5: 33%, 44%, 50%, 57%, 60%
(p/v)

Medio para homogenizar:

1. 0,4 M Sucrosa
2. 0,165 M Tris-HCl buffer, pH 7,5
3. 0,01 M KCl
4. 0,01 M MgCl2
5. 0,01 M EDTA ajustado a pH 7,5
6. 0.01 M ditiotreitol

Cuchillo o tijeras.

Mortero.

Gasa para filtrar

Ultracentrifuga beckman con rotor swinging bucket SW 28.1

Centrifuga Sigma.

Microscopio contraste de fases o de campo claro.

Refractmetros de 0 a 30% y de 28 a 60%

PROCEDIMIENTO.

1.- Pesar 25g de hojas frescas y jvenes de espinacas y cortarlas en trozos pequeos,
descartando las nervaduras. Molerlas en un mortero en bao de hielo por 30 seg.
Despus continuar vigorosamente mientras agrega lentamente 50 ml de medio
homogenizante frio. Rpidamente filtrar a travs de una doble capa de gasa. Apriete
suavemente la pulpa para extraer el lquido residual. Transferir alcuotas de 10 a 20 ml
del filtrado a tubos de centrifuga y centrifugue a 4C por 10 minutos 270g para remover
clulas enteras y otros restos de tejidos vegetales. Utilizar la centrifuga Sigma, mientras
espera, observe al microscopio la estructura de la hoja de espinaca mediante un corte
vertical muy fino montado en un portaobjeto. Reconozca los componentes celulares de
la clula vegetal.

2.- Mientras tanto, preparar 2 tubos de centrifuga para la gradiente de sucrosa. Para los
tubos del rotor SW 28.1 Beckman de capacidad 17 ml colocar las siguientes soluciones
lentamente y en orden, la solucin ms concentrada al fondo, escurriendo por las
paredes del tubo:

1,5 ml de sucrosa 60%

3,0 ml de sucrosa 57%
4,5 ml de sucrosa 50%
4,5 ml de sucrosa 44%
1,5 ml de sucrosa 33%

3.- Retirar el sobrenadante de la primera centrifugacin en dos tubos de centrifuga

limpios y fros, volver a centrifugar a 4C por 30 minutos 16.600g en la centrifuga
Sigma. Mientras espera, tome una pequea muestra de pellet obtenido y obsrvela en un
microscopio. Dibuje lo que observa.

4.- Retirar el sobrenadante de la segunda centrifugacin y gurdelo en 2 tubos de

centrifuga en frio para ser analizado en un laboratorio posterior, en la cuantificacin de
protenas solubles totales y en la separacin de protenas por electroforesis.

5.- Resuspender el pellet en 6 ml de medio homogenizante. Cuidadosamente colocar 1

ml de pellet resuspendido sobre la gradiente de sucrosa de los dos tubos que habr
preparado previamente. Balancear el peso de ambos tubos agregando medio
homogenizante si fuese necesario, de manera de obtener el mismo peso en ambos tubos.

6.- Centrifugar los tubos a 4C por 2 horas a 25000 rpm en un rotor SW 28.1 en la
ultracentrifuga Beckman.

7.- Despus de completada la centrifugacin, observar las zonas formadas y fraccionar

el contenido de tubo en 11 porciones de 1,5 ml cada una. Para esto utilizar una
micropipeta de 1000l. Recoger las muestras en tubos Eppendorf. Mediante un
refractmetro medir porcentaje de sucrosa en cada fraccin y relacionar con su
correspondiente densidad en la tabla 3.2. Basado en nivel que ocupa cada fraccin y en
su densidad respectiva estime la ubicacin de los distintos organelos celulares segn la
tabla 3.1.
DIAGRAMA DE FLUJO.

Tejido Medio homogenizante

vegetal

Tejido vegetal homogenizado

Filtrado del tejido

Proceso de fraccionamiento

Centrifugacin
diferencial Centrifugacin en gradiente de
Primera centrifugacin densidad
por 10 min. a 270g

Pellet Sobrenadante
Preparacin de
Trozos celulares Segunda gradiente de
y organelo de centrifugaci sucrosa
gran tamao n 20 min. a
19246g

Observacin
bajo el
microscopio Resuspender el
Sobrenadante Pellet pellet en medio
homogenizante

Guardar muestra Organelos de Ultracentrifugacin

para cuantificacin menor tamao por 2 horas
de protenas

Medicin en
Obtencin de % de Bandas zonales refractmetro
sucrosa de las fracciones

Identificacin de organelos
RESULTADOS.

Observaciones generales.

El primer paso en el fraccionamiento celular de la mayora de las estructuras

subcelulares es el rompimiento de las clulas para obtener un homogenizado celular en
el que las estructuras subcelulares se encuentre en condiciones que permitan su
aislamiento. Esto lo conseguimos mediante la maceracin de las hojas de espinacas en
un mortero, empleando el medio homogenizante, el cual liber el contenido celular de
dichas hojas.

Observaciones de la Centrifugacin Diferencial.

Esta centrifugacin se basa en hacer girar un tubo a gran velocidad de forma que se
produzca en el fondo de ste, la acumulacin de las partculas que tienden a hundirse
por tener una mayor densidad que la del medio en la que se encuentra.

En la primera centrifugacin realizada a 270g que equivalen a 1858 rpm, a 4 C por 10

minutos. La muestra homognea se separ en 2 fracciones:

Sobrenadante, fraccin homognea que no sediment.

Pellet, sedimento que qued adherido al fondo del tubo.

El sobrenadante obtenido los centrifugamos nuevamente, pero ahora a 19246g que

equivalen a 14489 rpm, durante 20 minutos a 4 C. Concluida esta segunda
centrifugacin obtuvimos un sobrenadante ms claro que el anterior porque precipitaron
mayor cantidad de partculas. El Pellet resultante de sta centrifugacin, lo
resuspendimos en el medio homogenizante para ser utilizado en la centrifugacin en
gradiente de densidad.

Observaciones de la Centrifugacin en Gradiente de Densidad.

El Pellet resuspendido en homogenizante sobre la gradiente de sucrosa, esta es nuestra

nueva muestra.

Al centrifugar en la ultracentrifuga Beckman por 2 horas a 25000 rpm en un rotor SW

28.1, cada componente subcelular se desplazar hacia arriba o hacia abajo hasta que
alcance una posicin en la que su densidad sea igual a la de su entorno, en este
momento no se desplazar ms. Debido a esto, se produjeron una serie de bandas
zonales discretas (diferentes poblaciones de partculas), las cuales recogimos en
diferentes fracciones que contenan a las distintas poblaciones separadas. Las ms
prximas al fondo del tubo contienen las partculas con mayor densidad de flotacin.

Recogimos fracciones de la muestra, mediante el refractmetro determinamos la

concentracin de sucrosa en cada fraccin.
DATOS Y CALCULOS OBTENIDOS.

Los datos obtenidos permiten crear un perfil de migracin en el gradiente de sacarosa

midiendo la absorbancia de las fracciones, mediante el refractmetro, los datos
obtenidos son los siguientes:

N de Fraccin % de Sucrosa
1 22.5
2 31.5
3 32
4 33.5
5 38
6 39
7 39.5
8 40
9 40.5
10 41.5
11 44
12 44

Estos datos permiten encontrar la densidad de la sucrosa en las distintas fracciones,

basndose en tabla que relaciona densidad y los ndices de refraccin de la sucrosa.

Al comparar las densidades obtenidas con la densidad de los organelos, se logra obtener
la ubicacin posible de stos en las fracciones:

N de % de Densidad de Posible ubicacin de organelos

fraccin sucrosa sucrosa ( g/cm3)
1 22.5 1.0944 Aparato de Golgi
2 31.5 1.1318 Plant viruses
3 32 1.1366 Plant viruses
4 33.5 1.1415 Plant viruses
5 38 1.1663 Retculo endoplasmtico liso o
membrana plasmtica
6 39 1.1713 Ribosomas, cidos nucleicos
7 39.5
8 40 1.1764
9 40.5 1.1640 Retculo endoplasmtico liso o
membrana plasmtica
10 41.5 1.1842
11 44 1.1972 Mitocondria
GRAFICO % DE SUCROSA V/S N DE FRACCIN.
CUESTIONARIO.

1.- Investigue la funcin que cumple, en esta experiencia, cada uno de los reactivos que
componen el medio para homogenizar.

Medio para homogenizar:

a) 0.4 M Sucrosa: Acta como un tampn osmtico, manteniendo la

concentracin isotnica de la clula. Crea un medio de presin osmtica,
similar a la que existe en el interior de la clula, con esto evita que las
clulas se hinchen, porque ya estn abiertas, y desintegren por la violenta
entrada del agua. Su accin extracelular mantiene el medio
hiperosmtico y el agua no entra, sale de la clula para equilibrar el
medio.

b) 0.165 M Tris-HCl buffer, pH 7,5: Es una dilucin amortiguadora o

tampn, que sirve para mantener el pH del medio constante, ya que
podra ser afectado por iones.

c) 0.01 M KCl y 0.01 M MgCl2: Son sales que entregan la fuerza inica
necesaria para la especie quelante en el medio homogenizante.

d) 0.01 M EDTA ajustado a pH 7,5: Su funcin es ser un agente quelante de

iones para disminuir la concentracin de iones disponibles en el medio
extracelular, evitando que sean sustratos de las enzimas y as inhibir la
accin de stas.

e) 0.01 M ditiotreitol: Es un agente desnaturalizante que rompe puentes

disulfricos (S-S) presentes en las enzimas, por lo tanto las inactiva,
evitando as obtener organelos destruidos por la accin de stas.

2.- Cul es el objetivo de mantener temperaturas bajas (4C) durante el

procedimiento?.

El objetivo de mantener una temperatura baja (4C) es para evitar el sobrecalentamiento

de las muestras que podra provocar la desnaturalizacin de las clulas. Es decir, para
detener los procesos metablicos celulares, esto significa tener menor actividad celular,
lo que permite obtener organelos no destruidos por la accin de enzimas.

3.- De qu manera podra reconocer los componentes subcelulares de cada fraccin?.

Ubicacin de los Organelos.

Es difcil determinar con certeza que organelo logramos aislar de cada fraccin obtenida
con los mtodos utilizados en laboratorio. Pero por el mtodo de centrifugacin
diferencial y centrifugacin en gradiente de densidad obtuvimos una idea ms clara de
que organelos se encuentran en las fracciones, despus de haber asociado las densidades
de cada fraccin con las densidades de los organelos supuestamente obtenidos.
Para comprobar y reconocer que hemos logrado obtener el organelo deseado de cada
fraccin, debemos realizar estudios cualitativos y/o cuantitativos para determinar
presencia y concentracin del organelo. Como por ejemplo seleccionar un ensayo
enzimtico adecuado (propio del organelo a aislar), para determinar donde se encuentra
la fraccin de inters. El resultado del ensayo enzimtico determinara si se encuentra o
no la mayora de los organelos que deseamos aislar. Si el resultado da positivo, elegimos
ver que aspecto tiene, y lo hacemos a travs del reconocimiento directo con microscopia
electrnica.

N de Posible ubicacin de los organelos

Fraccin
1 Aparato de Golgi
2
3 Membrana Plasmtica o Retculo Endoplasmatico liso
4
5
6
7 Mitocondria
8 Mitocondria o Lisosoma
9 Lisosoma o Peroxisoma
10
DISCUSIN Y CONCLUSIN.

Existen muchos mtodos para el fraccionamiento celular, pero el ms utilizado en el

laboratorio consiste en separar los distintos componentes de la clula, aprovechando
sus diferentes densidades, por lo tanto, la velocidad con que sedimentan los distintos
componentes vara de acuerdo con esa densidad.

Para empezar debemos obtener un homogenizador celular, que se consigue empleando

procedimientos mecnicos suaves conocidos que liberan el contenido celular,
generalmente como homogenizacin. Luego, se fracciona utilizando algn tipo de
centrifugado (ya que las centrifugas no permiten acelerar el proceso de sedimentacin
de las partculas que tiene una densidad mayor que la del medio que las rodea), tales
como centrifugacin diferencial y/o centrifugacin en gradiente de sucrosa. En el
laboratorio pudimos darnos cuenta de algunos parmetros a tener presentes en cualquier
centrifugacin, que determinan las condiciones de su uso, por ejemplo el volumen de
solucin a centrifugar, que determinara el tipo de tubos y rotores a emplear; la
naturaleza qumica de la solucin, que determinara la naturaleza del tubo a emplear; la
diferencial de densidad entra la partcula a sedimentar y la densidad del medio en que se
encuentra. En general, cuanto mayor sea esa diferencia (menor tiempo y fuerza de
aceleracin) sedimentara antes. Cuando el diferencial es pequeo se pueden aplicar
aceleracin de cientos de miles de g durante horas.

Lo que ocurri en la centrifugacin de gradiente de sucrosa que realizamos, ya que se

baso en la diferencial de densidad de los organelos y la densidad de la sucrosa. As se
esperara como resultado que los organelos con la mayor densidad viajen hacia la parte
inferior del tubo (Ncleos), las Mitocondrias a una zona intermediaria por arriba de al
anterior, y los Ribosomas a una zona todava mas arriba.

A diferencia de la centrifugacin diferencial, la duracin de esta centrifugacin no

influye demasiado, con tal que el sistema alcance el equilibrio.

En conclusin, a partir de nuestras condiciones experimentales, consideramos que lo

importante de estos mtodos es aproximarlos a la idea del tipo de organelo que podemos
encontrar en las distintas fracciones, para luego realizar estudios cualitativos y/o
cuantitativos (como seleccionar ensayos enzimticos adecuados y reconocimiento
directo con un microscopio electrnico), para determinar la presencia y concentracin
de los organelos, lo cual nos va a servir para comprobar y reconocer que hemos logrado
aislar el organelo deseado en cada fraccin y su posterior estudio de los componentes
subcelulares. Adems la centrifugacin constituye una preparacin para posteriores
estudios sobre los componentes subcelulares.
BIBLIOGRAFIA.

Alberts y col, 1996, Biologa Molecular de la Celula

3 (ed.) Editorial Omega.
Lnhninger, 1993, Principios de Bioquimica
2 (ed.) Editorial Medica Panamericana.
S.L Wolfe. 1995, Biologia de la Celula
Editorial Wadseorth PS.

INTERNET.

http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/fraccionamiento
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/
http://es.geocities.com/centrigugacion/
 Universidad Tecnolgica Metropolitana
Facultad de Ciencias Naturales, Matemticas y del medio ambiente
Departamento de Biotecnologa
Bioqumica

LABORATORIO N 2.

FRACCIONAMIENTO CELULAR POR CENTRIFUGACIN

DIFERENCIAL Y EN GRADIENTE DE SUCROSA.

Nombres:
Alejandra Lillo Rojas.
Rodrigo Olivares Belmar.
Omar Saavedra Berrocal.
lvaro Salamanca Caldern.
Gustavo Vsquez Gonzlez.

Asignatura:
Laboratorio de Bioqumica.

Carrera:
Ingeniera en Qumica.