Seminario: Bacillus thuringiensis (Bth)

y sus aplicaciones...

Alejandro Crosa & Juan Pablo Oliver

Agroqumicos I
Noviembre 2006
Bacilo Gram +
Esporulador
Aerobio Facultativo
Distribuido en el Ambiente
Patgeno natural de Insectos
ICP
(inclusiones cristalinas paraesporales)

Cry I => Lepidpteros

Cry II => Lepidpteros, Dpteros
Cry III => Colepteros
Cry IV => Dpteros
Cry V => Lepidpteros, Colepteros
Cyt => Mosquitocidal y Citoltica
 Receptores de membrana:
Caderinas
Aminopeptidasa N (APN)
Fosfatasa alcalina
entre otras...

1 a 2 nm
 Productos a base de toxinas Bth
Insectecidas a base Bth:
1era Generacin: esporas y cristales
2da Generacin : esporas y toxinas expresadas con otras bacterias
3era Generacin : bacterias recombinantes muertas
4ra Generacin : quimeras proteicas de toxinas

Forma de Aplicacin de toxinas de Bth

Dispersin superficial de la pro-toxina y se deja secar
Microgoteo de pro-toxina ms una atrayente (como sacarosa)
Aspersin, barnizado o inmersin de la pro-toxina (hoja, tubrculos, tallos)

Toxicidad:
Nula => Animales superiores
Nula => Insectos no blanco (artropodos, abejas y abejorros)
 Productos a base de toxinas Bth
Advertencias y precauciones :
Aplicacin estados tempranos de Lepidpteros
No mezclar con sust. de pH bsico
Persistencia: Baja
Los cristales de Pro-toxina son solubles en agua

IPM: Compatibilidad con otros Agroqumicos

Compatible No Compatible
Acefato, Azinfos metil,
Carbofurano, Clordimeform,
Diazinon, Dicofol,
Captafol, captan, Demeton
Diflubenzuron, Endosulfan,
S-etil, Difolatan, Dimetoato,
Fenitrotion, Hidrcida
Bacillus thuringiensis malica, Malatin, Maneb,
Dinocap, Fentoato, Fosalon,
Isoprocarb, Leptofos,
variedad kurstaki Metomilo, Mevinfos,
Propargita, Propoxur y
Monocrotofos, Paration (etil
paration), Paration metil, Tetraclorvinfos.
Permetrin y Triclorfon,
Verticillium lecanii y Zineb.
 Productos a base de toxinas Bth
Nombre
Compaa Variedad Blanco Proteinas
Comercial
1Aa1 , 1Ab1 , 1A c1,
Dipel, Biobit kurstaki Lepidpteros
2Aa1 , 2Ab1

Coleptero 4Aa1 , 4Ba1 , 10Aa1 ,

Gnatrol israelensis
Dptero 11Aa1 , CytAa, 3Aa3

1Aa1 , 1Ab1 , 1 Ba1 ,

Abbott Labs. Novodor tenebrionis Lepidpteros 1C a1 , 1 Da1

1Aa1 , 1Ab1 , 1 Ba1 ,

Thuricide aizawai Lepidpteros 1C a1 , 1 Da1

Dibeta desconocido Desconocido -exotoxina

Able kurstaki Lepidpteros Desconocido

aizawai
Agree GC91 (T)
Lepidpteros Transconjugante

Termo Trilogy
10Aa1 , 11Aa1 ,
Cop. Teknar israelensis Dpteros C ytAa

Bioprotec kurstaki Lepidpteros 2Ab1

kurstaki
Coestar SA 12
Lepidpteros Desconocido
 Mtodos de Transformacin

Naturales: Agrobacterium
tumefaciens
Vectores Virales.

No Naturales: BioBalstica (fuerzabruta).

Protoplastos.

Mixtos: Agrolstica.
 Etapas en el desarrollo de
Plantas Transgnicas
1) Clonado: Identificacin.
Clonado
Secuenciacin

2) Diseo de la Promotor.
construccin: Targeting.
Seleccin.

3) Transformacin: Seleccin del mtodo de

transformacin.

4) Seleccin: Sistema de seleccin.

Eliminacin del gen de
seleccin.
 Agrobacterium tumefaciens

Ciclo Natural
de Infeccin
Sistema Binario
Procedimiento
1) Incubacin de A. tumefaciens
con explantes (cocultivo).
2) Regeneracin de explantes
infectados con hormonas
(auxinas y citoquininas).
Eliminacin de A. tumefaciens,
incubacin en medio selectivo.
Produccin de callos.
3) Produccin de brotes.
4) Transferencia de brotes a
medio de cultivo.
5) Crecimiento en tierra.
 Limitaciones

Poco eficiente en monocotiledneas.

Los genes se incorporan nicamente en

el genoma nuclear, no sirven para
transformar cloroplastos.
 Biolstica
Permite transformar prcticamente todas las plantas
y tambin permite transformar los genomas de
mitocondrias y cloroplastos (los cuales son
generalmente de herencia materna).

Se utilizan proyectiles de oro o tungsteno de

aproximadamente 1 m de dimetro.

Las partculas son aceleradas por el uso de gas Helio

o Nitrgeno de alta presin. Alcanzan velocidades de
ms de 440 m/s (necesarias para la penetracin).

En general la primera lnea de clulas muere por el

impacto, pero las clulas enseguida por debajo
sobreviven.
Biolstica
 Limitaciones

Alto grado de dao al tejido.

Relativamente bajo grado de transformantes estables

(1 5 % de las clulas).

Grandes variaciones entre cada experimento, los

niveles de expresin gnica son totalmente diferentes
entre cada experimento.

Limitaciones en el tamao de las construcciones.

 Agrolstica
Combina la transformacin de por Biolstica con la mediada
por A. tumefaciens.

Se incorporan a la construccin los genes virD1 y virD2,

bajo la regulacin del promotor p35S CaMV. Esto permite la
correcta escisin de la hebra-T in planta. Aumenta mucho
la frecuencia de transformacin.

Las construcciones se cotransforman por bombardeo de

partculas.
Transformacin de Protoplastos

Mtodos: Electroporacin.
Shock osmtico.
Otros.

Limitaciones: Bajo 1 2 % de transformantes.

rendimiento
0,1 % de regeneracin.
 Consideraciones finales
Efecto de la posicin:
Existe una gran variacin en los niveles de
expresin de los transgnicos.
Baja correlacin entre el nmero de copias del
transgen y el nivel de expresin.

Patrones de integracin:
Los transgenes se pueden integrar en varias
copias con una correlacin directa o invertida.
La presencia de repetidos, especialmente de
orientacin inversa, se correlaciona con el fenmeno
de silenciamineto gnico (cosupresin).
 EL PODER CONTROLAR EL
PATRN DE INTEGRACIN Y
ELIMINAR EL NMERO DE
COPIAS EXTRA DE UN
TRANSGEN ES UN OBJETIVO
PRIORITARIO DE LA
INVESTIGACIN EN EL
CAMPO DE LA BIOLGA
MOLECULAR VEGETAL
Preguntas?

y el futuro?

Muchas gracias