1. Cuntos tipos de enzimas de restriccin se conocen y cul es su funcin?

Las enzimas de restriccin se han convertido en una herramienta clave para llevar a cabo
diversas investigaciones clnicas, ya que permite determinar polimorfismos de longitud de
fragmentos de restriccin (RFLP), as como construir vectores con ADN recombinante y
clonacin de secuencias de ADN provenientes de humano, virus, bacterias y otros de inters
para ampliar el conocimiento o sus aplicaciones. De acuerdo con su funcin las enzimas de
restriccin se han clasificado en tipo I, II, III, sus caractersticas se consignan en la tabla 1.

Tabla 1. Caractersticas de las enzimas de restriccin tipo III (Salazar Montes , Saldoval Rodriguez, & Armendariz Borunda, 2013).
Tipo de
Funcin
enzima
Reconocen una secuencia especifica de nucletidos y hacen un corte aleatorio en
la doble cadena en cualquier secuencia del ADN y a una distancia aproximada de
Tipo I 1000 pb del sitio de corte; adems tienen la funcin de metilar su propio genoma.
Estas enzimas necesitan adenosin trifosfato (ATP) para moverse a lo largo de la
molcula de ADN desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte.
Reconocen secuencias especficas y hacen el corte de la doble cadena de ADN en
el mismo sitio de reconocimiento. Estas enzimas solo tienen actividad de
restriccin no de metilacion y son las utilizadas en ingeniera gentica, ya que
Tipo II cortan el ADN en secuencias especificas reconocidas. Requieren Mg2+ como
cofactor y no requieren de ADN. Las secuencias de reconocimiento de estas
enzimas son palindromicas, es decir, son secuencias que se leen igual en las dos
cadenas de ADN.
Reconocen una secuencia especfica y cortan el ADN de doble cadena fuera de la
secuencia diana (aproximadamente de 25 a 27 pares de bases corriente abajo del
Tipo III
sitio de reconocimiento). Tienen, actividad de metilasa y requieren de ATP para
desplazarse a lo largo de la molcula de ADN.

2. Qu factores afectan la actividad de las enzimas de restriccin?

Entre los factores que ms afectan la actividad de las enzimas de restriccin se encuentran:
La pureza biolgica del ADN. Contaminacin de la muestra con otros ADN impide el buen
funcionamiento de las enzimas.
Los contaminantes como detergentes y estabilizadores (docedil sulfato de sodio SDS, cido
etilendiaminotetraacetico EDTA), ya que concentraciones elevadas de sales y detergentes
inhiben la actividad enzimtica.
Modificaciones en el pH y temperatura de incubacion. Variaciones leves en estos parmetros
inhiben enormemente la actividad de las enzimas.
El grado de metilacion del ADN, ya que algunas enzimas son inhibidas por metilacion en ciertas
secuencias (Salazar Montes , Saldoval Rodriguez, & Armendariz Borunda, 2013).

3. Cmo se inactivan las R.E finalizada la reaccin de digestin?

De acuerdo a cuales son los pasos o experimentos diseados a partir del DNA digerido
(ligaciones, nuevas digestiones, tratamientos con otras enzimas) ser necesaria la
inactivacin de la endonucleasa de restriccin utilizada y/o la eliminacin del buffer de
reaccin. Para ello, algunas son inactivables por calentamiento a 60-75 C durante 10-
15 minutos. Otras es necesario extraerlas con fenol y luego precipitar el DNA. Siempre
que sea necesario eliminar el buffer, porque despus es necesario utilizar otro no
compatible, habr que realizar una precipitacin del DNA para luego poder
resuspenderlo en la solucin deseada. Muchas enzimas presentan actividad (total o
parcial) en varios buffers de composiciones ligeramente diferentes. As es posible
realizar varias digestiones con endonucleasas de restriccin diferentes al mismo tiempo
y con un nico buffer de reaccin.
4. Por qu la eficiencia de un R.E puede disminuir en la reaccin?

El laboratorio proveedor de las enzimas de restriccin adjunta las condiciones y caractersticas

optimas de actividad de las enzimas de restriccin disponibles comercialmente, las cuales se
ajustan al volumen de reaccin requerido, de acuerdo con la temperatura optima de accin,
unidades de enzimas por microlitro, tiempo de incubacion, as como otros requerimientos tal
como el ATP.

5. Pueden ser afectadas las enzimas de restriccin por ADNss o ARN en la mezcla de reaccin?

6. Por qu el corte de una enzima de restriccin puede ser afectada por la localizacin del
sitio de reconocimiento y regin dentro del cromosoma?

La localizacin del sitio de reconocimiento y la regin dentro del cromosoma pueden afectar el
corte que realiza una enzima de restriccin, ya que, en el primer caso, si el DNA no tiene la
secuencia que es reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material gentico,
por ejemplo, si el DNA est superenrollado el lugar de restriccin no va a estar accesible para la
enzima).

12. Flujo de informacin entre bacterias. Mecanismos de intercambio gentico.

La recombinacin gentica es un proceso a travs del cual los elementos genticos contenidos
en el genoma de diferentes individuos se combinan. En los procariotas este proceso se da a
travs de mecanismos independientes de la reproduccin celular y son mecanismos de
trasmisin horizontal, facilitan la adquisicin de material gentico externo y la variacin de
poblaciones. A continuacin, se exponen los diferentes mecanismos que existen para esto:
1. Transformacin: es un proceso a travs del cual las bacterias captan fragmentos de ADN
desnudo y los incorporan a sus genomas. Las bacterias grampositivas y gramnegativas
son capaces de captar y conservar de forma estable ADN exgeno. Ciertas especies
presentan una capacidad natural de captacin de ADN exgeno (por lo que se definen
como competentes), como Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y
los gneros Bacillus y Neisseria. La mayora de las bacterias carecen de la capacidad
natural para captar ADN, y ha de inducirse la competencia o utilizarse mtodos qumicos
o la electroporacin (empleo de pulsos de alto voltaje) para facilitar la captacin de ADN
plasmidco y de otro tipo (Murray, Rosenthal, & Pfaller, 2014). El proceso es complejo,
el fragmento de ADN bicatenario se una a la membrana celular y se reduce a fragmentos
bicatenarios de 7 10 kb. Una de las cadenas resultantes de estos fragmentos penetrara
en el citoplasma celular y se integrara en una regin homologa del ADN de la bacteria
receptora (Picazo & Prieto Prieto, 2016). Este proceso se ilustra en la figura 1.
 Figura 1. Mecanismos de trasformacin bacteriana (Ryan & Ray, 2010).

Existen varios mtodos (fsicos y qumicos) para introducir un plsmido en una clula
(transformar una bacteria) (Hernndez Diaz & Martnez Lpez, 2001):
a. Electroporacin: es la apertura transitoria de orificios, por medio de impulsos
elctricos, en las bacterias que permiten la entrada de ADN en suspensin. Una
de sus ventajas es que no requiere un transporte de ADN y es mucho ms rpida.

b. Tratamiento con polietilenglicol: el mtodo consiste en la fusin de clulas

animales con bacterias que contienen el gen a ser introducido. Protoplastos y
clulas animales son puestas en contacto; la fusin de las membranas celulares
por la adicin del polietilenglicol, favorece la incorporacin del plsmido dentro
de la clula. Este mtodo es raramente usado.
c. Transformacin con liposomas: se basa en la formacin de complejos entre
lpidos catinicos y ADN, llamados liposomas. Dicho complejo tiene afinidad por
la membrana y permite la entrada del ADN en el citosol. Una de las desventajas
es el elevado precio que tienen y adems de que no todos los lpidos funcionan
en todos los tipos celulares.
d. Microinyeccin: mtodo fsico activo en el que se introduce el ADN
recombinante en el interior celular con una micropipeta. Este mtodo es
utilizado cuando existe la necesidad de asegurarse que se ha introducido el
ADN. Debido a la laboriosidad del proceso, slo es utilizado sobre ovocitos o
cigotos. Por contra, puede prescindirse del vector e introducir directamente el
ADN seleccionado.
e. Microproyeccin o biobalstica: mtodo fsico activo en el que se utiliza una
micropistola que dispara microbalas de acero en las que va impregnado el ADN.
Se utiliza sobre suspensiones celulares, cultivos celulares o "in vivo" sobre
rganos como piel, hojas, etc. La alta velocidad que maneja permita atravesar
tanto las paredes celulares como las membranas.
f. Trasformacin mediada por lser: se da la apertura de microorificios mediante
un haz de lser, por lo que facilita la entrada del ADN desnudo a la clula.
g. Transfeccin: mtodo fsico activo de gran eficacia, donde el vector es un virus.
El virus introduce el ADN recombinante mediante el mecanismo normal de
infeccin viral.
h. Metodo con DEAEdextrano: DEAE (diethyl amino ethyl) dextrano es un
polmero catinico que facilita la penetracin del ADN a la clula. Adems,
protege el ADN contra los efectos de nucleasas. Su ventaja es su sencillez,
reproducibilidad y bajo costo, adems de que se requiere pocos costos de ADN.
 i. Mtodo de fosfato de calcio: se basa en la obtencin de un precipitado entre el
cloruro de calcio y el ADN en una solucin salina de fosfatos, formando unos
agregados que son endocitados / fagocitados por las clulas. Aparentemente el
agregado con calcio protege al ADN de la degradacin por las nucleasas
celulares.

2. Transduccin: esta mediada por virus bacterianos que captan fragmentos de ADN y los
almacenan en el interior de partculas de bacterifago. El ADN suministrado a las clulas
infectadas se incorpora luego al genoma bacteriano. Lo pueden hacer con replicacin
masiva -ciclo ltico- bien integrarse en su genoma - ciclo lisognico- (figura 2) (Picazo &
Prieto Prieto, 2016). La transduccin puede clasificarse como especializada si los fagos
en cuestin transfieren genes especficos (habitualmente los adyacentes a sus lugares
de integracin en el genoma) o generalizada si la incorporacin de las secuencias es
aleatoria debido al almacenamiento accidental del ADN de la clula hospedadora en el
interior de la capside del fago (Murray, Rosenthal, & Pfaller, 2014).

Figura 3. Transduccin: ciclos ltico y lisognico de los fagos temperados (Ryan & Ray, 2010).

3. Conjugacin: Produce una transferencia unidireccional de ADN desde un clula donante

(o macho) hasta una clula receptora (o hembra) a travs del llamado pilus sexual. La
conjugacin se da en la mayora de las bacterias, si no en todas, por lo general entre
miembros de la misma especie o de especies relacionadas, pero se ha demostrado
tambin entre procariotas y clulas de plantas, animales y hongos. Muchos de estos
plsmidos conjugativos de gran tamao especifican resistencia antibitica. El tipo de
acoplamiento (sexo) de la clula depende de la presencia (clula macho) o ausencia
(clula hembra) de un plsmido conjugativo, como el plsmido F de E. coli. El plsmido
F se define como conjugativo porque contiene todos los genes necesarios para su propia
transferencia, como la capacidad de fabricar pili sexuales e iniciar la sntesis de ADN en
el llamado origen de transferencia (oriT). El pelo sexual es un tipo de secrecin de
tipo IV especializado. Al transferirse el plsmido F, las clulas receptoras se convierten
en clulas macho F+. Cuando un fragmento de ADN cromosmico se ha incorporado a
la secuencia del plsmido, se designa como plsmido F prima (F9). Cuando este
plsmido se transfiere al interior de la clula receptora, transporta el fragmento y lo
convierte en un F9 macho. Cuando la secuencia del plsmido se integra en el interior del
cromosoma bacteriano, la clula se designa como clula Hfr (alta frecuencia de
recombinacin). El ADN transferido por conjugacin no es una molcula bicatenaria
helicoidal, sino una molcula monocatenaria. Este proceso se ilustra en la figura 4.
Figura 4. Conjugacin bacteriana con pilosidad sexual (Orrosquieta Vzquez, 2012).