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TUBERCULOSIS BOVINA
RESUMEN
La tuberculosis bovina es una enfermedad bacteriana crnica, de animales y del hombre, causada
por Mycobacterium bovis. En muchos pases la tuberculosis bovina es una enfermedad infecciosa
importante en el ganado vacuno, en otros animales domsticos y en algunas poblaciones de
animales salvajes. La transmisin al hombre representa un problema de salud pblica.
La infeccin del ganado bovino con tuberculosis bovina se diagnostica por lo general en el animal
vivo mediante reacciones de hipersensibilidad retardada. Habitualmente, la infeccin es subclnica;
cuando se presenta, los sntomas clnicos no son especficamente distintivos de esta enfermedad y
pueden incluir debilidad, anorexia, extenuacin, disnea, inflamacin de los ganglios linfticos y tos,
particularmente en casos de tuberculosis avanzada. Tras la muerte, se diagnostica mediante
examen post-mortem y por tcnicas histopatolgicas y bacteriolgicas. Tambin se pueden utilizar
tcnicas con sondas de ADN y la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). stas son tcnicas
exigentes y slo se deben utilizar procedimientos validados. El cultivo bacteriano tradicional
contina siendo el mtodo rutinario de confirmacin de la infeccin.
Identificacin del agente: Los exmenes bacteriolgicos pueden comprender la demostracin por
examen microscpico de bacilos cido-alcohol resistentes (constituye una confirmacin preliminar),
y el aislamiento de micobacterias en medios de cultivo selectivos y su posterior identificacin por
pruebas bioqumicas y de cultivo o con sondas de ADN o tcnicas de PCR. La inoculacin en
animales es ligeramente ms sensible que el cultivo, pero solo se debera utilizar cuando las
lesiones histopatolgicas sean compatibles con la infeccin por micobacterias y resulte negativo el
aislamiento en cultivo.
La eleccin de cul de las dos pruebas debe utilizarse depende de la prevalencia de la infeccin de
tuberculosis y del nivel de exposicin ambiental a otros microorganismos sensibilizadores.
Pruebas de laboratorio con sangre: Existen nuevas pruebas de diagnstico con sangre, por
ejemplo la prueba de proliferacin de linfocitos, la del interfern gamma y el enzimoinmunoensayo.
La logstica y la realizacin de estas pruebas en el laboratorio puede ser un factor limitante. Se
necesitan ms estudios comparativos de estas pruebas nuevas y ensayos drmicos en diferentes
condiciones de campo. El uso de pruebas basadas en sangre presenta ventajas, en especial con
ganado arisco, con animales del zoo o de tipo salvaje, aunque la interpretacin de estas pruebas
est limitada por la falta de datos en algunas especies.
A. INTRODUCCIN
Mycobacterium bovis es un microorganismo zoonsico y, durante el examen de diagnstico, debe ser tratado
como un microorganismo del grupo III de riesgo/peligro, con las debidas precauciones, para evitar que se
produzca infeccin en humanos.
La tuberculosis bovina es una enfermedad infecciosa causada por M. bovis, y se caracteriza normalmente por la
formacin de granulomas nodulares conocidos como tubrculos. Aunque se suele definir como una enfermedad
crnica debilitante, la tuberculosis bovina puede presentar en ocasiones un curso agudo, rpido y progresivo.
Cualquier tejido del cuerpo puede resultar afectado, pero las lesiones se observan con ms frecuencia en los
ganglios linfticos (sobre todo de la cabeza y trax), pulmones, intestinos, hgado, bazo, pleura y peritoneo.
Estos sntomas varan segn la distribucin de los tubrculos en el cuerpo pero, con pocas excepciones, el curso
de la enfermedad es crnico. En muchos casos faltan sntomas caractersticos, incluso en fases avanzadas de la
enfermedad cuando estn afectados muchos rganos. La implicacin de los pulmones puede originar tos, que se
puede inducir por cambios de temperatura o por presin manual sobre la trquea.
La disnea y otros sntomas de neumona de grado bajo tambin evidencian la disfuncin pulmonar. En casos
avanzados, los ganglios linfticos a menudo estn muy dilatados y pueden obstruir las vas respiratorias, el tracto
alimentario los vasos sanguneos. Los ganglios linfticos de la cabeza y del cuello pueden llegar a estar
afectados a simple vista y a veces se rompen y drenan. La implicacin del tracto digestivo se manifiesta por la
presencia de diarreas intermitentes y, en algunos casos, por estreimiento. En las fases terminales de la
tuberculosis puede presentarse una extenuacin extrema y dolor respiratorio agudo. Pueden observarse lesiones
en el tracto genital femenino. Los genitales masculinos raramente estn implicados.
En las necropsias, los tubrculos se ven con ms frecuencia en los ganglios linfticos bronquiales, mediastnicos,
craneales y portales, que pueden ser el nico tejido infectado. Adems se suelen ver afectados los pulmones, el
hgado, el bazo y las superficies de las cavidades del cuerpo. Otros lugares anatmicos se pueden considerar
como potencialmente infectables.
En las necropsias, un granuloma tuberculoso suele presentar un aspecto amarillento y consistencia caseosa,
caseo-calcrea o calcificada. Ocasionalmente pueden ser purulentos. Existen algunos granulomas no
tuberculosos en los que el contenido purulento verdoso est reemplazado por tejido granuloso, que pueden tener
similitud con los granulomas tuberculosos. Normalmente, el centro caseoso es seco, firme, y est cubierto con
una cpsula fibrosa conjuntiva de grosor variable. Los tejidos fijados de un tubrculo no se extraen intactos con
facilidad, como ocurre con algunos granulomas no tuberculosos. El tamao de las lesiones vara, desde tan
pequeas que pueden pasar desapercibidas a simple vista, hasta ocupar gran parte de un rgano. El corte
seriado de rganos y tejidos resulta vital para detectar las lesiones contenidas en un tejido.
En la mayor parte de los pases donde se han caracterizado las micobacterias aisladas de humanos, se ha
identificado a Mycobacterium bovis en el hombre. La frecuencia de la tuberculosis pulmonar causada por M.
bovis es mayor en trabajadores de granjas y mataderos que en habitantes de zonas urbanas. La transmisin de
M. bovis al hombre por la leche o sus productos se elimina mediante la pasteurizacin de la leche. Uno de los
resultados de los programas de erradicacin de la tuberculosis bovina ha sido un descenso en los casos de
enfermedad y de muerte causados por la tuberculosis bovina en la poblacin humana.
La tuberculosis bovina en animales salvajes se describi por primera vez en 1929 en Sudfrica en el kudu
(Tragelaphus strepsiceros) y en el duiker (Sylvicapra grimmi). Durante los 1940s se encontr que el kudu en la
misma regin estaba infectado endmicamente. En Uganda se detect en 1982 una prevalencia del 10% en el
bfalo africano y del 9% en el cerdo verrucoso (Phacochoerus aethiopicus). En Zambia se ha descrito infeccin
por M. bovis del kafue lechue (Kobus leche kafuensis) y de un eland (Traurotragus oryx). En Kenia se ha descrito
un brote de tuberculosis en los babuinos verdosos salvajes (Papio cycocephalus anubis). Tambin se ha
diagnosticado una infeccin por Mycobacterium bovis en el bfalo africano del Parque Nacional Kruger de
Sudfrica (3) y, ms recientemente, se ha encontrado distribuida por otras especies como el babuino chacma
(Papio ursinus), el len (Panthera leo) y el guepardo (Acynonyx jubatus), as como el kudu.
Se ha aislado Mycobacterium bovis de crvidos en granjas y en vida libre. La enfermedad puede ser subaguda o
crnica, con una velocidad de progresin variable. Unos cuantos animales pueden afectarse gravemente en
pocos meses, mientras que otros pueden tardar aos en mostrar sntomas clnicos relacionados con las lesiones.
Las lesiones que se producen pueden parecerse a las del ganado vacuno (granuloma proliferativo, caseificacin,
granulacin y calcificacin con la edad) y pueden tomar la forma de abcesos de paredes finas con escasa
calcificacin y que contienen material purulento. En los crvidos, cuando se observan lesiones con abscesos de
etiologa desconocida se debe considerar la posibilidad de tuberculosis. Los ganglios linfticos afectados son, por
lo general, los de la cabeza y el pecho. Pueden estar afectados los ganglios linfticos mesentricos y
encontrarse grandes abscesos en este lugar. La distribucin de las lesiones depende de la dosis infectiva, de la
ruta de infeccin y del perodo de incubacin antes del examen.
La prueba de la tuberculina se puede utilizar en granjas con ciervos. La prueba debe realizarse con mucho
cuidado, con corte de pelo en el sitio de la prueba, inyeccin intradrmica precisa, y medida exacta de la anchura
de la piel pre- y post-inoculacin, utilizando calibradores para obtener resultados que sean vlidos (5).
Mycobacterium bovis puede originar graves prdidas econmicas por sus efectos sobre el ganado domstico y
las infecciones zoonticas. Adems, la presencia de la infeccin en las poblaciones salvajes supone un reto para
la supervivencia de especies salvajes en peligro.
B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
En el ganado vacuno no hay evidencia clnica de la tuberculosis hasta que se han desarrollado lesiones muy
extensas. Por esta razn, no fueron posibles ni su diagnstico en animales individuales ni un programa de
erradicacin antes del desarrollo de la tuberculina por Koch en 1890. La tuberculina, que representa un medio de
detectar la enfermedad, es un concentrado estril de filtrados de cultivo del bacilo tuberculoso cultivados en
caldo de carne con glicerina y, ms recientemente, en medios sintticos.
Se estn estudiando las respuestas inmunolgicas a las infecciones del ganado por M. bovis para desarrollar
mtodos de diagnstico mejorados o alternativos, ya que, a veces, las pruebas cutneas presentan
inconvenientes prcticos. Sin embargo, no existe una prueba sangunea para la tuberculosis en el ganado u otros
animales que sea de aceptacin universal.
La presencia de M. bovis en las muestras clnicas y en las obtenidas post-mortem puede demostrarse mediante
el examen de frotis teidos, y tal presencia puede confirmarse cultivando el microorganismo en un medio para el
aislamiento primario. Los recipientes de las muestras deben estar limpios y con preferencia estriles (el uso de
recipientes contaminados con micobacterias ambientales puede ocasionar errores en la identificacin de la
infeccin por M. bovis debido al rpido crecimiento de las micobacterias ambientales); cuando es posible, pueden
usarse recipientes de plstico de un solo uso de 50 ml de capacidad para una gran variedad de tipos de
muestras. Las muestras para enviar al laboratorio deben protegerse y cerrarse para evitar prdidas, y embalarse
adecuadamente para resistir roturas o aplastamientos durante el trnsito. Para el envo de muestras
sospechosas de una enfermedad zoontica deben seguirse las Regulaciones para Productos Peligrosos (DGR)
de la Asociacin Internacional de Transporte Areo (IATA). Los requisitos se resumen en el Captulo I.1.1.
Mtodos de muestreo. La entrega rpida de las muestras al laboratorio aumenta las posibilidades de recuperar
M. bovis en cultivo, pero si se prevn retrasos las muestran se deben refrigerar o congelar para retrasar en
crecimiento de contaminantes y conservar las micobacterias. En condiciones de ambientes clidos, cuando no es
posible la refrigeracin, se puede aadir como agente bacteriosttico cido brico (concentracin final de 0,5%
[p/v]), pero solo por perodos limitados, inferiores a 1 semana.
Deben tomarse precauciones para evitar la infeccin de personal del laboratorio (ver Captulo I.1.6. Seguridad
humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa). Todos los procedimientos que supongan cultivos
deben realizarse en una cabina de seguridad biolgica.
a) Examen microscpico
Mycobacterium bovis se puede demostrar microscpicamente en frotis directos de muestras clnicas y en
materiales tisulares preparados. La resistencia al cido de M. bovis se suele demostrar con la tincin clsica
de Ziehl-Neelsen, aunque tambin puede utilizarse una tincin fluorescente de resistencia al cido.
Tambin pueden dar resultados satisfactorios las tcnicas con inmunoperoxidasa. El diagnstico preliminar
de micobacteriosis se puede hacer si el tejido muestra lesiones histolgicas caractersticas (necrosis
caseosa, mineralizacin, clulas epitelioides, clulas gigantes multinucleadas y macrfagos). La presencia
en secciones histolgicas de microorganismos cido-resistentes puede no detectarse aunque M. bovis se
pueda aislar del cultivo.
Para el aislamiento primario, el sedimento se inocula por lo general en varios medios slidos con huevo
como el de Lowestein-Jensen, el medio base de Coletsos o el medio de Stonebrinks; estos medios deben
contener piruvato o glicerol, o ambos. Tambin se debera utilizar un medio con agar como el de
Middlebrook 7H10 7H11.
Los cultivos se incuban durante 8 semanas a 37C con y sin CO2. Se deben utilizar los medios en tubos con
cierre hermtico, para evitar la desecacin. Los cultivos se examinan a intervalos durante el perodo de
incubacin para observar el posible crecimiento macroscpico. Cuando el crecimiento es visible, se
preparan frotis y se tien por la tcnica de Ziehl-Neelsen. Generalmente, el crecimiento de M. bovis se
aprecia a las 3-6 semanas de incubacin. Mycobacterium bovis crece en medio de Lowenstein-Jensen sin
piruvato, y crece peor cuando se aade glicerol. Los modelos caractersticos de crecimiento y de morfologa
de las colonias pueden suministrar un diagnstico preliminar de M. bovis , que puede confirmarse por la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y por tcnicas de tipado molecular como el tipado por el estudio
de polimorfismos de la regin de repeticiones directas.
Si se produce una contaminacin fuerte del medio de cultivo, o la muestra presenta un resultado de cultivo
negativo y un resultado macroscpico e histopatolgico positivo, el proceso para el cultivo debe repetirse
utilizando el inculo con descontaminacin adicional. A menudo, el factor limitante para el aislamiento es la
baja calidad de las muestras y deben hacerse esfuerzos para asegurar que el laboratorio reciba muestras
de buena calidad.
El crecimiento que se considera debido a micobacterias se subcultiva en un medio con huevo o con agar o
en caldo con Tween y albmina, y se incuba hasta la aparicin de un crecimiento visible. En algunos
laboratorios se utiliza bilis de buey antes de la inoculacin para facilitar la dispersin de la masa microbiana
en pequeas unidades viables.
Es necesario distinguir M. bovis de otros miembros del "complejo tuberculosis", es decir, M. tuberculosis (la
principal causa de tuberculosis en humanos), M. africanum (que ocupa una posicin fenotpica intermedia
entre M. tuberculosis y M. bovis ), y M. microti (el "bacilo de ratn", un micro-organismo difcil de encontrar).
Las pruebas mencionadas arriba sirven para separar M. bovis de las otras especies.
A veces se puede aislar M. avium de lesiones del ganado bovino similares a las de la tuberculosis. En tales
casos se necesita una cuidadosa identificacin y se debera excluir la posibilidad de una infeccin mixta con
M. bovis . Mycobacterium tuberculosis puede sensibilizar al ganado para la tuberculina bovina sin causar
lesiones tuberculosas.
es la contaminacin cruzada, por lo que se deben utilizar controles adecuados en cada amplificacin. Este
tipo de aplicacin ha sido ignorada. Normalmente se llevan a cabo algunas pruebas bioqumicas para
confirmar el hallazgo. No obstante, la PCR se utiliza hoy en da de modo rutinario para detectar el grupo
M. tuberculosis y distinguirlo de M. avium en tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina (23, 24).
Los mejores resultados se obtienen cuando se emplean tanto la PCR como los mtodos de aislamiento.
Para diferenciar M. bovis de otros miembros del complejo de M. tuberculosis, las tcnicas de anlisis de
ADN pueden ser ms rpidas y fiables que los mtodos bioqumicos. Se ha encontrado una mutacin
especfica de M. bovis en el nucletido en posicin 285 del gen OxyR en todos los aislamientos del
complejo de M. tuberculosis analizados hasta la fecha (10). Tiene importancia prctica el que la sonda
especfica para hibridar con el gen, que se necesita para visualizar el segmento amplificado, se pueda
marcar con biotina o digoxigenina en vez de con istopos.
La determinacin de las huellas genticas permite a los laboratorios distinguir entre cepas diferentes de
M. bovis y harn posible establecer el origen, la transmisin y la distribucin del M. bovis descrito. El
mtodo ms utilizado es el del estudio de polimorfismos de la regin de repeticiones directas
(espoligotipado, del ingls "spacer oligotyping"), que diferencia cepas dentro de cada especie perteneciente
al complejo de M. tuberculosis, que incluye M. bovis , y que puede distinguir tambin M. bovis de M.
tuberculosis (19). Se estan desarrollando otras tcnicas nuevas para diferenciar ms exactamente las
cepas que tienen el mismo espoligotipado. stas incluyen el anlisis del polimorfismo de los fragmentos de
restriccin (RFLP) usando IS6110, la regin de repeticin directa (DR) y la sonda PGRS (secuencia de
repeticin poliG) (30), la RFLP utilizando una combinacin de la DR y sondas de color (26), y la
caracterizacin del perfil VNTR (repeticiones en tndem en nmero variable) (8, 9, 13, 20). En la actualidad
se est secuenciando el genoma de M. bovis , y esta informacin permitir la mejora de los mtodos
basados en las huellas genticas.
Antes se utilizaba tuberculina de medio sinttico concentrada por calor (HCSM), pero en la mayora de los
pases la tuberculina HCSM se ha reemplazado por tuberculina derivada de protenas purificadas (PPD). La
tuberculina HCSM puede tener una buena potencia si se estandariza de modo correcto en cuanto a
actividad biolgica, pero su especificidad es inferior a las tuberculinas PPD. Adems, se ha visto que las
PPDs bovinas preparadas de la cepa AN5 de produccin de M. bovis son ms especficas para detectar la
tuberculosis bovina que las PPDs humanas preparadas con M. tuberculosis.
No se recomienda utilizar esta prueba cuando la epidemiologa sugiere que la poblacin o el animal han
estado en contacto con animales infectados, pues puede originar respuestas negativas falsas y un
descenso en la sensibilidad de la prueba. Si slo se utiliza una prueba de tuberculina, la erradicacin
completa resulta difcil ya que puede haber respuestas falsas negativas en la fase inicial de la enfermedad y
en animales con infeccin grave.
La prueba intradrmica comparativa de la tuberculina se utiliza para diferenciar entre animales infectados
con M. bovis y aquellos sensibilizados a la tuberculina bovina por exposicin a otras micobacterias. Esta
sensibilizacin se debe a la gran reactividad cruzada existente entre especies de micobacterias y gneros
relacionados. La prueba consta de la inyeccin intradrmica de tuberculina bovina y de tuberculina aviar en
sitios diferentes, por lo general, en el mismo lado del cuello, y la medida de la respuesta 3 das despus.
La potencia de las tuberculinas debe estimarse por mtodos biolgicos mediante comparacin con
tuberculinas estndar y debe expresarse en unidades internacionales (UI). En varios pases se considera
que la tuberculina tiene una potencia adecuada si garantiza al menos 2000 UI (+ 25%) por dosis en el
ganado bovino. En los animales con una sensibilidad alrgica reducida se necesita una dosis mayor de
tuberculina, y en campaas nacionales de erradicacin se recomiendan dosis de hasta 5.000 UI. El
volumen de cada inyeccin no debe superar los 0,2 ml.
Procedimiento de la prueba
i) Es importante una tcnica de inyeccin correcta. Deben afeitarse y limpiarse los sitios de inyeccin.
Dentro de cada rea afeitada se mide un pliegue de la piel con calibradores y se marca el sitio antes
de la inyeccin. Se inserta oblicuamente en las capas ms profundas de la piel una aguja corta con el
bisel hacia fuera y una jeringuilla graduada cargada con tuberculina. Se inyecta la dosis de
tuberculina, que no debe contener menos de 2.000 UI de tuberculina bovina o aviar. Una inyeccin
correcta se confirma palpando una pequea hinchazn como un guisante en el lugar de la inyeccin.
La distancia entre dos inyecciones debe ser aproximadamente de 12-15 cm. En animales jvenes
donde no hay espacio para separar suficientemente los sitios en un lado del cuello, se debe hacer una
inyeccin a cada lado en zonas idnticas del centro del tercio medio del cuello. Setenta y dos horas
despus se mide el grosor de la piel doblada en cada sitio de inyeccin. La medida de la piel, antes de
la inyeccin y cuando se lee la prueba, debera efectuarse por la misma persona.
ii) La interpretacin se basa en la observacin y en los incrementos en el grosor de la piel anotados. En
la prueba intradrmica simple (que implica una sola inyeccin de tuberculina bovina), se considera que
la prueba es negativa si slo se observa una inflamacin limitada, con un incremento menor de 2 mm
y sin sntomas clnicos, del tipo de edema difuso o extendido, exudado, necrosis, dolor o inflamacin
de los vasos linfticos de esa regin o de los ganglios linfticos. La reaccin no es concluyente si no
se observa ninguno de estos sntomas y, si el incremento en el pliegue de la piel oscila entre 2 y
4 mm. La reaccin es positiva si se observan los sntomas clnicos descritos arriba o si hay un
aumento de 4 mm o ms en el grosor de la piel. Sin embargo, en poblaciones infectadas por M. bovis ,
cualquier inflamacin palpable o visible debe considerarse positiva. A veces se emplea una
interpretacin ms rigurosa, en particular en poblaciones de alto riesgo o en animales en contacto. Los
animales con resultados no concluyentes por una prueba intradrmica sencilla deben someterse a otra
prueba tras un intervalo de 42 das. Los animales que no son negativos en esta segunda prueba
deben ser considerados positivos. Los animales positivos en la prueba intradrmica sencilla pueden
someterse a una prueba intradrmica comparativa. La repeticin de las pruebas se puede realizar
conforme a los programas nacionales o locales de control.
iii) En la interpretacin de la prueba intradrmica comparativa, se considera positiva la reaccin, si el
aumento del grosor de la piel en el sitio de la inyeccin bovina supera en 4 mm o ms la reaccin en el
sitio de la inyeccin aviar. La reaccin no es concluyente, si el incremento comparativo est entre 1 y
4 mm, y se considera negativa, si el incremento del grosor de la piel en el sitio de la inyeccin bovina
es menor o igual que el observado en el sitio de la inyeccin aviar. Este esquema de interpretacin se
utiliza en los pases de la Unin Europea (EU) y se recomienda en la Directiva del Consejo
64/432/ECC (11). A veces se utiliza una interpretacin ms rigurosa.
iv) En la prueba de la cola, se inserta oblicuamente en las capas ms profundas de la piel una aguja corta
con el bisel hacia fuera, en la cara lateral del pliegue de la cola, a medio camino entre la lnea del pelo
y la cara ventral del pliegue. La interpretacin estndar es que cualquier cambio palpable o visible se
considera una reaccin. Tambin se emplea una interpretacin modificada: una prueba positiva es
cualquier inflamacin palpable o visible en el sitio de la inyeccin que tenga un aumento diferencial de
grosor de 4 mm en comparacin con el pliegue caudal opuesto. Si un animal tiene slo un pliegue
caudal, se considera que la prueba es positiva si el grosor del pliegue caudal es de 8 mm o ms.
M. bovis (14). La prueba es relativamente cara y todava no se ha sometido a comparaciones entre distintos
laboratorios.
c) Enzimoinmunoensayo
Ha habido numerosos intentos fallidos para desarrollar pruebas serodiagnsticas de utilidad clnica para la
tuberculosis. Las pruebas ELISA parecen la mejor eleccin y pueden ser un complemento, ms que una
alternativa, a las pruebas basadas en la inmunidad celular. Pueden ser tiles en ganado anrgico y en
ciervos. Una ventaja es su simplicidad, pero su especificidad y sensibilidad son limitadas en el ganado,
debido principalmente al desarrollo tardo e irregular de la respuesta inmune humoral durante la
enfermedad. Sin embargo, la respuesta de anticuerpos en el ciervo parece desarrollarse antes y de modo
ms previsible, y se ha descrito que la sensibilidad de un ELISA comparativo puede ser de hasta el 85%
(15). Es posible su mejora utilizando diferentes antgenos, como protenas (por ejemplo, MPB 70, que es
muy especfica pero carece de sensibilidad). Adems, se ha descrito en animales infectados por M. bovis
un incremento anamnsico, lo que origina mejores resultados en ELISA 2-8 semanas despus de una
prueba normal de tuberculina cutnea. Tambin se ha demostrado que una comparacin entre los niveles
de anticuerpos contra PPD-B y PPD-A es til para aumentar la especificidad en ELISA (15). El ELISA
tambin puede resultar de utilidad para detectar infecciones por M. bovis en animales salvajes. En Nueva
Zelanda se ha aprobado como una prueba de apoyo paralelo en granjas de ciervos y se realiza 13-33 das
despus de la prueba cutnea en la mitad del cuello.
Las directrices para la produccin de vacunas veterinarias se presentan en el Captulo I.1.7. Principios de
produccin de vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en el Captulo I.1.7 son de carcter general y se
pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales.
Las tuberculinas eran preparaciones realizadas de los productos tratados por calor del crecimiento y lisis de
M. tuberculosis o de M. bovis (conocidas respectivamente como tuberculinas humanas y bovinas). Al principio, el
medio de cultivo utilizado para su produccin fue caldo de glicerol. En la dcada de 1940, las "tuberculinas de
medio sinttico concentradas por calor " o tuberculinas HCSM, preparadas de cultivos en medios lquidos
sintticos, reemplazaron a las "antiguas" tuberculinas. En la actualidad, tanto las antiguas tuberculinas como las
tuberculinas HCSM se han reemplazado, casi por entero, con los derivados de protenas purificadas o PPD.
Produccin de tuberculina
b) Mtodo de cultivo
Si el inculo del cultivo se cultiv en medio slido, es necesario adaptar el microorganismo a crecer en
cultivo de flotacin (por ejemplo, incorporando un trozo de patata estril en los cultivos con medio lquido,
como el medio de Watson Reid). Cuando el cultivo se ha adaptado al medio lquido, se puede utilizar para
producir el lote de inculo primario, que se conserva en forma liofilizada. ste se utiliza para inocular
medios para la produccin de lotes de inculos secundarios, que no deben de tener ms de cuatro pases
en cultivo del inculo primario. El inculo secundario se utiliza para inocular los cultivos de produccin (1,
17).
El substrato del cultivo de produccin debe ser capaz de originar un producto adaptado a los estndares
internacionales reconocidos (Organizacin Mundial de la Salud [OMS], Farmacopea Europea, u otra
autoridad reconocida de control). Debe estar libre de ingredientes txicos o que causen reacciones
alrgicas.
c) Validacin
Las cepas de M. bovis utilizadas como inculos de siembra deben estar libres de
microorganismos contaminantes.
Los lotes de inculo deben ser eficaces en cuanto a produccin de tuberculina con potencia suficiente. Las
pruebas necesarias se describen ms adelante en la Seccin C.4.
2. Mtodo de produccin
El microorganismo se cultiva en un medio sinttico, la protena del filtrado se precipita qumicamente (empleando
sulfato amnico o cido tricloroactico [TCA]), se lava y se resuspende. Se recomienda tuberculina PPD, porque
se puede estandarizar de modo ms preciso.
Se puede aadir como conservante un antimicrobiano que no origine reacciones falsas positivas, como el fenol
(no ms de 0,5% [p/v]). Como estabilizador se puede aadir glicerol (no ms del 10% [p/v]) o glucosa (2,2%
[p/v]). No se deben emplear derivados mercuriales. El producto se distribuye aspticamente en recipientes
estriles de vidrio neutro, que se cierran para evitar contaminacin. El producto se puede liofilizar.
3. Control interno
Los matraces de produccin, inoculados con cultivos de siembra adecuados, se incuban por un perodo
apropiado. Cualquier matraz con contaminacin o con crecimiento anormal debe eliminarse despus de
autoclavarlo.
En las tuberculinas PPD, el pH del precipitado disuelto (la llamada tuberculina concentrada) debe ser 6,6-6,7.
El nivel de protena del concentrado de PPD se determina por el mtodo Kjeldahl o cualquier otro mtodo
adecuado. Se suele comparar el nitrgeno total y el nitrgeno precipitable por TCA.
El producto final debe someterse a bioensayos en cobayas. Se deben realizar pruebas de potencia y
especificidad en comparacin con una tuberculina de referencia (PPD). Segn el contenido en protena y la
concentracin final requerida, se hacen diluciones con un tampn, normalmente a 1,0 mg/ml (1, 17).
4. Control de lotes
Las muestras deben cumplir los estndares reconocidos oficialmente para la produccin de tuberculina tal como
se indican en la Farmacopea Europea o en las normas reguladoras equivalentes.
a) Esterilidad
Generalmente, las pruebas de esterilidad se realizan conforme a directrices internacionales (ver tambin
Captulo I.1.5).
b) Inocuidad
Dos cobayas, con peso individual superior a 250 g, que no hayan sido tratados previamente con material
que interfiera con la prueba, se inyectan subcutneamente con 0,5 ml de la tuberculina de prueba. No
deben presentarse efectos anormales en 7 das.
Las pruebas sobre tuberculina para micobacterias vivas se pueden realizar sobre la tuberculina
inmediatamente antes de distribuirla en los recipientes finales o en muestras tomadas de los mismos
recipientes finales. Se debe tomar una muestra de por lo menos 10 ml e inyectarla intraperitonealmente en
al menos dos cobayas, dividiendo la dosis entre ellos. Se aconseja tomar una muestra mayor, como por
ejemplo 50 ml, y concentrar cualquier micobacteria residual por centrifugacin o filtracin en membrana. Se
observan los cobayas durante al menos 42 das y despus se examinan macroscpicamente post-mortem.
Se examina cualquier lesin microscpicamente y mediante cultivo.
c) Efecto sensibilizador
Para probar el efecto sensibilizador, se toman tres cobayas que no se hayan tratado previamente con
material que interfiera con la prueba y se inyectan intradrmicamente en tres ocasiones, cada vez con 0,1ml
que contiene el equivalente de 500 UI de la preparacin ensayada. A los 15-21 das despus de la tercera
inyeccin cada cobaya, junto con cada uno de tres cobayas control que no se han inyectado antes, se
inyecta con la misma dosis de la misma tuberculina. Las reacciones en los dos grupos de cobayas no
deben diferir significativamente cuando se observan 24-28 horas ms tarde.
d) Potencia
La potencia se determina por comparacin con una preparacin de referencia de tuberculina bovina en
cobayas sensibilizados con M. bovis .
En la dcada de los 1970s, los pases de la entonces denominada Comunidad Econmica Europea (EEC,
ahora la EU) establecieron un estndar para las tuberculinas HCSM bovinas. Este estndar de la EEC para
la HCSM tiene una potencia de 65.000 unidades provisionales de tuberculina de la Comunidad por ml.
En los aos 1960s, la EEC reconoci un estndar de la ECC para PPD bovina, a la que se adjudic una
potencia de 50.000 unidades provisionales de tuberculina de la Comunidad por mg de PPD y que fue
distribuida en estado liofilizado. Por desgracia, el nmero de ampollas de lifilos no fue suficiente para las
necesidades de la OMS y se decidi por tanto producir una nueva preparacin de PPD bovina que pudiera
designarse por la OMS como el nuevo estndar internacional para las tuberculinas PPD bovinas.
Este nuevo estndar de PPD bovina tuvo que calibrarse frente al estndar existente en la ECC. Mediante
ensayos de colaboracin internacional, con cobayas y ganado bovino, se comprob que el nuevo estndar
bovino tena una potencia relativa de 65% frente al estndar de la ECC. Por tanto, en 1986, la OMS dio
oficialmente al estndar internacional para las tuberculinas PPD bovinas un valor de 32.500 UI/mg. Esto
significa que las unidades provisionales de tuberculina de la Comunidad son equivalentes con las IUs. La
Farmacopea Europea tambin ha reconocido el estndar internacional de la OMS para PPD bovina.
Para mantener el stock del estndar internacional actual, es deseable que los pases productores de
tuberculina PPD bovina establezcan sus propias preparaciones nacionales de referencia para PPD bovina
como estndares de referencia. Estas preparaciones nacionales de referencia deben calibrarse frente al
estndar oficial internacional de PPD bovina, en cobayas y en ganado bovino (22, 28, 32).
Estandarizacin en cobayas
Una prueba de potencia adecuada es la siguiente: En cobayas con sensibilizacin homloga, se
bioensayan las tuberculinas PPD producidas frente al estndar de la tuberculina PPD bovina mediante una
prueba de seis puntos, con tres diluciones seriadas de 1/5 por cada tuberculina. Las diluciones de las
preparaciones de tuberculina se realizan en solucin tampn isotnica que contiene 0,0005% (p/v) de
polisorbato 80 (Tween 80). Se escogen volmenes con 0,001. 0,0002 y 0,00004 mg de tuberculoprotena,
que corresponden a 32, 6,4 y 1,28 UI, respectivamente, del estndar internacional de PPD, porque estas
cantidades dan buenas reacciones cutneas, fciles de determinar y con lmites aceptables. El volumen
inyectado es 0,2 ml. En una prueba, se comparan dos tuberculinas ensayadas con la tuberculina estndar
en nueve cobayas, aplicando ocho inyecciones intradrmicas por animal y empleando un diseo equilibrado
incompleto de cuadro latino (12).
Los cobayas se sensibilizan 5-7 semanas antes del ensayo con una dosis baja de bacilos vivos (0,001 o
0,0001 mg de peso hmedo) de una cepa virulenta de M. bovis (1 mg de peso hmedo). Los bacilos se
suspenden en solucin salina fisiolgica y se realiza una inyeccin intramuscular profunda de 1 ml en la
parte media del muslo. Al tiempo de la prueba, los cobayas infectados con la dosis baja de M. bovis deben
estar an en buenas condiciones de salud y los resultados de numerosos exmenes post-mortem, poco
despus de los ensayos de estandarizacin, deberan mostrar que los cobayas no sufren tuberculosis y por
lo tanto no excretan bacilos tuberculosos.
Se puede utilizar una prueba alternativa de potencia, menos fiable, que no usa micobacterias patgenas
vivas y que es ms adecuada para laboratorios que carecen de reas de aislamiento para el mantenimiento
seguro de los cobayas infectados. Esta prueba de potencia de la tuberculina se realiza as: la tuberculina
PPD se bioensaya, en cobayas con sensibilizacin homloga, frente al estndar de la tuberculina PPD
bovina mediante una prueba de ocho puntos que comprende cuatro diluciones de 20, 10, 5 y 2,5 UI. El
volumen inyectado es 0,1 ml. En esta prueba, se comparan dos tuberculinas ensayadas con la tuberculina
estndar en ocho cobayas, aplicando ocho inyecciones intradrmicas por animal y empleando un diseo de
cuadro latino. Los cobayas se sensibilizan con bacilos inactivados de M. bovis 5-7 semanas antes del
ensayo. Los bacilos se suspenden en tampn y se preparan como una emulsin con adyuvante incompleto
de Freund. Se realiza una inyeccin intramuscular profunda en la parte media del muslo, usando una dosis
de 0,5 ml.
Normalmente, la lectura de las pruebas se realiza 24 horas despus de la inyeccin de las tuberculinas,
pero se puede hacer una segunda lectura adicional a las 42 horas. Se miden los diferentes dimetros de los
eritremas en milmetros con calibradores, y se registran en hojas de datos. Los resultados se evalan
estadsticamente por mtodos estadsticos estndar para ensayos en paralelo segn Finney (12). Se
calculan las potencias relativas de las dos tuberculinas ensayadas con sus lmites de confianza del 95%, las
pendientes de las curvas de log de la dosis versus respuesta para cada preparacin (aumento medio de
reaccin por aumento de unidad log de la dosis) y los cocientes F para las desviaciones del paralelismo.
Se acuerdo con la Farmacopea Europea, la potencia estimada para las tuberculinas bovinas debe de estar
entre el 66% y el 150% de la potencia indicada en el prospecto.
Una prueba adecuada de potencia para las tuberculinas bovinas en ganado se realiza del modo siguiente:
Las tuberculinas de ensayo se prueban frente a un estndar de tuberculina PPD bovina mediante una
prueba de cuatro puntos usando dos diluciones seriadas de 1/5 para cada tuberculina. Para el estndar se
inyectan 0,1 y 0,02 mg de tuberculoprotena que se corresponden con 3.250 y 650 UI del estndar
internacional de tuberculina PPD bovina. Las tuberculinas de ensayo se diluyen de modo que se apliquen
las mismas cantidades de protena. El volumen inyectado es 0,1 ml y la distancia entre los sitios de
inyeccin en el rea media cervical es de 15-20 cm. En una prueba, se comparan tres tuberculinas de
ensayo con la tuberculina estndar en ocho cabezas de ganado tuberculoso, aplicando por animal ocho
inyecciones intradrmicas a ambos lados del cuello y empleando un diseo equilibrado completo de cuadro
latino. Antes de la inyeccin y 72 horas despus, se mide el grosor de la piel en cada sitio inyectado con
calibradores en dcimas de milmetro tan exactamente como sea posible.
Los resultados se analizan estadsticamente utilizando los mismos mtodos estndar para ensayos en
paralelo que los empleados en pruebas de potencia con cobayas.
e) Especificidad
Un ensayo adecuado de especificidad es el siguiente: en cobayas con sensibilizacin heterloga, se
prueban tres tuberculinas bovinas de ensayo con el estndar de la tuberculina PPD aviar (o tres
tuberculinas aviares de ensayo frente al estndar de la tuberculina PPD bovina) mediante una prueba de
cuatro puntos, con dos diluciones seriadas de 1/25 de cada tuberculina. Se escogen cantidades de 0,03 y
0,0012 mg de tuberculoprotena de ensayo, que corresponden a 1500 y 60 UI, porque estas dosis dan
buenas reacciones cutneas y de fcil lectura. Las dosis de inyeccin del estndar son ms bajas, 0,001 y
0,0004 mg. En una prueba, se comparan tres tuberculinas con la tuberculina estndar en ocho cobayas
mediante ocho inyecciones intradrmicas por animal, empleando un diseo equilibrado completo de cuadro
latino. La lectura de los resultados y el tratamiento estadstico es igual que en la prueba de potencia.
f) Estabilidad
Siempre que las tuberculinas cumplan con las normas legislativas en cuanto a produccin y se guarden
protegidas de la luz a una temperatura entre 2C y 8C, pueden utilizarse hasta la fecha de caducidad que
se especifica en el permiso para la produccin de tuberculina. Para el almacenamiento a largo plazo, se
recomienda mantener la PPD en forma concentrada en vez de diluida, y el concentrado tambin debe
mantenerse en la obscuridad.
g) Control de pH
El pH debe estar entre 6,5 y 7,5.
h) Contenido en protena
El contenido proteico se determina como se indica en la Seccin C.3. Control interno.
i) Almacenamiento
Durante el almacenamiento, la tuberculina bovina lquida debe protegerse de la luz y mantenerse a una
temperatura de 5+3C. Las preparaciones liofilizadas pueden mantenerse a temperaturas ms elevadas
(pero sin exceder los 25C) y protegidas de la luz. Deben reducirse al mnimo las exposiciones a
temperaturas superiores y a la luz solar directa.
j) Conservantes
Se debe demostrar que los conservantes antimicrobianos u otras substancias que pueden aadirse a las
tuberculinas no afectan a la seguridad y eficacia del producto.
La mxima concentracin permitida para el fenol es 0,5% (p/v), y para el glicerol es 10% (v/v).
k) Precauciones (riesgos)
La experiencia con humanos y con animales ha llevado a la observacin de que la tuberculina diluida de
modo apropiado, inyectada intradrmicamente, origina una reaccin localizada en el sitio de la inyeccin sin
manifestaciones generalizadas. Incluso en individuos muy sensibles, las reacciones generalizadas graves
son extremadamente raras. Pero la experiencia ha demostrado que un operador con hipersensibilidad
puede adquirir sntomas generalizados graves por contacto intradrmico accidental (herida por picadura de
aguja) con tuberculina bovina. Estos individuos no deberan realizar la prueba cutnea de la tuberculosis
con la dosis alta de 2000-5000 UI de tuberculina, que es unas 1000 veces la dosis humana normal de 5 UI.
a) Inocuidad
Se debe realizar una prueba para la ausencia de propiedades txicas o irritantes (ver Seccin C.4.b.)
b) Potencia
La potencia de la tuberculina debe determinarse por mtodos biolgicos. Estos mtodos deben utilizarse
para las tuberculinas HCSM y PPD; se basan en la comparacin de las tuberculinas a ensayar con una
preparacin estndar de referencia de tuberculina del mismo tipo (ver tambin Seccin C.4.d.).
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*
**
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Tuberculosis bovina (ver Cuadro en la parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consultar la pgina web de la OIE para una lista actualizada:
www.oie.int)