esterilizacin
D. Carlos Mingo Pascual
LA ESTERILIZACIN FCIL, SEGURA,
PRECISA, REPRODUCIBLE Y VALIDABLE
E
l proceso de esterilizacin en auto-
clave puede resultar difcil en algu-
nas ocasiones. Por ejemplo, cuando
esterilizamos lquidos o slidos (instrumen-
tacin, vidrio, filtros o textiles) para su pos-
terior uso en el laboratorio, el proceso de
esterilizacin debe asegurar la esterilizacin
del producto, siempre reproducible. En los
productos esterilizados para su uso en la-
boratorio no se puede testar la esterilidad
a posteriori, ya que dicho test podra con-
taminar de nuevo el producto, impidiendo
Figura 1. Proceso de esterilizacin / Fases. Lnea azul: Temperatura en el interior de la cmara del
autoclave (recipiente a presin). Lnea roja: temperatura medida en el interior del lquido.
2 NOVIEMBRE/DICIEMBRE15 FARMESPAA INDUSTRIAL
Ldo. en C. Qumicas y Director Comercial de la empresa
Controltecnica
su posterior utilizacin. La validacin de los
procesos se ha convertido en una materia
importante a la hora de asegurar resultados
reproducibles que puedan ser verificados.
Es ms, deben considerarse los aspectos
relativos a la seguridad durante el autocla-
vado, y en particular, cuando se esterilizan
lquidos. Normalmente la esterilizacin se
lleva a cabo a temperaturas de 121C, lo
que corresponde a una presin de vapor
aproximada de 2 bares. Estas altas tempe-
raturas y la consiguiente presin pueden
considerarse un riesgo potencial impor-
tante para el usuario si el autoclave tiene
defectos de diseo o la esterilizacin no se
realiza correctamente.
Esterilizacin de lquidos y lquidos de
desecho en frascos
La esterilizacin de lquidos es una de las
tareas ms demandadas hoy en da en los
laboratorios. Pero este proceso puede
conllevar mucho tiempo, los frascos de-
ben permanecer abiertos o ventilados y
parte del lquido puede llegar a ebullicin
y evaporarse o incluso los frascos pueden
estallar debido a esta ebullicin. Otro pro-
blema a tener en cuenta es saber si el lqui-
do del interior de los frascos ha alcanzado
la temperatura requerida de esterilizacin
(ej. 121C) o cundo debera ser seguro
sacar los frascos del autoclave, una vez
completado el proceso de esterilizacin.
Observando el proceso de esterilizacin
para lquidos, ste se divide en tres fases:
1. Fase de calentamiento hasta alcanzar el
equilibrio (H)
2. Fase de esterilizacin, por ejemplo a
121C durante 20 min.(S)
3. Fase de enfriamiento hasta alcanzar una
temperatura segura para retirar el mate-
rial esterilizado. (C).
La Figura 1 detalla las fases individuales
en forma de grfico. La lnea azul represen-
ta la temperatura registrada en el recipiente
situado en el interior del autoclave; la lnea
roja representa la temperatura registrada
en el lquido. Se puede apreciar claramente
que el recipiente alcanza la temperatura de-
seada mucho ms rpido, mientras que el
lquido que permanece en el interior de los
frascos, necesita ms tiempo para alcanzar
la temperatura de esterilizacin.
Durante la fase de calentamiento, la
energa trmica del vapor se transfiere a los
frascos, lo que conlleva una condensacin
del vapor. Dicho proceso de condensacin
y su consiguiente transferencia trmica re-
quiere de tiempo, explicando as el lapsus
de tiempo que existe entre el calentamien-
to del recipiente y el calentamiento de los
lquidos de su interior. El tiempo requerido
para alcanzar las mismas temperaturas en el
interior y exterior de los frascos se denomi-
na tiempo de equilibrio.
Muchos de los autoclaves utilizados hoy
en da en los laboratorios an no estn equi-
pados con un medidor de temperatura en
un frasco de referencia, por lo que la tem-
peratura exacta del lquido que se quiere
esterilizar no se est midiendo, y no se pue-
de utilizar este dato para regular el proce-
dimiento de esterilizacin. Estos autoclaves
comienzan la fase de esterilizacin una vez
que se ha alcanzado la temperatura en los Figura 2. Medicin de la temperatura.
recipientes, luego no se toma en conside-
racin el lapsus de tiempo existente entre para asegurarnos que se ha alcanzado la temperaturas considerablemente superio-
el calentamiento de los frascos y el calen- temperatura de esterilizacin en el lqui- res a la temperatura de ebullicin (100C).
tamiento del lquido en s. De este modo, do a esterilizar. Pero tambin es necesa- El calor transferido al interior de los lqui-
los lquidos no alcanzarn la temperatura de rio para retirar los vasos del autoclave de dos, junto con el exceso de presin, po-
esterilizacin deseada y en consecuencia, la forma segura una vez finalizado el proceso dra ocasionar considerables peligros para
efectividad biolgica del proceso de esteri- de esterilizacin. En el interior del auto- el usuario. Por ejemplo, podra darse una
lizacin no se podr asegurar. Dependiendo clave, los lquidos se han calentado hasta ebullicin retardada, lo que significa que el
de la resistencia de los microorganismos a lquido empezara a bullir de forma repen-
eliminar, stos se inactivarn slo en parte. tina cuando se abriera el autoclave. Esta
ebullicin instantnea generar una onda
LA NORMA DIN EN
Medicin de la temperatura en un de presin consistente en vapor y lquido
frasco de referencia 61010-2-040 ESTIPULA caliente, erupcionando de los vasos. 1 li-
Midiendo la temperatura del interior de un QUE LOS AUTOCLAVES tro de agua generara 1000 litros de vapor!
frasco de referencia mediante un sensor in- USADOS PARA LA Debido al potencial riesgo de peligro
troducido en el mismo, se puede determi- de explosin de recipientes, los autoclaves
nar la temperatura exacta del lquido que ESTERILIZACIN DE utilizados para la esterilizacin de lquidos
se desea esterilizar y as se podra regular LQUIDOS DEBEN deben estar sujetos a las correspondientes
el proceso de esterilizacin. La esteriliza- ESTAR EQUIPADOS regulaciones y normas. La norma DIN EN
cin en s comenzar slo cuando el lqui- 61010-2-040 estipula que los autoclaves
do del frasco de referencia haya alcanzado
CON DISPOSITIVOS usados para la esterilizacin de lquidos
la temperatura de esterilizacin. DE SEGURIDAD Y deben estar equipados con dispositivos de
El frasco de referencia deber rellenarse PREVENCIN DE seguridad y prevencin de apertura de la
con agua. Es crucial que el tamao y el lle- puerta previa a que los lquidos hayan al-
nado del frasco de referencia se correspon-
APERTURA DE LA canzado la temperatura segura de extrac-
da con el tamao y el frasco ms grande PUERTA PREVIA A cin. Una extraccin segura se define de
y con ms lquido que se quiera esterilizar. QUE LOS LQUIDOS forma estndar cuando la temperatura es
20C inferior a la temperatura de ebullicin
HAYAN ALCANZADO LA
Temperatura de extraccin segura del agua a temperatura y presin atmos-
El sensor de temperatura que mide en el TEMPERATURA SEGURA frica. Esto significa que la extraccin de
interior del vaso de referencia es necesario DE EXTRACCIN seguridad se da a los 80C. Los autoclaves

FARMESPAA INDUSTRIAL NOVIEMBRE/DICIEMBRE15 3

esterilizacin
Figura 3. Enfriamiento con soporte de presin.
modernos estn equipados con bloqueos
de la puerta dependientes de la temperatu-
ra y presin internas. Esto previene la aper-
tura del autoclave cuando la presin an
es alta y los lquidos no han alcanzado la
temperatura segura de extraccin de 80C.
El enfriamiento de los lquidos hasta la
temperatura segura de extraccin puede
conllevar bastante tiempo. Un tamao de
autoclaves utilizado con frecuencia en los
laboratorios es aquel con una capacidad
de recipientes de aproximadamente 150
litros. En este tipo de autoclaves, llenos de
botellas con lquido a esterilizar, el total del
ciclo de esterilizacin podra llevarnos hasta
10 horas. Lo que significara que en un da
de trabajo, no podramos llevar a cabo ms
de una esterilizacin completa. Por ello es
recomendable equipar el autoclave con un
sistema de enfriamiento que reduzca consi-
derablemente el tiempo necesario para es-
terilizar el lote y que prevenga las desventa-
jas de la esterilizacin de lquidos.
Enfriamiento rpido mxima
productividad y seguridad
Los sistemas de re-enfriamiento para au-
toclaves bsicamente distinguen entre dos
tipos de sistemas de refrigeracin:
a. Enfriamiento por evaporacin ebu-
llicin del lquido durante la fase de
enfriamiento
b. Enfriamiento por radiacin calor
irradiado por el lquido, no hay ebu-
llicin del lquido con este sistema de
refrigeracin
4 NOVIEMBRE/DICIEMBRE15 FARMESPAA INDUSTRIAL
Figura 4. Ultracooler.
EL ENFRIAMIENTO
RPIDO CON SOPORTE
DE PRESIN SUPONE
UNA GANANCIA
SUSTANCIAL EN LA
PRODUCTIVIDAD,
YA QUE EL TIEMPO
DEL PROCESO EN
COMPARACIN CON LA
AUTO-REFRIGERACIN
SE REDUCE
CONSIDERABLEMENTE
a) El enfriamiento por evaporacin suele
ser el tipo de enfriamiento ms usado en
los autoclaves. Puede ser:
ww Auto-enfriamiento, liberando vapor
lentamente
ww Enfriamiento por ventilacin de aire el
aire ambiente fro es impulsado hacia
los recipientes desde el exterior
ww Refrigeracin por agua sin soporte de
presin
Todos los sistemas de enfriamiento co-
mentados anteriormente tienen serias des-
ventajas en la esterilizacin de lquidos y
pueden conllevar peligro, si el proceso de
esterilizacin no se lleva a cabo de forma
adecuada, ya que este tipo de enfriamiento
requiere que el lquido se enfre pasando
por el punto de ebullicin.
1. Cuando los lquidos bullen durante la
fase de enfriamiento, se pierde parte
del lquido. La prdida de lquido suele
rondar entre el 3 y el 10%, pero puede
ser considerablemente superior, de-
pendiendo del contenido del lquido.
Especialmente, si el contenido de pro-
tenas del lquido es alto, ste tender
a hervir incluso ms, incrementando de
nuevo la perdida de lquido.
2. Como los lquidos deben hervir para
enfriarse, los botes slo podrn llenar-
se hasta la mitad o hasta una tercera
parte de ellos para prevenir la prdida
de lquido durante la ebullicin. Esto
conlleva, por una parte, una conside-
rable prdida en la productividad, ya
que el 50-70% de la capacidad de los
botes se pierde.
3. Por otra parte, seguramente no poda-
mos prevenir que los lquidos se de-
rramen por la ebullicin, y deberemos
limpiar el autoclave para evitar que
los lquidos, como por ejemplo aque-
llos hechos con Agar, se introduzcan
en el interior de la vlvula de drena-
je y la obstruyan cuando se enfren y
solidifiquen.
4. Los lquidos slo podrn hervir si estn
abiertos, por lo que los botes debern
estar abiertos o por lo menos ventila-
dos (tapa entre-abierta). Si nos olvida-
mos de ventilar los botes o lo hacemos
de forma indebida, el lquido no podr
hervir durante la fase de enfriamiento y
no se enfriarn. Una vez que el vaso de
Figuras 5 y 6. Ineficaz eliminacin del aire.
referencia haya alcanzado la temperatu-
ra de 80C y el autoclave nos permita
abrirlo, los vasos cerrados hermtica-
mente an conservarn la temperatura
de esterilizacin con su consiguiente
presin. Esto plantea un peligro consi-
derable, ya que estas botellas pueden
explotar durante la retirada del autocla-
ve y el lquido contenido en el mismo
puede evaporarse espontneamen-
tesimilar a una ebullicin retardada.
Recuerden que 1 litro de agua genera
1.000 litros de vapor.
Por ello se recomienda, al adquirir un au-
toclave, definir exactamente qu aplicacin
se utilizar y cmo debe estar equipado el
mismo con lo que respecta a la productivi-
dad y seguridad.
b) Enfriamiento por radiacin
(Enfriamiento rpido con soporte de
presin)
Tiene ventajas considerables en compa-
racin con la refrigeracin por evaporacin.
Durante el enfriamiento rpido con soporte
de presin, el recipiente se enfra a travs
de toda su superficie gracias a serpentines
de enfriamiento conectados externamente
con agua fra. Antes de que la refrigeracin
se active despus de la fase de esteriliza-
cin, el vapor del interior de los recipientes
a presin se sustituye por aire comprimido
filtrado estril. Este aire presurizado evita
de forma segura que el lquido llegue a
ebullicin durante la fase de enfriamiento.
El calor se transfiere desde el lquido a las
paredes fras del recipiente por medio de
radiacin, enfrindolas.
FARMESPAA INDUSTRIAL NOVIEMBRE/DICIEMBRE15 5
Figura 7. Vaciado completo.
El enfriamiento rpido con soporte de
presin supone una ganancia sustancial
en la productividad, ya que el tiempo del
proceso en comparacin con la auto-re-
frigeracin se reduce considerablemente.
Considerando que la auto-refrigeracin
requiere hasta 10 horas en un proceso
general de esterilizacin, el tiempo de en-
friamiento por enfriamiento rpido con so-
porte de presin puede reducirse hasta un
60% en funcin de la cantidad de lquidos
procesados.
Por otra parte, todos los peligros e incon-
venientes descritos en la refrigeracin por
evaporacin (ebullicin tarda, la prdida
de lquido, durante la ebullicin, sin refri-
geracin en el interior de los botes herm-
ticamente sellados) se eliminan de forma
fiable, ya que el lquido no hierve. Este tipo
de refrigeracin permite que las botellas
se llenen hasta su nivel mximo, ganando
productividad. Podr incluso utilizar bote-
llas hermticamente cerradas; luego abrir
o ventilar las botellas ya no ser necesario.
Optimizar an ms los ciclos
Los nuevos autoclaves permiten optimizar
an ms el enfriamiento de lquidos en
mdulos. Esto aumenta an ms la pro-
ductividad, e influye en la calidad de los
lquidos a esterilizar. Muchos de los lqui-
dos contienen ingredientes que no son
muy termoestables. Los lquidos deben
ser esterilizados, el tiempo, sin embargo,
que estarn expuestos al calor, debe ser
tan corto como sea posible de modo que
los componentes termolbiles no sufran
impactos negativos.
Mdulo 1 Ventilador radial
El ventilador radial genera una corriente
de aire en el interior de los recipientes del
autoclave durante la fase de enfriamiento.
Esta corriente de aire obliga al calor de
las paredes del recipiente a enfriarse por
enfriamiento rpido con presin de apoyo.
Este proceso acortar el tiempo de enfria-
miento hasta en un 70% en comparacin
con la auto-refrigeracin.
Mdulo 2 Ultracooler
(Ultraenfriamiento)
El ultracooler es un intercambiador adi-
cional de calor enfriando las paredes con
agua y est integrado directamente en el
interior del autoclave. Por medio de una
transferencia trmica mejorada sustancial-
mente, el tiempo de enfriamiento puede
esterilizacin
reducirse hasta en un 90% con respecto a
la auto-refrigeracin.
Esterilizacin de slidos y bolsas de
desechos
Cuando esterilizamos slidos (por ejemplo,
instrumentos, material de vidrio, puntas de
pipeta en cajas, filtros y textiles), as como
residuos en bolsas de destruccin hay que
asegurarse de que una atmsfera de vapor
se est construyendo exactamente sobre y
dentro del producto a esterilizar. Muchos
autoclaves no eliminan el aire de forma fia-
ble del autoclave y del producto. Si el aire
permanece dentro del autoclave y del pro-
ducto, el efecto de la esterilizacin no ser
posible, ya que slo el vapor transporta la
energa trmica requerida para desactivar
de forma fiable los microorganismos.
Eliminacin del aire ineficaz
Las ilustraciones 5 y 6 muestran una elimi-
nacin de aire ineficaz utilizando el ejem-
plo de una caja con puntas de pipeta y
bolsas de desecho. Si el autoclave se ca-
lienta simplemente, el aire se desplaza y
una atmsfera de vapor se acumula dentro
del recipiente del autoclave pero el aire
permanecer en el interior del producto a
esterilizar impidiendo que el vapor entre
donde se necesita su energa trmica para
conseguir un efecto esterilizante.
A la misma temperatura en forma de va-
por (por ejemplo, 121C), el aire contiene
slo una fraccin de la energa trmica re-
querida. Para productos que no pueden ser
esterilizados dentro de una atmsfera de
vapor, hay esterilizadores de aire caliente
sin embargo, se esterilizan a temperaturas
ms altas
(180250C) que requieren mucho ms
tiempo (hasta varias horas de esterilizacin).
El efecto de esterilizacin del aire a tempe-
raturas de 121C134C no est determina-
do en la praxis.
Eliminacin eficaz del aire
Para una eliminacin completa y reprodu-
cible del aire del autoclave y del produc-
to a esterilizar, deber llevarse a cabo un
pre-fraccionamiento del vaco. Por tanto,
el autoclave deber estar equipado con
un sistema de vaco. Durante la fase de
calentamiento, van teniendo lugar los ci-
clos de vaco para la eliminacin eficaz del
aire, seguido de inyecciones de vapor. Por
lo general, se aplica un triple fraccionado
de pre-vacodependiendo del producto,
sin embargo, podran ser necesarias ms
fracciones.
6 NOVIEMBRE/DICIEMBRE15 FARMESPAA INDUSTRIAL
EL TRBA 100
REGLAMENTO TCNICO
DE MATERIALES
BIOLGICOS DE
TRABAJOEXIGE QUE
EN LOS LABORATORIOS
DE NIVEL DE
SEGURIDAD S2 EL AIRE
DE ESCAPE DE UN
AUTOCLAVE DEBA SER
ENTENDIDO COMO
AIRE POSIBLEMENTE
CONTAMINADO
Secado de objetos slidos Superdry
(Supersecado)
Los slidos como se suelen colocar en el
interior de un horno de secado despus
del proceso de esterilizacin. Los nuevos
autoclaves permiten el secado de slidos
directamente despus del proceso de es-
terilizacin. Esterilizacin y secado en un
solo proceso. As, no sera necesario el
manejo de los materiales esterilizados, lo
que podra producir una re-contaminacin.
Esterilizacin de sustancias biolgicas
peligrosas
La esterilizacin de sustancias biolgi-
camente peligrosas es un reto especial.
Durante la fase de calentamiento, el aire
del interior del autoclave se sustituye con
vapor. El aire se desplaza del autoclave y
se libera a la habitacin donde est insta-
lado. El TRBA 100Reglamento Tcnico
de Materiales Biolgicos de Trabajoexige
que, en los laboratorios de Nivel de segu-
ridad S2, el aire de escape de un autoclave
debe ser entendido como aire posible-
mente contaminado por microorganismos
procedentes del producto esterilizado.
Debe utilizarse, pues, un proceso adecua-
do. En el caso de autoclaves, se utiliza ge-
neralmente la filtracin. Por tanto, el auto-
clave deber estar equipado con un filtro
de escape de aire. Todo el aire contami-
nado desplazado desde el autoclave pasa
al filtro siendo retenidos los microorganis-
mos en l. El filtro se esteriliza in-line
durante el proceso de esterilizacin para
desactivar los microorganismos retenidos
en el mismo.
La norma TRBA 100 hace referencia
slo al aire de escape liberado, pero no al
condensado recogido. Durante el proceso
de esterilizacin, el vapor se condensa en
el producto a esterilizar y se convierte de
nuevo en agua (condensado). Este agua
tambin puede estar contaminada por mi-
croorganismos. Por lo que el condensado
debe permanecer dentro del autoclave du-
rante el proceso de esterilizacin y tambin
debe ser esterilizado in line antes de ser
drenado.
Cualificacin y validacin
Durante la cualificacin se verifica si un
equipo es adecuado para el uso que se le
quiere dar as como el proceso a llevar a
cabo por ejemplo un proceso de esteri-
lizacin considerando el producto a ser
esterilizado con un resultado continuo (re-
producible). Generalmente, el proceso de
cualificacin se divide en 3 partes bsicas:
1. IQ Cualificacin de la instalacin:
verifica que el equipo ha sido fabri-
cado e instalado de acuerdo a sus
especificaciones.
2. OQ Cualificacin de la operacin:
verifica que el equipo trabaja gene-
ralmente de acuerdo a las funciones
especificadas.
3. PQ Cualificacin del Rendimiento: ve-
rifica que el dispositivo, con el produc-
to a tratar, funciona de acuerdo con las
especificaciones.
El objetivo de la cualificacin y validacin
es una prueba documentada de que un dis-
positivo es adecuado para su uso previsto.
El efecto del proceso de esterilizacin
en el autoclave se verifica durante la OQ
y PQ (con material a esterilizar) por medio
de data loggers externos de temperatura y
presin, as como usando bio-indicadores
basados en Bacilus Stearothermophilus.
Mientras que los data loggers (registrado-
res de datos) externos de temperatura y
presin proporcionan evidencia de que el
controlador del autoclave muestra y docu-
menta valores fiables as como de que ste
lleva a cabo la esterilizacin dentro de los
valores de tolerancia, los bio-indicadores
proporcionan evidencia de la eficiencia
biolgica.
Ensayos en Autoclaves segn Normas
de Farmacopea
Por ltimo, cabe destacar la necesaria flexi-
bilidad que se requiere en la configuracin
de los autoclaves para poder adaptarse al
cumplimiento de programas y test espec-
ficos como los dictados por las normas de
Farmacopea (ejemplos: 3.2.1 Recipientes
de vidrio para uso farmacutico, 3.2.9 cie-
rres de goma para recipientes de prepa-
raciones parenterales, polvos o liofilizados
en polvo, etc.)