- GUIA DE TCNICAS INMUNOLGICAS 2010 -

INDICE
1. Interaccin antgeno-anticuerpo Pgina 1
2. Interaccin Secundaria Ag-Ac Pgina 1
2.a. Reacciones de precipitacin Pgina 1
2.b. Tcnicas inmunolgicas basadas en reacciones de precipitacin. Pgina 2
Inmunodifusin Radial Pgina 2
Inmunoelectroforesis Pgina 2
2.c. Reacciones de aglutinacin Pgina 3
2.d. Concepto de ttulo Pgina 5
3. Interaccin primaria Ag-Ac Pgina 7
3.a. Inmunomarcacin Pgina 7
Inmunomarcacin con Acs conjugados a ENZIMAS Pgina 8
Inmunomarcacin con Acs conjugados a FLUOROCROMOS Pgina 8
Citometra de Flujo Pgina 9
3.b. Radioinmunoanlisis y Tcnicas radioinmunomtricas Pgina 12
3.c. ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay) Pgina 13
4. Otras tcnicas
4.a. Proteinograma electrofortico Pgina 14
4.b. Nefelometra Pgina 15
4.c. Western Blot Pgina 15
5. Tcnicas de tipificacin de antgenos de histocompatibilidad Pgina 16
5.a. Tcnicas serolgicas Pgina 17
5.b. Tcnicas moleculares Pgina 18
6. Cross match Pgina 22
7. Tcnicas inmunolgicas para estudiar la funcionalidad de los fagocitos Pgina 22
1. INTERACCIN ANTGENO-ANTICUERPO
La unin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) es una interaccin reversible en la que estn involucrados enlaces no-
covalentes. En la interaccin in vitro de un antgeno (Ag) con su correspondiente anticuerpo (Ac) se
distinguen dos etapas, la interaccin primaria no visualizable y la interaccin secundaria, que sigue a la
anterior y se caracteriza por la aparicin de un fenmeno visible como la aglutinacin o la precipitacin. Por
otro lado, no siempre que se produce la interaccin primaria Ag-Ac, se produce la interaccin secundaria, ya
que, para conseguir fenmenos visibles, son indispensables determinadas concentraciones y caractersticas
de los Ags y Acs.

2. INTERACCIN SECUNDARIA ANTIGENO-ANTICUERPO.

Las tcnicas inmunolgicas que evidencian la interaccin Ag-Ac a travs de una reaccin secundaria
(precipitacin o aglutinacin) son, generalmente, ms econmicas y sencillas que aquellas que permiten
visualizar la interaccin primaria (ver ms adelante).

2.a. Reacciones de precipitacin

Al mezclar cantidades suficientes de Ag soluble con Acs especficos, la interaccin Ag-Ac puede dar lugar a
una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esa red de la que hablamos, no es otra cosa que
grandes complejos inmunes (CI) formados por la interaccin Ag-Ac. Tal como se observa en la figura, cuando
se agregan concentraciones crecientes de Ag soluble a una cantidad fija de suero conteniendo Acs
especficos, a medida que la cantidad de Ag agregado aumenta, la cantidad de precipitado se incrementa
hasta alcanzar un mximo, luego del cual declina.
En un extremo de la curva de precipitacin, cuando se agregan pequeas cantidades de Ag, los CI se forman
en exceso de Ac. En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de Ag, los CI se forman en exceso de
Ag siendo pequeos y probablemente constituidos por una molcula de Ac y dos de Ag. Entre estas dos
situaciones extremas se encuentra la zona de equivalencia, en donde la relacin Ag-Ac permite la formacin
de grandes redes de CI que precipitan.

Exceso Equiva- Exceso

de Ac lencia de Ag

Cantidad de Ag agregado

La reaccin de precipitacin depende de la VALENCIA del Ac y del Ag. La valencia del Ac da idea del nmero
de sitios que posee para reconocer al Ag. De esta manera, un Ac bivalente posee dos sitios capaces de
reconocer al Ag. Del mismo modo, la valencia de un Ag nos habla del mximo nmero de epitopes que
posee. Para que se pueda producir la interaccin secundaria Ag-Ag con la consecuente formacin del
precipitado, tanto el Ag como el Ac deben ser, al menos, bivalentes.

1
 La asociacin entre Ac bivalentes y Ag
monovalentes (un nico epitope no repetido)
no permite la formacin de CI precipitantes.

La asociacin entre Ac bivalentes y Ag

multivalentes permite la formacin de CI
precipitantes. El Ag multivalente puede
presentar un slo epitope repetido o varios
epitopes distintos.

2.b. Tcnicas inmunolgicas basadas en reacciones de precipitacin.

1- Inmuno Difusin Radial (IDR)
Esta tcnica permite cuantificar de manera sencilla y econmica inmunoglobulinas de isotipo G, M y A o
antgenos solubles (C3, C4, transferrina, etc) presentes en muestras biolgicas. La tcnica se basa en la
difusin de la muestra conteniendo el antgeno a medir (inmunoglobulinas o antgenos solubles) en una
matriz semislida de agar en la que se encuentra disuelto el Ac especfico. La muestra biolgica se
introduce en los orificios cilndricos excavados en el agar y a medida que el antgeno difunde en forma
radial, se alcanza la relacin Ag-Ac que permite la formacin precipitados visibles. Una vez finalizada la
difusin se mide el radio (R) de los precipitados que es proporcional a la concentracin de antgeno
(C). La concentracin de protena en la muestra biolgica (Cx) se calcula realizando una curva de
calibracin utilizando muestras patrones de concentracin conocida.

Muestra Biolgica de Muestra patrn de concentracin conocida

concentracion desconocida (C)
(Cx) C1 C2 C3

Rx R1 R2
R3

Halo de R
2
precipitado
2
Rx
Curva de calibracin

C1 C2 Cx C3 Concentracin
de la muestra

2- Inmunoelectroforesis (IEF).
La inmunoelectroforesis es una tcnica cualitativa que permite la identificacin de diferentes componentes
proteicos presentes en distintas muestras biolgicas (suero, orina, etc) a travs de arcos de precipitacin.
La tcnica se realiza preferentemente en geles de agarosa y se distinguen dos etapas:

1) La muestras se someten a una separacin electrofortica.

2
 2) Terminada la electroforesis, las protenas interaccionan con los Acs especficos aplicados en el
agar en un canal paralelo al eje de migracin. Luego de un perodo de difusin de los Acs, se
observan arcos de precipitacin cuya forma y posicin dependen de las caractersticas
inmunoqumicas y de la concentracin de cada protena.

2.c. Reacciones de aglutinacin

Las reacciones de aglutinacin, tal como vimos para las reacciones de precipitacin, involucran una
interaccin secundaria entre Ag-Ac que llevar a la aparicin de un aglutinado que se visualiza como grumos.
Los principios fisicoqumicos que gobiernan la formacin de estos aglutinados son los mismos que gobiernan
la formacin de un precipitado. En otras palabras, los principios discutidos anteriormente acerca de la zona de
exceso de antgeno, la zona de equivalencia y la zona de exceso de anticuerpo, son vlidas y aplicables a las
reacciones de aglutinacin. La gran diferencia entre las reacciones de precipitacin y las reacciones de
aglutinacin son las caractersticas del antgeno: mientras que en las reacciones de precipitacin se emplean
antgenos solubles, en las reacciones de aglutinacin el Ag es particulado. Con un Ag soluble, tambin es
posible disear una reaccin de aglutinacin gracias a que es posible utilizar distintas partculas (partculas
inertes o glbulos rojos) y realizar un pegado qumico o fisicoqumico del Ag soluble a dichas partculas,
generando de esa manera un Ag particulado til para fines diagnsticos.
La ventajas de las reacciones de aglutinacin desde el punto de vista de su utilidad en el laboratorio es
que son muy sencillas de realizar, no requieren de ningn equipamiento para su lectura, son rpidas y fciles
de implementar. Adems, presentan una mayor sensibilidad que las reacciones de precipitacin por lo que las
3
han sustituido en muchos casos. Sin embargo, cabe mencionar, que las reacciones de aglutinacin presentan
una menor sensibilidad que las reacciones de interaccin primaria tales como ELISA e Inmunofluorescencia
indirecta (ver mas adelante). Esto hace que en determinados casos se prefiera el empleo de una de estas 2
tcnicas para la deteccin de Acs contra un determinado agente patgeno. Las ventajas enumeradas hacen
de las reacciones de aglutinacin una valiosa herramienta para diversos estudios serolgicos (bsqueda de
Acs especficos contra agentes patgenos) y para la deteccin de antgenos en fluidos biolgicos.

Tipos de reacciones de aglutinacin segn las caractersticas de las partculas aglutinantes:

De acuerdo a las caractersticas de las partculas aglutinantes, las reacciones de aglutinacin pueden
clasificarse en:
- reacciones de aglutinacin activa; o
- reacciones de aglutinacin pasiva.
Las reacciones de aglutinacin activa se basan en el empleo de la partcula aglutinante como antgeno.
Como ejemplos podemos mencionar:

Partcula aglutinante Reaccin Utilidad diagnstica

Glbulos rojos Determinacin de grupo sanguneo y factor
Rh
Glbulos rojos Coombs indirecta Determinacin de sensibilizacin por
incompatibilidad Rh
Glbulos rojos Coombs directa Determinacin de eritroblastosis fetal
Bacterias (Brucella) Huddleson Bsqueda de Ac anti-Brucella en sueros
humanos (banco de sangre)
Parsitos (Trypanosoma AD-Chagas Bsqueda de Ac anti-T. cruzi en sueros
cruzi) humanos (banco de sangre)
Parsitos (Toxoplasma AD-Toxo Bsqueda de Ac anti-T. gondii en sueros
gondii) humanos (banco de sangre)

Las reacciones de aglutinacin pasiva se basan en el empleo de una partcula aglutinante inerte a la cual
se la ha unido un antgeno. Como ejemplos podemos mencionar:

Partcula aglutinante Reaccin Utilidad diagnstica

Glbulos rojos + lisado HAI-Chagas Bsqueda de Ac anti-T. Cruzi en
de T. cruzi sueros humanos (banco de sangre)
Glbulos rojos + lisado HAI-Toxo Bsqueda de Ac anti-T. Gondii en
de T. gondii sueros humanos (banco de sangre)
Ltex + gp120 Bsqueda de Ac anti-VIH en sueros
humanos (banco de sangre)
Ltex + sHBV Bsqueda de Ac anti-HBV en sueros
humanos (banco de sangre)
Ltex + estreptolisina O ASTO Bsqueda de Ac anti-estreptolisina O
en sueros humanos (infeccin por
estreptococo -hemoltico)

Como se desprende de la tabla anterior, los soportes particulados para las reacciones de aglutinacin
indirecta pueden ser glbulos rojos (en este caso se habla en general de hemaglutinacin) o partculas de
ltex. El empleo de este tipo de partculas inertes ha permitido extender el rango de utilidad de la tcnica de
aglutinacin a la determinacin de Ac contra agentes infecciosos tales como el VIH o el HBV, e inclusive para
la determinacin de Ac contra molculas solubles (estreptolisina O, protena C reactiva, etc.).
Como paso indispensable para la preparacin de este tipo de reactivos, es necesaria una etapa de incubacin
entre la partcula inerte y el antgeno soluble sensibilizante (en general, los Ag sensibilizantes son protenas,
aunque es posible inmovilizar hidratos de carbono), que permitir el pegado del mismo a la partcula. Este
procedimiento puede realizarse por simple adsorcin (unin no covalente del Ag a la partcula) o por unin
covalente. En la mayora de los casos se requiere un acondicionamiento previo de la superficie de la
partcula. Para el caso de los glbulos rojos, esto se logra por incubacin con cido tnico (proceso
denominado tanado) o con CrCl3. Una vez realizado el pegado del Ag a la superficie del glbulo rojo, las
partculas pueden ser fijadas con agentes qumicos tales como el glutaraldehdo con el objeto de darles
4
mayor estabilidad en el tiempo y a los cambios de temperatura, lo que aumenta la vida til del reactivo
diagnstico.

Tipos de reacciones de aglutinacin pasiva segn la identidad de la especie pegada a las partculas
aglutinantes:
Considerando que es posible inmovilizar muchos tipos diferentes de protenas a distintos tipos de
partculas inertes, es posible clasificar las reacciones de aglutinacin pasiva en:
- reacciones de aglutinacin pasiva directa; o
- reacciones de aglutinacin pasiva reversa.
Las reacciones de aglutinacin directa se basan en la sensibilizacin de la partcula inerte con el Ag, por
lo que resultan tiles para la deteccin y titulacin de Ac en distintos fluidos biolgicos. Como ejemplos, basta
repasar la informacin brindada en la tabla anterior.
Por el contrario, las reacciones de aglutinacin reversa se basan en la inmovilizacin del Ac (en
general, se inmoviliza un anticuerpo monoclonal AcMo-) en la superficie de la partcula inerte, siendo este
tipo de reacciones particularmente tiles para la deteccin de Ag en distintas muestras biolgicas.

Aglutinacin pasiva

Particula inerte

Ag soluble

Ac especfico

DIRECTA REVERSA

2.d. Concepto de TTULO

Ya se mencion que las reacciones de aglutinacin directa son tiles para la deteccin y titulacin de
Ac en distintos fluidos biolgicos. Es importante destacar que NO es posible determinar la concentracin de
Ac sino que, en el mejor de los casos, ser posible calcular un ttulo de Ac. Para ello, se realiza la incubacin
de diluciones seriadas del suero del paciente con cantidades constantes de Ag y se elige arbitrariamente
como ttulo la inversa de la mxima dilucin de suero que produce aglutinacin visible. En determinadas
muestras en las que existe una gran cantidad de Ac es posible que a diluciones bajas (es decir, a altas
concentraciones de suero) no se observe aglutinacin. Este fenmeno se denomina efecto prozona y se
debe a que en exceso de Ac se forman preferentemente complejos Ag-Ac solubles (como los formados en la
zona de exceso de Ac en la curva de precipitacin). En este caso, el ttulo de Ac sigue siendo la mxima
dilucin de suero que produce aglutinacin visible.

Ag particulado:
cantidades constante

Suero:
Diluciones crecientes 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64

AGLUTINACION - + + + + -

TITULO: 32
Prozona

5
 Teniendo dos muestras de suero de un mismo paciente tomadas a diferentes tiempos, es posible
comparar mediante esta tcnica el ttulo de Acs en ambas muestras. Se denomina SEROCONVERSIN a la
aparicin de Acs o al aumento del ttulo de Acs en 4 veces en un periodo entre 3 y 4 semanas.

En el caso de reacciones de aglutinacin reversa, ser posible calcular una concentracin de Ag en

una muestra si se realiza en paralelo una curva de titulacin empleando una solucin estndar de Ag. Por
comparacin de la mxima dilucin de la solucin estndar que produce aglutinacin visible con la mxima
dilucin de la muestra que produce aglutinacin visible, se podr calcular la concentracin de Ag en la
muestra.
Existe adems una variante de la aglutinacin que permite calcular la concentracin de Ag en una
muestra. Dicha tcnica se denomina inhibicin de la hemaglutinacin y consiste en incubar cantidades
constantes de la partcula aglutinante sensibilizada con el Ag de inters (Ag particulado), con cantidades
constantes y aglutinantes del Ac especifico. A esta mezcla, capaz de aglutinar, se la enfrenta con cantidades
variables de Ag libre como competidor. A partir de una determinada concentracin de Ag libre, se producir
una inhibicin de la aglutinacin por competicin del Ag libre por el Ac (que de esta manera no podr unirse al
Ag particulado para aglutinar).

Inhibicin de la hemaglutinacin

Globulo rojo con Ag + Ac

(relacin aglutinante)

Sin Ag libre

Ag libre:
Diluciones crecientes 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32

AGLUTINACION + - - - + +

Si se realiza una curva de este tipo con una solucin estndar de Ag libre se podr calcular la concentracin
(micromolar, g/ml, etc) que inhibe la aglutinacin. Luego, determinando qu dilucin de Ag libre presente en
una muestra biolgica produce dicha inhibicin de la aglutinacin, ser posible calcular la concentracin de
Ag libre en la muestra problema.

Deteccin de IgG e IgM+IgG: reacciones de aglutinacin con y sin 2-mercaptoetanol (2-ME):

Varios reactivos diagnsticos actualmente disponibles en el mercado y en los laboratorios permiten

determinar si el ttulo de Ac obtenido en una reaccin de aglutinacin directa o indirecta corresponden a IgG o
a la suma de IgM ms IgG. Esto se debe a que ambos tipos de inmunoglobulinas son aglutinantes. Por otra
parte, en muchos casos es til conocer si el paciente posee Ac de tipo IgM o IgG porque eso puede facilitar el
seguimiento del paciente o determinar un tratamiento. Para ello, se ha desarrollado la tcnica de aglutinacin
en ausencia y en presencia de 2-ME. Cuando se realiza la titulacin del suero del paciente por aglutinacin en
ausencia de 2-ME y se informa un ttulo, en realidad se est informando una actividad aglutinante que es la
suma de la actividad aglutinante de la IgM y de la IgG. Si, siguiendo el protocolo provisto por el fabricante, se
realiza la tcnica en presencia de 2-ME produce una reduccin suave/parcial de la IgM. Como la IgM
monomrica resultante no es aglutinante, el ttulo que se obtiene al realizar la tcnica de aglutinacin en
presencia de 2-ME corresponder exclusivamente a la actividad aglutinante de la IgG. De este modo, la
realizacin de la aglutinacin en presencia y ausencia de 2-ME permitir determinar la presencia de IgG e IgM
contra el Ag sensibilizante. En determinados casos (toxoplasmosis) es importante determinar la presencia de
IgM porque es indicio de infeccin activa. La cada en el ttulo del suero por aglutinacin en ausencia vs. en
presencia de 2-ME es indicio de la presencia de IgM especfica para el parsito.

6
3. INTERACCIN PRIMARIA ANTGENO-ANTICUERPO
Si bien la interaccin primaria Ag-Ac no es visible, existen distintos mtodos que hacen posible visualizarla.
La estrategia consiste en "marcar" al Ac o al Ag mediante la unin covalente (conjugacin) de determinadas
molculas, tales como FLUOROCROMOS, ISOTOPOS RADIOACTIVOS o ENZIMAS, para poder hacer
visible esa primera interaccin. Tal como se observa en la Tabla, dependiendo del marcador que se utilice, la
tcnica inmunolgica recibe un determinado nombre y utiliza un sistema de deteccin diferente. Las tcnicas
que veremos a continuacin no son tan sencillas y econmicas como las que vimos anteriormente, sin
embargo son mucho mas sensibles, es decir, son capaces de detectar menores concentraciones de Ag o Ac.

Tcnica Inmunolgica MARCADOR Sistema de deteccin

a- Inmunomarcacin Enzima Microscopio ptico
Fluorocromo Microscopio de fluorescencia
Citmetro de Flujo
b- Radioinmunoanlisis (RIA) Istopo
Tcnicas radioinmunomtricas Radioactivo Contador de Radiacin
(PRIST, RAST)
c- ELISA Enzima Espectrofotmetro

3.a. INMUNOMARCACION
Las tcnicas de inmunomarcacin utilizando Ac conjugados permiten detectar la presencia de Ags en tejidos
(inmunohistoqumica) o clulas (inmunocitoqumica). La imunomarcacion de tejidos se realiza sobre cortes de
tejido fijado montado sobre un portaobjetos. A travs de estas tcnicas es posible detectar tanto Ags celulares
(de membrana, citoplasmticos o nucleares) como extracelulares (matriz extracelular, membrana basal, etc.)
La imunomarcacion de clulas puede efectuarse sobre clulas vivas o fijadas, las cuales pueden hallarse en
suspensin o adheridas a un soporte slido (portaobjetos). Esta tcnica permite detectar Ags localizados en la
membrana plasmatica, citoplasma o ncleo de la clula.

La inmunomarcacin DIRECTA es la forma mas simple de localizar un Ag y consiste en utilizar un Ac

"marcado" especfico para dicho Ag (Ac primario). Para realizar esta tcnica, se incuba la muestra con el Ac
primario "marcado" durante un determinado tiempo, a la temperatura indicada, luego del cual se retira el
exeso de Ac mediante un lavado y se procede a la deteccin de la marca.

INMUNOMARCACION DIRECTA

Ac marcado

Ag
Clula
portaobjetos

La inmunomarcacion INDIRECTA utiliza un Ac primario sin marcar que reconoce al Ag de inters y luego,
para evidenciar la presencia del Ag, emplea un segundo Ac marcado (Ac secundario) capaz de reconocer el
Ac primario. Por ejemplo, si el Ac primario es una IgG de ratn, el Ac secundario podr ser anti-IgG de ratn
hecho en conejo.

7
 INMUNOMARCACION INDIRECTA

Ac secundario marcado

Ac primario

Ag

Clula

portaobjetos

Para realizar esta tcnica, se incuba la muestra con el Ac primario, tal como vimos anteriormente, se realiza
un lavado para retirar el exeso de Ac y luego se incuba con el segundo Ac marcado. Posteriromente se
realiza un lavado y se procede a la deteccin de la marca.

Inmunomarcacin VENTAJAS DESVENTAJAS

Directa Rpida y sencilla.
Indirecta Mas sensible.
Un mismo Ac secundario
puede reconocer distintos Ac
primarios (generados en la
misma especie)
Se necesita un Ac primario marcado
para cada Ag a detectar (los Ac
marcados son ms caros que los Ac
no marcados .
Menos sensible.
Lleva mas tiempo.

Inmunomarcacin con Acs conjugados a ENZIMAS

Esta tcnica suele utilizarse para inmunohistoqumica y para detectar Ag sobre clulas adheridas a
portaobjetos. Una vez realizada la inmunomarcacin (directa o indirecta) la presencia del Ac conjugado con la
enzima se evidencia por el agregado de un sustrato incoloro. La accin de la enzima sobre el sustrato genera
un producto coloreado que precipita en el lugar donde ocurri la reaccin y es visualizado al microscopio
ptico. Los sustratos incoloros que viran a un producto coloreado se los conoce con el nombre de
cromgenos. El hecho de que existan distintos cromgenos capaces de generar productos de distinto color,
permite que puedan detectarse Ag diferentes en un mismo corte de tejido o clula.

Inmunomarcacin con Acs conjugados a FLUOROCROMOS

Esta tcnica es comnmente conocida como Inmunofluorescencia se utiliza tanto para imnunohistoqumica
como para imnunocitoqumica. La presencia del Ac conjugado con el flourocromo no necesita de ninguna
reaccin qumica para hacerse evidente. Los fluorocromos emiten luz de una determinada longitud de onda
luego de ser exitados por un haz de luz de longitud de onda menor. Cada fluorocromo es capaz de emitir luz
dentro de un determinado espectro de longitud de onda. Por ejemplo, el fluorocromo denominado
Isotiocianato de Fluoresceina (FITC) emite en la gama del verde, mientras que la Ficoeritrina emite en la
gama del rojo. El hecho de que existan distintos fluorocomos capaces de emitir a diferentes longitudes de
onda, permite que puedan detectarse Ag diferentes en un mismo corte de tejido o clula. La visualizacin de
la fluorescencia puede realizarse utilizando un microscopio de fluorescencia (para cortes de tejido o clulas
en portaobjetos) o por Citometra de flujo (para clulas en suspensin).

8
Citometra de flujo

La citometra de flujo (CMF) es un procedimiento altamente eficiente para caracterizar poblaciones celulares
que se encuentren en suspensin. En un principio, se utilizaba fundamentalmente para identificar el fenotipo
celular, es decir la expresin diferencial de antgenos en la membrana plasmtica, pero hoy da son muchos
los parmetros estructurales y funcionales que se pueden medir por CMF (Figura 1). Entre las muchas
ventajas que presenta en relacin a la microscopa de fluorescencia se encuentran la posibilidad de analizar
un nmero muy elevado de clulas en pocos segundos y la posibilidad de cuantificar la intensidad de
fluorescencia. La principal desventaja radica en el alto costo de la adquisicin y mantenimiento del citmetro
de flujo.

Figura 1:

La citometra de flujo se ha utilizado en biomedicina con diferentes objetivos:

En hematologa: contaje celular, frmula leucocitaria, contaje reticulocitario, anlisis de mdula sea.
En farmacologa: estudios de cintica celular.
En inmunologa: subpoblaciones de linfocitos, estimulacin linfocitaria.
En oncologa: diagnstico/pronstico, monitorizar tratamiento.
En microbiologa: diagnstico bacteriano y vrico, sensibilidad a antibiticos.

Citmetro de flujo:

Se define como citmetro de flujo al aparato que es capaz de medir componentes y propiedades de clulas y
organelas celulares (partculas biolgicas) que fluyen en una suspensin celular. Los cell sorters tienen las
mismas prestaciones y posibilidades que los citmetros de flujo pero con la capacidad adicional de separar
partculas selectivamente de la suspensin lquida.
Debido a las especiales caractersticas de los citmetros de flujo, la muestra a analizar debe encontrarse en
forma de suspensin monodispersa. Hay muestras como la sangre perifrica, mdula sea, u otros fluidos
biolgicos, que precisan de un mnimo procesamiento; en cambio los tumores slidos o las muestras
parafinadas necesitan de una disgregacin ms o menos intensa (mecnica, enzimtica, etc.).
Para su anlisis, las clulas en suspensin son forzadas a pasar, de a una por vez, a travs de un filamento
muy delgado. Un haz de rayo lser incide en cada clula lo que resulta en la dispersin de la luz en distintas
direcciones. Una serie de tubos fotomultiplicadores (FM) detectan la luz dispersada brindando informacin
acerca del tamao, la granularidad o complejidad celular, como as tambin de la emisin de fluorescencia en
el caso de que la clula haya unido un anticuerpo marcado con un fluorocromo.
A continuacin, se muestra un esquema de un citmetro de flujo:

9
 Clulas
marcadas con
Ac con Acs
fluorocromo fluorescentes
verde
Ac con
fluorocromo
rojo

FM para
fluorescencia verde

Corriente de flujo
con las clulas
pasando de a una
Computadora
FM para fluorescencia roja que analiza
los datos

FM para granularidad

FM para tamao

Anlisis y presentacin de los resultados:

Los datos de tamao celular, granularidad celular y fluorescencia (en caso de haberse usado anticuerpos
marcados con fluorocromos) son analizados mediante un software especfico y se presentan como grficos,
de los cuales se dan a continuacin los ejemplos ms comunes:

1) Grfico dot plot de tamao versus granularidad:

Leucocitos de sangre perifrica

Granularidad (SSC)

Neutrfilos

Monocitos

Linfocitos

Tamao celular (FSC)

Se muestra un ejemplo de leucocitos de sangre perifrica humana en el que se diferencian claramente las
regiones correspondientes a los neutrfilos (de mayor complejidad granular por la presencia de lisosomas),
monocitos (de complejidad intermedia, pero mayor tamao) y linfocitos (pequeos y sin grnulos en el
citoplasma). En este caso no se utiliz ningn anticuerpo para marcar las clulas.

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2) Histograma de fluorescencia:

Clulas no marcadas Clulas CD18

(control de isotipo) positivas
Nmero de clulas

CD18-FITC
fluorescencia verde (FL1)

Se muestra un ejemplo de clulas de estirpe monoctica marcadas con un anticuerpo monoclonal dirigido
contra el antgeno CD18. El anticuerpo est marcado con isocianato de fluorescena (FITC) (fluorescencia
verde) y es de isotipo IgG1 murino. Como control de pegado inespecfico, las clulas se incuban, por otro
lado, con IgG1 murina marcada con FITC pero que no est dirigida contra ningn antgeno celular (control de
isotipo).

3) Grfico dot plot de fluorescencia verde (FL1) versus fluorescencia roja (FL2):

Linfocitos T CD4+ y CD8 + de

sangre perifrica en un paciente
con leucemia de clulas B
CD8-PE

CD4-FITC
Se muestra un ejemplo de leucocitos de sangre perifrica de un paciente con leucemia linftica crnica de
clulas B que fueron marcados simultneamente con 2 anticuerpos: anti-CD4 marcado con FITC y anti-CD8
marcado con ficoeritrina (PE) (fluorescencia roja, FL2). Se distinguen 3 poblaciones: en el cuadrante superior
izquierdo se encuentran los linfocitos T CD8 positivos, en el cuadrante inferior derecho, los T CD4 positivos y
en el cuadrante inferior izquierdo las clulas que no expresan ni CD8 ni CD4 (linfocitos B, clulas NK). La
ausencia de puntos en el cuadrante superior derecho indica que no hay clulas que expresen
simultneamente CD4 y CD8. Si se hubiesen marcado clulas de timo, la mayora de los puntos se
encontraran en el cuadrante superior derecho.

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3.b. RADIOINMUNOANLISIS (RIA) Y TCNICAS RADIOINMUNOMTRICAS (PRIST, RAST)

La tcnica de radioimnunoanlisis (RIA) permite cuantificar la presencia de pequeas cantidades de un

determinado Ag o Ac en una muestra biolgica. Si bien es una tcnica sumante sensible, en la actualidad no
es tan utilizada como lo era antes y ha sido reemplazada por otras tcnicas que no utilizan radioistopos. La
tcnica se basa en la inhibicin competitiva de la unin de un Ag marcado radiactivamente con su Ac
especifico, por parte de Ags idnticos no marcados presentes en la muestra a analizar. Para realizar la
tcnica debe contarse de antemano con: 1) Acs especficos contra la molcula a cuantificar (esa molcula
puede ser un Ag o una inmunoglobulina), 2) la molcula a cuantificar marcada radioactivamente y 3) la
muestra a analizar (donde se encuentra la molcula a cuantificar).

Tal como puede verse en el esquema, los complejos inmunes formados por la molcula marcada (Ag
caliente) y el anticuerpo especfico se enfrentan a la muestra que posee la molcula sin marcar (Ag fro). Si la
concentracin de Ag fro es mayor, se producir el desplazamiento del Ag caliente y por lo tanto, la
radioactividad de los complejos Ag-Ac ir disminuyendo, mientras que la radioactividad de la fraccin de Ag
libre aumentar. Realizando una curva patrn con concentraciones conocidas de Ag libre puede calcularse,
luego, la concentracin de Ag en la muestra biolgica.

Radioinmunoanlisis (RIA)

Ag Ag
Ag-Ac Ag Ag Ag Ag-Ac Ag Ag Ag
Ag-Ac Ag Ag Ag-Ac Ag Ag
Ag-Ac + Ag Ag Ag Ag-Ac Ag Ag Ag
Ag-Ac Ag Ag-Ac Ag

Ag: antgeno caliente. Ac: anticuerpo especfico. Ag: antgeno fro.

Las tcnicas radioinmunomtricas permiten la deteccin de un Ag presente en una muestra mediante el

uso de anticuerpos conjugados a un isotopo radioactivo. No deben considerarse sinnimo de RIA ya que no
se basan en la inhibicin competitiva por desplazamiento del Ag caliente.
La tcnica de PRIST (Paper disk Radio ImmunoSorbent Test) es utilizada para medir los niveles de IgE en
sueros. La IgE srica est presente normalmente en bajas concentraciones y se encuentra aumentada, por
ejemplo, en pacientes alrgicos. Tal como se observa en la figura, se utiliza un soporte slido (disco de papel)
en el cual vienen adsorbidos los Ac anti-IgE (anticuerpos de captura). Los discos de papel se incuban con el
suero del paciente y los Ac IgE presentes en el suero se unirn con los Ac especficos del disco de papel.
Luego de la incubacin y lavado, se adiciona un Ac anti-IgE conjugado con un istopo radioactivo, el cual
reconocer a la IgE unida al anticuerpo de captura. Luego de la incubacin y lavado, se realiza la lectura de
radioactividad del disco de papel. Los resultados se comparan con aquellos obtenidos en una curva de
calibracin a fin de determinar la concentracin de IgE en el suero.

La tcnica de RAST (disk RadioAllergoSorbent Test) se utiliza para dosar los niveles de IgE especfica para
un alergeno en particular. El alergeno viene adsorbido a un disco de papel y luego se incuba el suero del
paciente alrgico. Si en el suero estn presentes las IgEs especficas quedarn unidas al alergeno y luego
podrn ser reconocidas por Acs anti-IgE conjugados con istopos radioactivos. Luego de la incubacin y
lavado, se realiza la lectura de radioactividad del disco de papel y los resultados se comparan con aquellos
obtenidos en una curva de calibracin a fin de determinar la concentracin de IgE especfica en el suero.

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 PRIST
Disco de papel con IgE presente en el
Ac.de captura anti-IgE suero del paciente
Acs anti-IgE marcado
radioactivamente

Agregado del suero del Agregado del Ac anti-IgE Lectura de

paciente marcado radioactivamente radioactividad

RAST
Disco de papel con IgE especfica
alergeno adsorbido presente en el suero
del paciente
Acs anti-IgE marcado
radioactivamente

Agregado del suero del Agregado del Ac anti-IgE Lectura de

paciente marcado radioactivamente radioactividad

3.c. ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay)

La tcnica de ELISA utiliza Acs marcados con una enzima (generalmente la peroxidasa) para poder visualizar
la reaccin Ag-Ac. La tcnica se utiliza tanto para la determinacin de Ags como de Acs.

Determinacin de Ag por ELISA

La modalidad ms frecuente del mtodo ELISA para la determinacin de Ags es el modelo ELISA "Sandwich"
directo. En este modelo, el Ac especfico para el Ag de inters, se encuentra adsorbido en un soporte slido
(placa de petri), sobre el que se aadir la muestra biolgica. En el caso de que en dicha muestra se
encuentre el Ag, quedar capturado en la placa y ser puesto en evidencia tras la adicin de otro Ac
especfico conjugado con la enzima. Por ltimo, se aade el substrato sustrato incoloro que, por accin de la
enzima, dar un producto coloreado que producir un color observable a simple vista y cuantificable mediante
un espectrofotmetro.

13
Determinacin de Acs por ELISA

Para la determinacin de Acs especficos para un determinado Ag se utiliza normalmente la modalidad de

ELISA indirecto en donde el Ag de inters se encuentra adsorbido en la placa de ELISA. Se pueden utilizar
como antgenos, protenas virales o bacterianas e incluso virus completos, pero cada da es ms frecuente
adsorber exclusivamente las protenas de inters inmunolgico. Esta es una de las tcnicas de eleccin para
buscar Acs contra protenas del virus HIV en sueros de pacientes. Los pasos de la tcnica se encuentran
esquematizados en la figura.

4. OTRAS TCNICAS INMUNOLGICAS

4.a PROTENOGRAMA ELECTROFORTICO

El protenograma electrofortico es un tcnica sencilla de laboratorio que permite separar en 5 fracciones o
grupos a las protenas presentes en un determinado fluido biolgico (suero, orina, etc.). La tcnica se basa en
la separacin electrofortica de las distintas protenas por medio de la aplicacin de un campo elctrico sobre
un soporte de agarosa o acetato de celulosa. Una vez finalizada la corrida electrofortica las bandas proteicas
pueden ser visualizadas luego de la utilizacin de colorantes para protenas. Posteriormente, las bandas que
se observan a simple vista (Figura A) pueden ser cuantificadas por un densitmetro, el cual cuantifica la
intensidad y anchura de cada banda (Figura B), pudiendo obtenerse los porcentajes de cada una de las 5
fracciones proteicas.

Las distintas fracciones que podemos encontrar son: Albumina, alfa 1 globulinas (1), alfa 2 globulinas
(2), beta globulinas () y gamma globulinas ().

ALBMINA: es una protena que se sintetiza en el hgado y es la de mayor concentracin en el suero.

1: dentro de esta fraccin se encuentran numerosas protenas entre las cuales podemos mencionar a la
alfa 1-antitripsina y la alfa 1-antiquimiotripsina
14
 2: dentro de esta fraccin se incluyen la haptoglobina y la protena C reactiva.
: en esta fraccin podemos encontrar, entre otras, a la fibronectina, transferrina y beta 2 microglobulina.
: en esta fraccin se encuentran las inmunoglobulinas, las cuales pueden disminuir en ciertas
inmunodeficiencias y aumentar en ciertos procesos de inflamacin crnica (artritis reumatoidea, lupus
eritematoso sistmico), infecciones y alergias.

4.b. NEFELOMETRIA.

Las inmunoglobulinas IgM, IgG e IgA tambin pueden cuantificarse por nefelometra. Para ello, el suero
incgnita deber ser incubado con exceso del anticuerpo especfico (anti-IgM, anti-IgG o anti-IgA) a fin de que
se produzca la formacin de complejos inmunes. Esta tcnica, es un mtodo ptico que cuantifica la luz
dispersada por los complejos inmunes formados, la cual es proporcional a la concentracin del antgeno
especfico (en nuestro caso, la IgM, IgG o IgA del suero incgnita).

4.c. WESTERN BLOT

Es una tcnica muy sensible que permite identificar Ags y Acs. Tal como puede observarse en la figura, la
tcnica de Western Blot se basa en la separacin electrofortica de protenas en geles de poliacrilamida, la
transferencia (blotting) de dichas protenas a un soporte slido (membrana de nitrocelulosa o nylon) y la
posterior deteccin de una o ms bandas identificadas por Acs especficos. La migracin de las protenas se
realiza en presencia de detergentes (Dodecil Sulfato de Sodio, SDS) a fin de que su migracin dependa
fundamentalmente de peso molecular (PM) de los pptidos.

As descripta, la tcnica permite investigar la presencia de un antgeno dado en una mezcla de protenas
presentes en una determinada muestra y para ello se debe disponer del Ac especfico para marcar la
membrana. Sin embargo, la tcnica de Western Blot es tambin muy til para la deteccin de Acs especficos
en sueros. Si se desea detectar Acs especficos, debe contarse con el Ag de inters separado por
electroforesis y transferido a una membrana, la cual se incubar con el suero a analizar. Posteriormente esa
membrana deber incubarse con el segundo anticuerpo marcado con la enzima para poder detectar las
bandas especficas.

La tcnica de Western Blot para determinar la especificidad de los Acs contra Ag del virus de HIV es la
prueba confirmatoria de eleccin para los casos en que los sueros de los pacientes dieron un ELISA positivo

15
 Protenas
con SDS

Direccin de
la migracin
Gel de
poliacrilamida

La membrana
posteriormente se marca
con los Acs especficos

Las protenas una vez

separadas por PM son
transferidas a una
membrana

Gel de poliacrilamida membrana

Lavado y
Agregado del agregado del
primer Ac Ac conjugado sustrato
a una enzima

Membrana con las protenas

transferidas

5. TCNICAS DE TIPIFICACIN DE ANTGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD

Objetivos:
1. Estudios de histocompatibilidad para transplante de rganos vascularizados
2. Estudios de histocompatibilidad para transplante de mdula sea
3. Estudios de paternidad
4. Estudios de asociacin de alelos del HLA con enfermedades (susceptibilidad)
5. Estudios antropolgicos para establecer posibles relaciones entre distintas poblaciones o grupos tnicos.

Clasificacin de las tcnicas de tipificacin

5.a. Tcnicas serolgicas: microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki
5.b. Tcnicas moleculares
a. PCR con cebadores especficos de secuencia (SSP)
b. PCR con cebadores especficos de locus e hibridizacin con sondas marcadas, especficas de
alelos (SSOP)
c. Secuenciacin directa (SBT)
d. Otras: RFLP, SSCP

16
5.a. TCNICAS SEROLGICAS:

Microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki

Fundamento:
Este mtodo se basa en el empleo de anticuerpos especficos contra diferentes alelos del HLA (molculas de
clase I y de clase II). Cuando estos anticuerpos reconocen al antgeno contra el cual son especficos, y en
presencia de complemento, se produce la lisis celular. El ensayo se realiza en placas plsticas de 60 fosas
denominadas placas de Terasaki y la muerte celular se cuantifica mediante una tincin diferencial de clulas
viables y muertas.
Etapas:
1. Extraccin de sangre del paciente
2. Aislamiento de clulas mononucleares (centrifugacin en gradiente de Ficoll)
3. Siembra de clulas en fosas de placas de Terasaki previamente sensibilizadas con sueros policlonales
contra diferentes alelos del HLA.
4. Incubacin (unin de los Ac a las molculas de clase I o de clase II del HLA)
5. Agregado de fuente de complemento (suero de conejo)
6. Incubacin y lisis de clulas que unieron Ac en la etapa anterior
7. Agregado de un colorante de contraste para diferenciacin de clulas vivas y muertas (diacetato de
fluorescena)
8. Observacin microscpica y clasificacin.

Esquema general de la tcnica

Variantes de la tcnica:
Mtodo de la anti-inmunoglobulina
1. Extraccin de sangre del paciente
2. Aislamiento de clulas mononucleares (centrifugacin en gradiente de Ficoll)
3. Siembra de clulas en fosas de placas de Terasaki*
4. Incubacin (unin de los Ac a las molculas de clase I del HLA)
5. Incubacin con IgG de conejo anti-inmunoglobulinas humanas
6. Agregado de fuente de complemento
7. Incubacin y lisis de clulas que unieron Ac
8. Agregado de un colorante de contraste para diferenciacin de clulas vivas y muertas (diacetato de
fluorescena)
9. Observacin microscpica y clasificacin o "scoring"
Consideraciones:
Origen de los sueros:
1. Suero de mujeres multparas (4 o ms hijos del mismo padre), dado que durante el parto se produce
pasaje de sangre del feto a la madre y eso permite que clulas fetales semialogeneicas acten como

17
 inmungenos en la madre, quien montar una respuesta inmune contra los alelos del HLA del padre que
las clulas fetales expresen.
2. Sueros de pacientes que hayan rechazado un transplante previo, donde en general se observa una
respuesta inmune humoral (y celular) dirigida contra los alelos del HLA que el transplante expresaba.
3. Sueros de pacientes politransfundidos, dado que en la sangre transfundida hay leucocitos de los
donantes, que actuarn como inmungenos en el paciente transfundido.

Ventajas:
Tcnica sencilla que requiere poco equipamiento sofisticado (microscopio invertido de epifluorescencia)
Desventajas:
La tcnica debe realizarse sin interrupcin desde su inicio hasta su finalizacin, dado que se trabaja con
clulas viables.
No se detectan Ac no fijadores de complemento, excepto en la variante que emplea la anti-inmunoglobulina
Alto costo
Baja resolucin
No existen sueros contra alelos poco frecuentes
La mayora de los sueros no son monoespecficos y adems presentan reactividad cruzada con otros alelos.
La alta homologa e identidad entre muchos epitopes de las molculas de clase I y de clase II del HLA permite
agrupar a estas molculas en "grupos de reactividad cruzada" o "CREGs"
No adecuado para tipificacin de donantes cadavricos (en especial en el caso de transplante de mdula
sea)
Interpretacin difcil por escasez de sueros monoespecficos y reactividades cruzadas
No se detecta homocigosis (en general se informa 1 alelo y el otro se informa como "blanco")
Ambigedades (no se pueden definir determinadas combinaciones de alelos)

5.b. TCNICAS MOLECULARES:

SSP
Fundamento:
En este mtodo se realiza una reaccin de cadena de polimerasa (PCR) utilizando como molde el ADN
extrado de clulas de sangre perifrica del paciente. Como oligonucletidos cebadores ("primers") se
emplean combinaciones de oligonucletidos especficos para diferentes alelos del HLA. De esta manera se
logra la amplificacin de fragmentos de ADN de diferente longitud. El patrn de fragmentos de ADN obtenido,
que se analiza en una electroforesis en gel de agarosa, permite asignar alelos a la muestra analizada. Esto
implica que para cada muestra se deben realizar un nmero considerable de reacciones de PCR (tantas
como pares de "primers" se estn empleando, lo que a su vez se reflejar en el grado de resolucin
alcanzado).

Etapas:
1. Extraccin de sangre del paciente
2. Aislamiento del ADN
3. Reaccin de cadena de polimerasa (PCR) con diferentes combinaciones de "primers"
4. Electroforesis en geles de agarosa conteniendo bromuro de etidio
5. Observacin del patrn de bandas de ADN amplificadas en la PCR bajo luz UV
6. Integracin de los resultados obtenidos
7. Asignacin de alelos a la muestra analizada

Esquema general de la tcnica

18
Consideraciones:
Ventajas:
Tcnica sencilla que requiere poco equipamiento sofisticado (mquina para PCR)
No requiere el aislamiento de clulas (se trabaja con sangre entera)
Resolucin mayor que las tcnicas serolgicas ("Resolucin intermedia", lo que significa que no se pueden
resolver determinadas combinaciones de alelos)
Costo relativamente bajo
Se puede interrumpir la tcnica en diversos pasos (luego de la extraccin del ADN, luego de la PCR o luego
de la electroforesis)
Permite la deteccin de alelos "nulos"

Desventajas:
No es adecuado para tipificacin de donantes cadavricos (en especial en el caso de transplante de mdula
sea) debido a que la resolucin alcanzada es intermedia
Ambigedades (no se pueden definir determinadas combinaciones de alelos)
Cada par de "primers" permite amplificar uno o unos pocos alelos del HLA, por lo que debido al elevado
polimorfismo de este sistema, ser necesario el empleo de un gran nmero de pares de "primers" con el fin de
obtener una resolucin aceptable en la asignacin de alelos a la muestra. Por lo tanto, cada muestra requiere
de un nmero elevado de reacciones de PCR (que se realizan en forma simultnea). De esta manera el
mtodo no resulta prctico para anlisis simultneo de un gran nmero de muestras.
No se detecta homocigosis.

SSOP

Fundamento:
En este mtodo se realiza una reaccin de cadena de polimerasa (PCR) utilizando como molde el ADN
extrado de clulas de sangre perifrica del paciente. Como oligonucletidos cebadores ("primers") se
emplean pares de oligonucletidos especficos para diferentes loci del HLA (se amplifica por separado el
locus HLA-A, el locus HLA-B, el locus HLA-C, etc). Los fragmentos de ADN amplificados son luego
inmovilizados sobre membranas de nylon e hibridizados con sondas (oligonucletidos) marcadas, especficas
para diferentes alelos del HLA. El patrn de seales obtenidas de acuerdo a las sondas que reaccionaron se
detecta con placas de autorradiografa, lo que permite asignar un alelo a la muestra analizada.

Etapas:
1. Extraccin de sangre del paciente
19
2. Aislamiento del ADN
3. Reaccin de cadena de polimerasa (PCR) con diferentes "primers" especficos para diferentes loci del
HLA
4. Electroforesis en geles de agarosa para chequear la calidad de la reaccin de PCR
5. Inmovilizacin de los productos de la PCR en membranas de nylon
6. Hibridizacin de las membranas con sondas especficas de alelos, marcadas con 32P
7. Exposicin de las membranas a placas de rayos X
8. Anlisis del patrn de seales obtenidas en las membranas
9. Integracin de los resultados obtenidos
10. Asignacin de alelos a la muestra analizada

Esquema general de la tcnica

Consideraciones:
Ventajas:
No requiere el aislamiento de clulas (se trabaja con sangre entera)
Alta resolucin
Se puede interrumpir la tcnica en diversos pasos
Empleando un nmero suficientemente alto de sondas, es posible detectar homocigosis
Adecuado para tipificacin de donantes cadavricos
Utilizando sondas marcadas con digoxigenina y anticuerpos anti-digoxigenina marcados con perioxidasa, se
puede realizar la deteccin por quimioluminiscencia, por lo que no se generan desechos radiactivos
Permite la deteccin de alelos "nulos"
Permite el anlisis simultneo de un nmero grande de muestras

Desventajas:
Interpretacin compleja (reactividad cruzada entre sondas, deteccin de determinadas combinaciones de
alelos producen patrones similares en las placas de autorradiografa)
Las condiciones de lavado de las diferentes sondas pueden ser diferentes, lo que complica en
procesamiento simultneo de muchas muestras
A pesar de su elevada resolucin, siguen existiendo ambigedades (aunque son muchas menos que en las
tcnicas anteriores)
Tcnica compleja y costosa que requiere equipamiento algo ms sofisticado (mquina para PCR, horno para
hibridizaciones, infraestructura para manipulacin de radioistopos)
Generacin de desechos radiactivos

SBT
Fundamento:
20
En este mtodo se realiza una reaccin en cadena de polimerasa (PCR) utilizando como molde el ADN
extrado de clulas de sangre perifrica del paciente. Como oligonucletidos cebadores ("primers") se
emplean pares de oligonucletidos especficos para diferentes loci del HLA (se amplifica por separado el
locus HLA-A, el locus HLA-B, el locus HLA-C, etc). Los fragmentos de ADN amplificados son luego
secuenciados directamente mediante el empleo de un secuenciador automtico de ADN, que adems analiza
las secuencias obtenidas y por comparacin con una base de datos interna, realiza la asignacin de alelos de
HLA a la muestra analizada.

Etapas:
1. Extraccin de sangre del paciente
2. Aislamiento del ADN
3. Reaccin de cadena de polimerasa (PCR) con diferentes "primers" especficos para diferentes loci del
HLA
4. Electroforesis en geles de agarosa para chequear la calidad de la reaccin de PCR
5. Realizacin de la reaccin de secuencia mediante el empleo de "primers" marcados con fluorocromos
adecuados para el tipo de detector que posee el secuenciador
6. Anlisis de las secuencias obtenidas
7. Comparacin con la base de datos de secuencias que posee el aparato e integracin de los resultados
obtenidos
8. Asignacin de alelos a la muestra analizada

Esquema general de la tcnica

Consideraciones:
Ventajas:
No requiere el aislamiento de clulas (se trabaja con sangre entera)
Alta resolucin (se alcanza el mximo de resolucin posible)
Se puede interrumpir la tcnica en diversos pasos
Ideal para la deteccin de homocigosis
ptimo para tipificacin de donantes cadavricos
Interpretacin automatizada
Permite la deteccin de alelos "nulos"
Desventajas:
Tcnica sofisticada que requiere equipamiento complejo y altamente costoso (secuenciador automtico de
ADN)
Elevado costo (todava)
Se puede analizar un nmero reducido de muestras simultneamente (dependiendo esto del tipo de detector
que posee el secuenciador)

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6. CROSS MATCH.

Objetivo:
Determinar la presencia de anticuerpos especficos contra alelos del HLA en suero de pacientes en lista de
espera para transplante de rganos slidos vascularizados.

Modalidades:
6.a. Cross-match final contra dador:
Tiene por objeto analizar la presencia de anticuerpos sricos dirigidos especficamente contra los alelos del
HLA de un posible donante. El anlisis de la presencia o ausencia de estos anticuerpos es fundamental para
decidir si el transplante se realiza o no. Esto se debe a que la presencia de este tipo de anticuerpos
preformados en el receptor de un transplante lleva inevitablemente a un rechazo hiperagudo.
Esta tcnica puede realizarse por microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki o citometra de flujo. En el
primer caso se enfrenta suero del receptor con clulas de sangre perifrica del posible donante (si es donante
vivo) o con clulas de bazo o ganglio linftico (si es donante cadavrico). Luego de una etapa de incubacin,
se agrega fuente de complemento y se prosigue con la tcnica tal como se describi en
"Microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki".
En el caso del cross-match final contra dador por citometra de flujo, se enfrentan clulas mononucleares de
sangre perifrica o de bazo o ganglio linftico del posible donante, con suero del receptor. Luego de una
incubacin, se revela el sistema con inmunoglobulinas de cabra o conejo anti-inmunoglobulinas humanas,
marcadas con fluorocromos (en general se emplea isotiocianato de fluorescena). Finalmente, se analizan las
clulas en un citmetro de flujo.

6.b. Cross-match contra panel:

Tiene por objeto analizar la presencia de anticuerpos sricos dirigidos contra diferentes alelos del HLA de un
posible donante. Esta tcnica suele realizarse por microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki, donde se
enfrenta suero del receptor con clulas de sangre perifrica del diferentes individuos cuyos alelos del HLA
sean representativos de la poblacin (en general de emplean 20 individuos heterocigotas de manera de cubrir
40 alelos de cada locus). Luego de una etapa de incubacin, se agrega fuente de complemento y se prosigue
con la tcnica tal como se describi en "Microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki". Mediante esta tcnica
se calcula el porcentaje de clulas que son lisadas en el ensayo, lo que es equivalente al nmero de alelos
contra los cuales el paciente posee Ac especficos, expresado como porcentaje respecto del nmero total de
alelos analizados en el ensayo. El parmetro calculado se denomina PRA ("panel reactive antibodies") y se ha
observado que existe una relacin entre el PRA y la probabilidad de xito o fracaso de un transplante renal.

7. TCNICAS INMUNOLGICAS PARA ESTUDIAR LA FUNCIONALIDAD DE LOS FAGOCITOS

7.a Ensayo de Reduccin del Nitroblue Tetrazolium (NBT)

Este ensayo evala la capacidad microbicida de determinadas clulas del sistema inmune a travs de la
conversin un compuesto qumico incoloro, el NBT, en un compuesto intensamente coloreado.
Para este ensayo se le extrae sangre al paciente y se realiza un procedimiento de separacin de las clulas
polimorfonucleares (en su mayora neutrfilos). A estas clulas se les agrega el NBT. Los neutrfilos tienen la
enzima NADPH Oxidasa que es capaz de generar intermediarios reactivos del oxgeno que atacan a los
microorganismos. Estos intermediarios reactivos del oxgeno son tambin los responsables de convertir al
NBT incoloro en un compuesto azul oscuro, llamado Formazn. Esto se visualiza observando los neutrfilos
del paciente en el microscopio para ver si stos tienen el compuesto azul oscuro.
Si los neutrfilos del paciente tienen alguna alteracin en el funcionamiento de la enzima NADPH Oxidasa (tal
como ocurre en aquellos que padecen enfermedad granulomatosa crnica) podrn ingerir bacterias pero no
destruirlas y, por lo tanto, no podrn inducir el cambio de color del NBT.
En un individuo sano, ms del 95% de los neutrfilos son capaces de reducir el NBT. En la mayora de los
pacientes con enfermedad granulomatosa crnica slo entre el 20% y el 80% de los neutrfilos son capaces
de reducir el NBT. En los casos donde la sospecha clnica de enfermedad granulomatosa crnica es alta se
deben realizar ensayos ms especficos del metabolismo oxidativo de los neutrfilos (oxidacin por parte de
los neutrfilos de colorantes que producen compuestos fluorescentes, etc).
El uso de la droga D-Penincilamina puede dar resultados anormales en el ensayo de reduccin del NBT, tal
como si se tratara de la enfermedad granulomatosa crnica.

22
7.b. Ensayo Microbicida
Este ensayo evala la funcin fagoctica de las clulas del sistema inmune. Requiere que estas clulas sean
capaces de fagocitar y de hacer el estallido respiratorio, dependiente de la enzima NADPH Oxidasa.
Para este ensayo se le extrae sangre al paciente y se realiza un procedimiento de separacin de las clulas
polimorfonucleares (en su mayora neutrfilos) o de monocitos. A estas clulas se les agregan bacterias
opsonizadas (Staphylococcus aureus), se incuba a 37C y se extraen muestras a intervalos de 30 minutos
durante 2 horas. Estas muestras son plaqueadas en agar sangre* e incubadas durante toda la noche a 37C.
Esto permite que las bacterias crezcan y formen colonias visibles. As, se cuenta el nmero de colonias para
cada tiempo de extraccin y se grafica el n de colonias vs tiempo. Es de esperar que a medida que el tiempo
de incubacin es mayor, el nmero de colonias sea menor porque las clulas del paciente fagocitan a las
bacterias y, por lo tanto, cada vez hay menos bacterias.

*El agar es un medio de cultivo nutritivo (parece gelatina). En particular, el agar sangre est enriquecido con sangre y sirve para
detectar ciertas bacterias como Staphylococcus aureus, que liberan exotoxinas llamadas hemolisinas que son capaces de lisar los
glbulos rojos.

% Muerte
Bacteriana

tiempo

23