Protemica: hacia
el entendimiento
del lenguaje de las protenas
Victoria Pando Robles y Csar Ferreira Batista
La revolucin en biologa molecular de los aos
80, ejemplificada por la facilidad con la que ac-
tualmente se realizan amplificaciones, clona-
ciones y secuenciacin automatizada de ADN,
ha permitido en corto tiempo conocer el geno-
ma completo de distintos organismos, incluido
el del ser humano (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/).
Actualmente disponemos de un listado to-
tal de genes que definen el genoma de una es-
pecie, conocemos la secuencia de nucletidos
de sus genes y, a partir de ellas, podemos infe-
rir con cierta confiabilidad las protenas que se
expresan a partir de ese genoma. Sin embargo,
este conocimiento no nos permite entender
la funcin biolgica del gen. Por ejemplo: por
qu el mono y el hombre son tan diferentes,
si comparten el 99% de su genoma? o qu
condiciones fisiolgicas cambian en una clu-
la en un cuadro de enfermedad? En resumen,
del anlisis de los proyectos genmicos se ha
aprendido que el nmero de genes contenido
en el genoma de un organismo no correlacio-
na con la complejidad del mismo y se infiere
que la complejidad morfolgica y funcional de
eucariotes superiores como el ser humano de-
pende de la regulacin de la expresin genti-
ca y de las interacciones entre sus protenas.
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Las protenas son molculas orgnicas
complejas, formadas por aminocidos ordena-
dos en largas hileras o cadenas polipeptdicas
mantenidas por enlaces qumicos entre el gru-
po amino (NH2) de un aminocido y el grupo
carboxilo (COOH) del siguiente aminocido. A
[b[Yjhe\eh[i_i
este tipo de enlace se denomina enlace pept-
YhecWje]hW\_W
97
dico. Se conoce que en la naturaleza existen 20
aminocidos, las posibilidades de ordenamien-
to de estos aminocidos en las protenas es
2020 (1x1026), es decir que la maquinaria celular
puede producir millones de pptidos diferen-
tes con slo 20 aminocidos, mientras que los
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4 nucletidos que conforman el ADN se orde-
nan en slo 256 posibilidades. Estos nmeros
evidencian la complejidad y variabilidad estruc-
tural que pueden presentar las protenas.
Las protenas se encuentran en todos los
YbkbWi
organismos, son las molculas biolgicas ms
j[`_Zei
abundantes; por ejemplo, en la bacteria E. coli
constituyen ms del 50% de su peso seco, mien-
\bk_ZeiY[bkbWh[i
tras que otras molculas como el ADN y el ARN
constituyen el 3% y el 20% respectivamente. Al
igual que otras macromolculas, como los ci-
dos nucleicos y los polisacridos (azcares), las
protenas son esenciales para el funcionamien-
to celular y, por ende, para la vida. Debido a su
heterogeneidad estructural, las protenas par-
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 98 | Protemica: hacia el entendimiento del lenguaje de las protenas
ticipan en diferentes procesos celulares; mu-
chas son enzimas que catalizan diferentes re-
acciones qumicas vitales para el metabolismo
celular, otras tienen un papel estructural, como
las protenas del citoesqueleto, que mantienen
la estructura y forma celular. Las protenas son
fundamentales en la comunicacin celular, va
transduccin de seales; en la respuesta in-
mune; en el mantenimiento de la homeostasis
celular y en el ciclo celular, ya que controlan y
realizan la replicacin de las molculas de ADN
permitiendo as que la informacin se conser-
ve de una generacin a otra. Las protenas son
tambin un componente necesario de la dieta,
ya que los animales no pueden sintetizar todos
sus aminocidos. Sin embargo, otros organis-
mos, como las plantas, pueden fabricar todos
los aminocidos por medio de la fotosntesis.
Las protenas son fabricadas en la clula a
partir de la informacin gentica codificada en
el ADN, de acuerdo con el dogma central de la
biologa molecular. Cada protena tiene su pro-
pia y nica secuencia de aminocidos, que es
especificada por la secuencia de nucletidos
del gen que la codifica. Los genes contenidos
en el ADN son primero transcritos en ARN por
una enzima denominada ARN polimerasa. La
informacin contenida en el ARN es interpre-
tada por una molcula transportadora de ami-
nocidos, conocida como ARN de transferencia,
y los ribosomas son los encargados de formar
la cadena polipeptdica que constituye la pro-
tena. Las protenas son sintetizadas del extre-
mo amino al extremo carboxilo . El mensaje
contenido en el ARN es ledo por la maquinaria
de sntesis protenica mediante un cdigo ge-
ntico universal que se que se lee en tripletes
o codones. Existen 64 codones que codifican
para los 20 aminocidos, por lo que algunos
aminocidos son codificados por ms de un co-
dn. Por ejemplo: los codones CCU, CUC, CUA,
CUG, UUA y UUG codifican para el aminocido
leucina. El cdigo gentico especifica la snte-
sis de 20 aminocidos, sin embargo, estos re-
siduos pueden ser alterados qumicamente
en la protena, a este evento se conoce como
modificacin postraduccional; stas se reali-
Biotecnologia V14 CS3.indd 98
zan en diferentes compartimentos celulares,
como citoplasma, ncleo, retculo endoplsmi-
co y aparato de Golgi. Las modificaciones post-
traduccionales son utilizadas en la clula como
un mecanismo de control, ya que stas sealan
la localizacin de las protenas y pueden alterar
su funcin. En los procariotes, como las bacte-
rias, el ARN se sintetiza en el citoplasma y pue-
de ser inmediatamente traducido en protenas,
mientras que en eucariotes, el ARN se sintetiza
en el ncleo y se transloca a travs de la mem-
brana nuclear en el citoplasma, lugar donde se
realiza la sntesis de protenas. La velocidad de
sntesis de protenas es ms rpida en bacte-
rias que en animales superiores; stas pueden
ensamblar 20 aminocidos por segundo. El ta-
mao de las protenas puede ser medido por el
nmero de aminocidos que contienen o por
su masa total, la cual es normalmente repor-
tada en unidades de masa atmica dalton. Un
dalton (da) equivale a 1/12 de la masa atmica
del 12C (carbono doce). Por ejemplo: las prote-
nas de la levadura tienen en promedio 466 a-a
de tamao y 53 Kda de masa. La protena de
mayor peso molecular conocida hasta ahora es
la titina, componente del sarcmero muscular,
tiene una masa de 3000 Kda y est formada
por una cadena de 27 000 aminocidos.
Protemica
El trmino proteoma fue acuado en 1994 para
definir a todas las protenas que son expresa-
das por un genoma en un tejido o en una clula.
El proteoma de un organismo es un elemento
altamente dinmico, ya que sus componentes
varan dependiendo del tejido, clula o compar-
timiento celular que se estudie y estos, a su vez,
pueden cambiar debido a alteraciones en su
ambiente, como situaciones de estrs, accin
de frmacos, requerimientos energticos, o su
estado fisiolgico (normal o patolgico). El cre-
cimiento en el nmero de proyectos de investi-
gacin orientados al estudio de los genomas de
forma sistemtica, ha dado lugar a la aparicin
de nuevas tecnologas a gran escala (tipo high
throughput) que, en el caso de las protenas,
11/14/07 5:00:24 PM
 Protemica: hacia el entendimiento del lenguaje de las protenas | 99
se denomina Protemica. Esta puede dividirse
en protemica de expresin, que tiene como ob-
jetivo la descripcin del proteoma total de un
tejido, fluido, tipo celular u organelo y las me-
diciones cuantitativas de los niveles de expre-
sin protenica, y protemica funcional, que se
encarga del estudio de la funcin de protenas
dentro de sistemas biolgicos (relaciona cam-
bios de expresin con una funcin determina-
da) y la regulacin de su expresin, incluyendo
las interacciones protenas-protena, protenas-
ADN, protenas-ARN y las modificaciones post-
traduccionales.
La diferencia principal entre genmica y
protemica, es que el genoma puede ser visto
como una coleccin de genes cuya naturaleza
es esttica; es decir, no cambia entre clula y
clula, mientras que el proteoma es una enti-
dad cambiante, es una coleccin dinmica de
protenas que difieren de un individuo a otro,
o de una clula a otra. Por ejemplo, se predice
que el nmero de protenas expresadas en el
ser humano va de 50 mil a 500 mil. Cmo pue-
de ser eso si el nmero de genes presentes en
nuestro genoma es de 25 mil? En primer lugar,
esto se debe a que los genes no necesariamente
expresan una sola protena, por procesamiento
diferencial de los transcritos de ARNm (madu-
racin y empalme alternativo) se pueden gene-
ran diversas protenas. Segundo, las protenas
presentan alrededor de 300 diferentes tipos de
modificaciones postraduccionales, incluyendo
fosforilacin, glicosilacin, acetilacin, deami-
nacin, miristolacin, entre otras (www.abrf.
org/index.cfm/dm.home). Estas modificacio-
nes pueden afectar la estructura, localizacin,
funcin y recambio, e implican funciones regu-
ladas por factores internos y externos a las c-
lulas, desencadenando procesos de expresin
gentica diferencial. Esta consiste en que, pese
a que todas las clulas de un individuo contie-
nen en su interior la misma informacin gen-
tica, se producen diferencias en la intensidad,
momento de la expresin, o en la informacin
expresada. Como resultado de estas variacio-
nes se produce la diferenciacin celular y pue-
den originarse determinadas patologas. Es as
Biotecnologia V14 CS3.indd 99
que el proteoma humano est definido por
muchos proteomas que son caractersticos de
tipos celulares especficos (como las clulas del
hgado) o que representan un estado fisiolgi-
co particular, normal o patolgico (el proteoma
de una persona con cncer gstrico, es distinto
al proteoma de un paciente con anemia, o al de
una persona sana).
Para que un nio empiece a leer, primero
debe aprender las letras, luego entender que el
orden de esas letras forma palabras y que las
palabras expresan ideas. Del mismo modo, los
investigadores primero descubrieron los nu-
cletidos, luego que el orden de esos nucle-
tidos forma un gen y que los genes codifican
protenas. Sin embargo, en la prctica primero
se pudo secuenciar a las protenas. En 1950, el
investigador sueco E. Edman desarroll un m-
todo que permite saber el orden de los amino-
cidos en una protena, a la que se conoce como
degradacin de Edman. Durante muchos aos
esta tcnica fue de vital importancia en la inves-
tigacin bioqumica. La secuenciacin parcial de
fragmentos protenicos y el ensamblaje de estas
secuencia permiti conocer en forma completa
la secuencia de aminocidos de algunas prote-
nas. En 1958 F. Sanger obtuvo el Premio Nbel
de Qumica debido a la secuenciacin completa
de la insulina, protena involucrada en el meta-
bolismo de la glucosa. Las secuencias parciales
obtenidas por Edman tambin permitieron co-
nocer los extremos amino terminal de muchas
protenas y a, partir de esta secuencia de ami-
nocidos, construir oligos de ADN que, median-
te la accin de la ADN polimerasa, permiten el
aislamiento del gene que codifica la protena.
Sin embargo, este mtodo de secuenciacin no
es compatible con los anlisis a gran escala que
dominan el campo de las ciencias genmicas.
Principalmente porque el nmero de aminoci-
dos secuenciados es limitado, en general no se
excede de 30-40 a-a secuenciados por muestra,
es lento (un ciclo/hora), lo que significa que para
secuenciar 30 a-a el equipo se demora 30 horas;
imagnense entonces secuenciar una protena
de 1000 aminocidos, o secuenciar y conocer el
proteoma de una clula!
11/14/07 5:00:24 PM
 100 | Protemica: hacia el entendimiento del lenguaje de las protenas
La posibilidad de identificar protenas en
forma global surge gracias a la modernizacin
de la espectrometra de masa (EM). En 1985,
J. Fenn y K. Tanaka desarrollaron los sistemas
de ionizacin de macromolculas ESI y MALDI
respectivamente, por lo que se les galardon
con el Premio Nbel de Qumica 2002. El m-
todo de ionizacin por electropulverizacin,
ESI (electrospray ionization), permite la ioni-
zacin de molculas a partir de flujos lqui-
dos bajo aplicacin de alto voltaje, mientras
que la ionizacin por el mtodo MALDI, pro-
duce iones por bombardeo con rayos lser de
muestras en estado slido auxiliado por ma-
trices cristalizables. Estas metodologas solu-
cionaron la dificultad de generar iones a partir
de analitos no voltiles, como las protenas y
polmeros. Desde entonces, la EM desplaz a
la secuenciacin de protenas por Edman, de-
bido a su sensibilidad (pmol-fmol), exactitud
(100-5 ppm) y rapidez (minutos-segundos);
esta vara de acuerdo a la complejidad del
anlisis y al equipo que se utilice. La espec-
trometra de masas permite la identificacin
de protenas, el conocimiento de su estructu-
ra primaria, es decir, la secuencia de los ami-
nocidos que la conforman, la identificacin
de sus modificaciones post-traduccionales, y
la cuantificacin de la expresin protenica
(protemica cuantitativa). Por otro lado, los
resultados obtenidos de la identificacin de
protenas de un genoma determinado han
permitido corregir datos genmicos. Los ge-
nes se predicen en un genoma mediante el
uso de tcnicas de bioinformtica basadas en
caractersticas comunes de miles de genes
analizados. Sin embargo, estas predicciones
no siempre son ciertas, sobre todo en genes
pequeos o en genes que no tienen homlo-
gos en otros genomas; por ejemplo, la tasa
de error en la anotacin de 340 genes del ge-
noma de Mycoplasma genitalum es del 8%, si
extrapolamos ese error en el genoma huma-
no, imagnense las consecuencias. Por otro
lado, es importante resaltar que la espectro-
metra de masas es una tcnica analtica con
mltiples usos; realiza la medicin de masas
Biotecnologia V14 CS3.indd 100
de diferentes molculas, permitiendo as la
identificacin de nucletidos, carbohidratos,
lpidos y polmeros sintticos.
Herramientas de la protemica
Desafortunadamente, las mismas caracte-
rsticas que otorgan a las protenas su papel
fundamental como molculas efectoras de la
funcin celular (diversidad qumica y estructu-
ral y abundancia relativa) tambin dificultan su
anlisis experimental. Actualmente no existe
un diagrama de flujo nico para el anlisis pro-
temico de una muestra, ya que las variables
como complejidad, mtodo de separacin, con-
centracin y estabilidad de las protenas, ade-
ms de la plataforma tecnolgica disponible
para su anlisis, y muy especialmente el tipo
de pregunta biolgica que se pretende abordar,
son los parmetros bsicos que determinan la
eleccin de una estrategia de estudio. Por lo
tanto, no existe una metodologa idnea para
el estudio de proteomas en forma sistemtica.
En consecuencia, la investigacin protemica
es el resultado de la aplicacin de un conjunto
de tcnicas que permiten el estudio de prote-
nas. A continuacin, se describir en forma re-
sumida una metodologa para el anlisis pro-
temico de una muestra (figura 1).
1) Separacin de las protenas. Una mues-
tra proveniente de un sistema biolgico es una
mezcla compleja de protenas. Por lo tanto, las
muestras provenientes de clulas, tejidos u
otro tipo de muestras biolgicas (sangre, orina,
leche, lquido cfalo-raqudeo, semen, saliva,
lgrimas, etc.) se separan principalmente por
tcnicas cromatogrficas y/o electroforticas,
las cuales son tecnologas robustas, verstiles
y con alta capacidad de resolucin. Las ms
utilizadas son: electroforesis unidimensional
(SDS-PAGE) y bidimensional (2-D PAGE), elec-
troforesis capilar, cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC), cromatografa de afinidad,
cromatografa de exclusin molecular y croma-
tografa de intercambio inico. La electrofore-
sis bidimensional, por ejemplo, permite la sepa-
racin de hasta 2000 protenas en un solo gel,
11/14/07 5:00:25 PM
 Protemica: hacia el entendimiento del lenguaje de las protenas | 101

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Figura 1.
Metodologa simplificada del anlisis protenico.

Biotecnologia V14 CS3.indd 101 11/14/07 5:00:25 PM

 102 | Protemica: hacia el entendimiento del lenguaje de las protenas
mientras que la electroforesis unidimensional
solamente 100. Estas tcnicas de aislamiento
pueden utilizarse separadamente, en conjunto
o en sistemas de flujo continuo, como la cro-
matografa multidimensional, tambin cono-
cida como MudPit (multidimensional protein
isolation technology), que contiene fase reversa
e intercambio inico en forma conjugada. La
tecnologa de cromatografa lquida acoplada
a los espectrmetros de masas (LC-MS, liquid
chromatography-mass spectrometry) es utiliza-
da para la separacin de pptidos provenientes
de protelisis enzimtica, pptidos sintticos o
pptidos nativos, por columnas de fase rever-
sa micro-capilares acoplado a sistemas de io-
nizacin tipo electrospray-MS. Esta tecnologa
permite la separacin de mezclas complejas de
pptidos y su anlisis simultaneo por espectro-
metra de masas. Este sistema es compatible
con columnas capilares tipo RPn y MudPit de na-
noflujo, que funcionan al mismo tiempo como
agujas de produccin de spray bajo la aplica-
cin de alto voltaje. En la actualidad, el sistema
LC-MS es una de las ms verstiles y poderosas
herramientas del anlisis protemico basado
en la espectrometra de masas.
2) Procesamiento de la muestra. El primer
paso es la reduccin de los puentes de disulfuro
y la alquilacin de las cistenas. Tiene como ob-
jetivo desnaturalizar las protenas permitiendo
que se expongan los sitios especficos de corte
enzimtico y, a la vez, se evita la formacin de
dmeros. Estas modificaciones qumicas son
fundamentales, ya que para el anlisis por EM
se requiere que las protenas sean digeridas
a pptidos con masas moleculares menores
que 3 KDa. Eso se debe a que las tecnologas
de fragmentacin de protenas en espectr-
metros de masas (para obtencin de secuen-
cias) an son limitadas y pptidos con mayores
masas moleculares producen informaciones
estructurales no interpretables. La muestra,
reducida y alquilada, generalmente se digiere
con tripsina (enzima que corta especficamen-
te en los C-terminales de lisina y arginina, ex-
cepto cuando stas son seguidas de prolina);
la eleccin de esta endoproteasa como enzima
Biotecnologia V14 CS3.indd 102
no es casual. En su mayora, los cortes trpticos
generan pptidos con masas moleculares en-
tre 1 y 2 KDa; permiten la diferenciacin entre
los amino cidos lisina y glutamina (128 Da), ya
que todas las lisinas estarn posicionadas en el
C-terminal de los pptidos trpticos, y propicia
la presencia de por lo menos dos cargas positi-
vas en el pptido (N-terminal y C-terminal con K
o R) que posibilitarn la transferencia de carga
a travs de las ligaciones amdicas facilitando
la fragmentacin. La descripcin del proceso
de reduccin, alquilacin y digestin enzimti-
ca de una protena para su anlisis por EM es
apenas uno de los tantos procedimientos que
pueden efectuarse en el anlisis protemico.
La identificacin de biomarcadores, determi-
nacin de modificaciones postraduccionales,
cuantificacin, identificacin de mezclas com-
plejas, entre otras aplicaciones, pueden involu-
crar decenas de metodologas diferentes para
el procesamiento de las muestras.
3) Anlisis por espectrometra de masas.
Este procedimiento involucra la ionizacin de
los componentes de la muestra en fase ga-
seosa, la separacin de las especies inicas re-
sultantes de acuerdo a la relacin de su masa
con su carga elctrica (m/z), utilizando campos
electromagnticos en el vaco. Los espectr-
metros de masas poseen tres componentes
bsicos: un sistema de ionizacin, un analiza-
dor de masas y un detector de iones (figura 2).
Hasta hace poco tiempo, solamente sustancias
de bajo peso molecular y relativamente vola-
tilizables podan ser sometidas a una ioniza-
cin en fase gaseosa, mientras que especies
moleculares de mayores tamaos, tales como
las protenas, no se mantenan disueltas a ni-
vel molecular en fase gaseosa. Sin embargo,
el desarrollo de sistemas de ionizacin suaves,
como ESI o MALDI, permitieron el anlisis de
macromolculas, por lo que hoy en da la EM
es la herramienta principal de la investigacin
protemica. Para fines prcticos, la diferencia
fundamental de los mtodos de ionizacin es
que el sistema MALDI utiliza muestras disuel-
tas en matrices slidas, mientras que el siste-
ma ESI utiliza muestras en fase lquida para la
11/14/07 5:00:26 PM
 Protemica: hacia el entendimiento del lenguaje de las protenas | 103
generacin de iones. Los analizadores de ma-
sas tienen mltiples funciones que varan de
acuerdo a su tecnologa; fundamentalmente se
refieren al control de los campos electromagn-
ticos aplicados, que involucra la separacin de
iones, la resolucin de cargas a nivel isotpico,
la fragmentacin y la capacidad de operacin
en polaridades diferentes. Los analizadores de
masas ms usados son: tiempo de vuelo o TOF
(time of flight), trampa de iones tridimensional
o trampa de Paul o IT (ion trap), trampa de io-
nes lineal o LIT (linear ion trap), quadropolo (Q),
triplecuadropolo y FT-ICR (Fourier transform ion
cyclotron ressonance). Actualmente, debido al
rpido desarrollo de la tecnologa en el campo
de la EM y de la protemica, existen espectr-
metros de masas que tienen ms de un anali-
zador de iones; stos se denominan espectr-
metros hbridos, como TOF-TOF, LIT-Orbitrap,
LIT-ETD, LIT-FT-ICR, Q-TOF, LIT-triple quadropolo,
etc. Estos equipos presentan mejor resolucin,
exactitud, sensibilidad y versatilidad en el an-
lisis de pptidos y protenas. Por ello, son utili-
zados para secuenciar y cuantificar protenas,
identificar modificaciones post-traduccionales
y, en general, en el estudio de muestras biol-
gicas complejas. Los detectores tienen como
funcin detectar el flujo inico liberado por el
analizador, amplificarlo y transmitir esta seal
a la computadora, donde se registra en forma
de un espectro de masas, los valores m/z que
indican la masa de los iones son dibujados en
el eje de las coordenadas mientras que la inten-
sidad de los mismos en el eje de las abscisas.
El espectro de masas evidencia el nmero de
componentes en la muestra y el peso molecu-
lar de cada componente.
4) Anlisis de datos. La interpretacin de los
espectros de masas constituye la parte ms di-
fcil de esta metodologa. En esta etapa, la ex-
periencia y la capacidad terica de dilucidacin
estructural del espectrometrista son funda-
mentales, ya que involucra la interdependen-
cia del conocimiento, de los procesos qumicos
y bioqumicos aplicados a las muestras de pro-
tenas, con el conocimiento de bioinformtica
para la bsqueda e identificacin de protenas
Biotecnologia V14 CS3.indd 103
en bancos de datos pblicos y privados, prin-
cipalmente porque ste se fundamenta en la
correlacin de valores y diferencias aritmticas
de unidades de masas atmicas con la estruc-
tura molecular de las protenas. Por lo tanto,
pese la formidable e indispensable capacidad
de procesamiento de datos que la informtica
nos ofrece, el chequeo manual e integracin
de los resultados obtenidos es una prctica
muy recomendable.
La identificacin de protenas a travs de
mapas peptdicos es la metodologa ms utili-
zada en los anlisis protemicos de los ltimos
aos, principalmente debido a que la secuencia
de una protena es nica y al ser cortada con
una endoproteasa origina un patrn peptdi-
co especfico. Los valores exactos del conjunto
de las masas moleculares de los pptidos es la
representacin nica de una determinada pro-
tena, ya que esta lista de masas moleculares
esta directamente relacionada con su estruc-
tura primaria. El espectro de masas evidencia
la relacin masa/carga (m/z) de los pptidos
analizados y se convierte en una huella digital
de la protena analizada (mass finger printing).
Esta lista de masas moleculares medidas por
espectrometra de masas, es sometida a los
programas de anlisis protemico (PROSPEC-
TOR, MASCOT, ALDENTE, etc.) para su compa-
racin con las diferentes protenas de las bases
de datos, las cules son digeridas in silico, ge-
nerando una lista de masas tericas. La com-
paracin entre el listado de masas experimen-
tales y tericas es calificada por algoritmos
especficos y a cada comparacin se le asigna
una calificacin. Dependiendo de la exactitud
y resolucin de cada instrumento, slo unos
cuantos pptidos son necesarios para la iden-
tificacin de la protena en las bases de datos.
Esta metodologa tiene el inconveniente que
las protenas sometidas para su identificacin
deben provenir de genomas secuenciados, de-
bido a que sta se realiza por comparacin de
masas moleculares donde uno o ms cambios
de aminocidos en su secuencia pueden origi-
nar resultados negativos. Otra manera de iden-
tificar protenas a travs de espectrometra de
11/14/07 5:00:26 PM
 104 | Protemica: hacia el entendimiento del lenguaje de las protenas
masas es mediante el anlisis de los espectros
de fragmentacin de uno o ms pptidos, los
cuales fueron generados por el corte de la pro-
tena con una endoproteasa. Con esta tcnica
se obtienen datos de secuencia, lo que implica
una identificacin inequvoca de la protena en
cuestin. Como mencionamos anteriormen-
te, una de las caractersticas tecnolgicas no-
tables de los espectrmetros de masas es la
capacidad de fragmentar ordenadamente los
pptidos en diferentes posiciones del enlace
peptdico. Con est tcnica se obtiene informa-
cin estructural de la protena que se est ana-
lizando ya que los aminocidos que conforman
la protena son secuenciados.
La fragmentacin de pptidos se realiza
por diferentes metodologas tipo CID (collision
induced dissociation), ETD (electron transfer dis-
sociation), PSD (post source decay), entre otras.
En la tipo CID se selecciona un in especfico
y se hace pasar por una celda de colisin que
contiene un gas inerte (argn, helio), el choque
con este gas induce la fragmentacin. En la
tcnica ETD, a los iones seleccionados se adi-
cionan electrones a travs de un donador, ge-
neralmente antraceno cargado, para producir
la fragmentacin. El PSD utiliza la fragmenta-
cin de iones metaestables durante el tiempo
de vuelo en TOFs con reflectron. Los iones hijos
generados por colisin son separados con base
a su relacin masa/carga (m/z) y registrados.
La fragmentacin de pptidos, segn la me-
todologa utilizada, origina un corte especfico
del enlace peptdico; consecuentemente, las
diferencias de masas moleculares entre los
iones generados es la representacin de cada
aminocido de la cadena polipeptdica, propor-
cionando de esta forma la secuencia del pp-
tido (figura 2). Mediante la fragmentacin de
pptidos se determina tambin la presencia de
modificaciones postraduccionales. La factibili-
dad de este anlisis depende del tipo de anali-
zador de iones que posea el espectrmetro de
masas.
Biotecnologia V14 CS3.indd 104
Lenguaje protenico
y funcionamiento celular
El funcionamiento celular depende de un com-
plejo juego de interacciones entre cientos de
diferentes biomolculas (ADN, ARN, protenas,
metabolitos, etc.), las cuales se encargan de
mantener la integridad, morfologa y funcio-
namiento. Como mencionamos anteriormen-
te, los genes almacenan la informacin para
las funciones bsicas de las protenas; sin em-
bargo, la dinmica celular de las protenas en
tiempo real, y la regulacin de la estructura
protenica y su funcin, se realiza debido a la
reversibilidad de las modificaciones postraduc-
cionales (MPTs) especficas presentes en estas
mleculas. Durante los ltimos aos las MPTs
han llamado la atencin de la comunidad cien-
tfica en las reas de la biologa y ciencias bio-
mdicas, ya que se ha descubierto una serie de
MPTs que antes no se conocan y que presen-
tan funciones vitales para la clula; por ejem-
plo, la sumoilacin, modificacin relacionada
con la regulacin transcripcional y el ciclo ce-
lular. Adems, se ha visto que estn presentes
en todas las especies, desde las bacterias hasta
el humano. Antes se consideraba que eran un
mecanismo de regulacin en organismos su-
periores principalmente. En general el estudio
de las MPTs se ha visto de manera reduccio-
nista, con la idea de que un sitio modificado
representa una funcin reguladora. Por ello y
por las limitaciones tecnolgicas, cada tipo de
modificacin ha sido estudiada en una deter-
minada protena, en un aminocido especfico
o en un nmero limitado de aminocidos. Sin
embargo, con el advenimiento de las ciencias
genmicas y las tcnicas de estudio a gran es-
cala, ahora es evidente que las modificaciones
qumicas en una determinada protena no slo
pueden mediar una funcin biolgica, sino
tambin funcionan para regular otras modi-
ficaciones que originan una funcin diferente
en la misma protena, o actuar en una sinfona
de interacciones moleculares para modular la
estabilidad e integridad de una poblacin de
protenas. Actualmente, la presencia de mlti-
ples sitios de fosforilacin se reconoce como
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un importante mecanismo de regulacin de la
localizacin de las protenas, de su actividad
funcional y de la atenuacin de las interac-
ciones protena-protena y protena-ligando;
aunque los detalles moleculares de este me-
canismo de regulacin siguen siendo objeto de
estudio. Uno de los aportes ms significativos
de la aplicacin de espectrometra de masas
en la biologa, ha sido la revelacin del cdigo
de las histonas, el cual regula la estructura y
funcin de los nucleosomas en la cromatina.
Este cdigo es un complejo mltiple de sitios
de modificacin, donde la histona puede pre-
sentar reacciones de metilacin, acetilacin,
fosforilacin y ubiquitinacin. Estas modifica-
ciones modulan la interaccin de las histonas
con los cidos nucleicos y con factores pro-
tenicos de regulacin durante la replicacin,
transcripcin y reparacin del ADN.
Un punto fundamental es el conocimien-
to de las modificaciones que ocurren en una
protena en un determinado tiempo, bajo de-
terminadas condiciones y cmo estas modifi-
caciones sealizan sus interacciones con otras
protenas. La marca de las MPTs se constituye
en un cdigo molecular que dicta la confor-
macin de protenas, su localizacin molecu-
lar, interacciones macromoleculares y activi-
dades, dependiendo del tipo de clula, tejido o
condiciones ambientales. Hoy en da, la meto-
dologa idnea para la identificacin de MPTs
es la espectrometra de masas. Sus resultados
permiten dilucidar los principios moleculares y
funcionales de la plasticidad de las protenas,
debido a la caracterizacin y cuantificacin
de las MPTs. Existen diferentes tcnicas para
estudiar las MPTs, tantas como la existencia
de modificaciones (recuerden que se ha re-
portado hasta la fecha alrededor de 300 MPTs
diferentes). En general, primero se separa y en-
riquece la poblacin de protenas que se quie-
re identificar, para posteriormente realizar su
caracterizacin molecular por espectrometra
de masas. Por ejemplo, en el caso de amino-
cidos fosforilados, se utilizan para su enrique-
cimiento columnas IMAC (Fe, Ga, TiO2, etc),
columnas de afinidad con anticuerpos espe-
Biotecnologia V14 CS3.indd 105
cficos o soportes slidos fosfoamidados para
el enriquecimiento de fosfopptidos. Para el
aislamiento de pptidos glicosilados, se utili-
zan lectinas o se generan de sitios especficos
de N-glicolisaciones por tratamiento con PN-
Gasas y agua pesada (H2O18), entre otros. Pos-
teriormente se define el sitio de modificacin
por espectrometra de masas.
Otro punto importante para dilucidar el
lenguaje protenico es la cuantificacin de
protenas presentes en un sistema biolgico
determinado en un momento particular. Esto
se debe, principalmente, a que diferentes es-
tudios demuestran que la regulacin celular
no est dada por la presencia o ausencia de
una o varias protenas, sino que puede ser
regulada por aumentos o disminuciones en
la concentracin de una poblacin determi-
nada de protenas. Por ejemplo: la transduc-
cin de seales intracelulares mediada por
receptores de cinasas de tirosina, tales como
el factor de crecimiento epidermal (EGF), fue
estudiada por protemica cuantitativa en c-
lulas HELA estimuladas con EGF, para identi-
ficar y cuantificar los fosfopptidos que cam-
bian su patrn de expresin en respuesta a la
estimulacin. Se encontraron 6600 sitios de
fosforilacin en tirosina en 2244 protenas;
el 40% de los sitos de fosforilacin son mo-
dulados al menos dos veces despus del est-
mulo con EGF y, sorprendentemente, la ma-
yora de protenas que tiene mltiples sitios
de fosforilacin muestran diferente cintica,
lo que sugiere que ellas sirven de plataforma
para integrar diferentes seales. Actualmen-
te, la nica metodologa que permite realizar
cuantificaciones a nivel molecular es la pro-
temica cuantitativa, que bsicamente se
realiza por dos procedimientos: 1) el marcaje
de protenas con fluorforos Cy, seguido de la
separacin y anlisis de geles con el sistema
DIGE (diference gel electrophoresis), finalizan-
do con la identificacin de protenas por EM,
y 2) mediante la incorporacin de istopos
estables en cultivos celulares (marcaje me-
tablico) o reactivos qumicos con diferentes
istopos que marcan las protenas para su
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posterior anlisis por espectrometra de ma-
sas. Estas tcnicas son: ICAT (isotope-coded
affinity tags), SILAC (stable isotope labeling
with amino acids in cell cultura), iTRAQ (iso-
baric tags for relative and absolute quantifi-
cation) y AQUA (absolute quantification), las
cuales citamos a modo de referencia.
Finalmente, un elemento indispensable
para el entendimiento de la funcin de las
protenas es el conocimiento de su estructura
tridimensional. Sin embargo, pese al desarrollo
de la bioinformtica que permite la construc-
cin de modelos estructurales in silico basado
en homlogos estructurales, existe un gran
nmero de protenas con estructura tridimen-
sionales no resueltas, como es el caso de las
protenas de membrana que representan un
tercio del proteoma humano. Por esta razn,
actualmente la comunidad cientfica inter-
nacional y las compaas de alta tecnologa
tienen como reto la integracin de metodolo-
gas complejas y laboriosas como la difraccin
de rayos X y la resonancia magntica nuclear
(RMN) al estudio de protenas a gran escala.
La posibilidad de integracin de estas tecno-
logas no parece un proyecto a largo plazo, ya
que los espectrmetros de masas hbridos,
como los FT-ICR, utilizan sper magnetos para
el anlisis de protenas con alta exactitud,
acercndose de esta forma a la resolucin de
los equipos de RMN.
La Unidad de Protemica (UPRO)
del Instituto de Biotecnologa
de la UNAM
La bsqueda de respuestas para preguntas
biolgicas complejas est directamente rela-
cionada con el dominio, la aplicacin y la dispo-
nibilidad de alta tecnologa. En este sentido, la
creacin de unidades de servicio especializadas,
a nivel regional o nacional, parece ser la mejor
alternativa para la investigacin cientfica y
tecnolgica en pases en desarrollo. Las unida-
des de protemica: a) son entidades tcnica y
operacionalmente elaboradas, b) por su natu-
Biotecnologia V14 CS3.indd 106
raleza requieren grandes inversiones finan-
cieras, c) toman un tiempo razonable para su
establecimiento y d) exigen recursos humanos
altamente capacitados.
Dada la relevancia de las unidades de servi-
cio en protemica, tanto para la investigacin
bsica como para la investigacin biotecnol-
gica, la comunidad de investigadores del Insti-
tuto de Biotecnologa decidi la creacin de la
Unidad de Protemica (UPRO-IBT) en junio de
2005. Esta unidad tiene como objetivo ofrecer
servicios de anlisis protemico basados en la
espectrometra de masas macromolecular. La
UPRO es la primera y nica unidad de servicios
en su gnero a nivel nacional. Durante 2006 se
analizaron ms de ochocientos muestras de
protenas para instituciones de investigacin
pblica y privada, as como para compaas par-
ticulares. Los servicios prestados por la UPRO
incluyen determinacin de masas moleculares
de protenas y pptidos, identificacin de pro-
tenas por MALDI-TOF y ESI-MS/MS, secuencia-
cin parcial de protenas desconocidas, deter-
minacin de modificaciones postraduccionales,
determinacin de sitios de corte especficos de
nuevas enzimas e identificacin de modifica-
ciones sintticas en protenas. Adicionalmente,
la UPRO es un centro protemico de referencia
a nivel nacional debido a la formacin de recur-
sos humanos (tcnicos y de posgrado), al apoyo
brindado a otros laboratorios de protemica y a
su empeo en promover y desarrollar la inves-
tigacin protemica en Mxico (http://www.
smp.org.mx). El significativo aumento de solici-
tudes de servicio es consecuencia del creciente
inters de la comunidad cientfica nacional e
internacional en dilucidar a nivel cualitativo y
cuantitativo la expresin gentica de los orga-
nismos, y especialmente la expresin diferen-
cial de protenas debida a distintas enfermeda-
des, estrs u otras alteraciones fsicoqumicas
impuestas a los sistemas biolgicos. La UPRO
mantiene un esfuerzo constante por mejorar
su plataforma analtica y, de esta forma, ofrecer
servicios de primer nivel al creciente nmero de
usuarios.
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 Protemica: hacia el entendimiento del lenguaje de las protenas | 107

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c%p

Figura 2.
Tpico espectro de fragmentacin por CID. El espectro se
obtuvo en un espectrmetro de masas LC-MS (ionizacin
ESI y analizador trampa de iones tridimensional). El in
precursor de 1363.4 Da (z=1+) se dividi en fragmentos de
la serie b (azul) y de la serie y (rojo). Se muestra la secuen-
cia de aminocidos del in precursor, la cual al ser someti-
da al programa BLAST, resulta en la secuencia de la toxina
Tc54 del alacrn Tityus cambridgei.

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 108 | Protemica: hacia el entendimiento del lenguaje de las protenas

Bibliografa
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Siusdak, G., Mass spectrometry in biotechnology, MCC Press,
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